本发明涉及通过选择性扩增具有b4同种异型的抗体而以同种异型特异性的方式生产兔单克隆抗体的方法。本发明进一步涉及引物及其组合物的用途。
背景技术：
：：由于兔抗体库固有地能够识别不同于小鼠抗体中所见的抗原表位，所以兔单克隆抗体具有作为诊断和研究试剂的价值(1-3)，此外，兔抗体通常展现出更高的结合亲和性，使得它们成为用于治疗研发的合适的候选物。兔骨髓瘤细胞系(兔融合伙伴)的研发可以高效地生成用于生产针对多种靶物的单克隆抗体的兔杂交瘤(4-6)。然而，许多此类杂交瘤实际上产生2种抗体，一种得自融合伙伴(“内源”抗体)，另一种得自融合的b细胞(“单克隆抗体”)。在许多情况下，内源抗体的量远超过单克隆抗体的量，这将使得高效地克隆编码所需的单克隆抗体的序列即使不是不可能，也是很困难的。us7429487描述了一种方法，其中缺乏内源性重链的兔衍生的永生b淋巴细胞与b淋巴细胞融合，从而产生表达抗体的杂交瘤，所述的抗体具有衍生自产生抗体的脾b细胞(而不是永生细胞)的重链。与小鼠和人类相比，兔抗体是稍微简化的，并且兔igg没有亚类，由2条重链和2条轻链组成。在70至90％的b细胞中，兔重链是vha+同种异型。在试验室菌株中，vh1的3个等位基因vh1a1,vh1a2和vh1a3分别编码同种异型a1,a2和a3。血清和粘膜中的其他10至30％igg被称为vha阴性(vha-)，这是因为它们不能与任何抗-vha同种异型抗血清反应。大部分(90％至95％)的兔轻链衍生自cκ1(同种型κ1)。5个等位基因cκ1称为cκ同种异型b4,b4v,b5,b6和b9。编码同种型κ2的cκ2基因较少表达，除一些b9兔以外。总igg轻链的仅5至10％是同种型λ。兔免疫球蛋白基因的总体复杂性、体细胞重排、超突变以及其他的序列改变是指即使兔单个轻链κ序列即便属于给定的同种异型，它们也可以显著变化。这种变化、再结合不同同种异型的序列彼此非常相似的事实，可以使得在以牺牲另一条κ链同种异型为代价的条件下一致地扩增一条κ链同种异型的序列具有挑战，特别是在希望扩增的靶抗体的序列并不知晓时。因此，不断需要研发新的方法，其能够改善由兔杂交瘤产生的抗体的品质，并避免产生由兔融合伙伴衍生的抗体。本发明的一个目的是提供在us7429487中所述的方法的备选方法。本发明提供了在以牺牲由融合伙伴(具有b5同种异型)衍生的抗体为代价的条件下优先扩增和分离b4同种异型抗体的方法。发明概述本申请人发现可以使用4碱基基序的核酸引物而一致性地区分兔κ轻链的同种异型b4和b5，其中所述的引物接近于这些基因的终止密码子。所述的基序以及其靠近终止密码子使得可以设计区分性的反向引物(discriminatoryreverseprimer)，当该引物与合适的正向引物组合使用时，可以一致地扩增全长的b4κ轻链序列，即使在包含b5κ轻链序列的样品中也是如此。所述的引物可以用于例如生产重组抗体的方法中，其中在此类方法中，来自就b4同种异型而言纯合的兔的b细胞与具有除b4以外的同种异型(例如b5)的兔骨髓瘤细胞或其衍生物(例如240e细胞)融合，从而产生表达全长序列的杂交瘤，该全长序列编码可以被选择性扩增的单克隆抗体的κ轻链。扩增的序列可以被克隆至表达载体中，从而有助于重组抗体的表达，然后可以将该抗体纯化。根据本发明的第一个方面，提供了一种用于生产重组抗体的方法，该方法包括以下步骤：a)提供兔的产生抗体的b淋巴细胞，其具有b4同种异型；b)将步骤a)的b淋巴细胞与具有不同于b4的同种异型的兔融合伙伴或其衍生物融合，从而生产能够产生抗体的杂交瘤细胞；c)由所述的杂交瘤分离cdna；d)使用以下物质，由步骤c)的cdna扩增重链可变结构域和轻链：(i)轻链引物对，其包含具有根据seqidno:1的序列的3’末端的正向引物，以及具有根据seqidno:2的序列的3’末端的反向引物，以及(ii)重链引物对，其包含具有根据seqidno:3的序列的3’末端的正向引物，以及具有根据seqidno:4的序列的3’末端的反向引物；e)将在步骤d)中得到的扩增的重链结构域和轻链克隆至一个或多个质粒中；f)将所述的质粒转染至能够表达抗体的哺乳动物宿主细胞中；g)在适于抗体生产的条件下培养所述哺乳动物宿主细胞；h)分离在步骤g)中生产的抗体。根据另一个方面，提供了根据的seqidno:11的分离的(合成的、重组的)核酸分子。根据另一个方面，提供了分离的合成核酸分子在生产由具有b4同种异型的兔衍生的重组抗体中的用途，其中所述的核酸分子具有根据seqidno:11的序列的3’末端。根据本发明的另一个方面，提供了用于扩增由具有b4同种异型的兔衍生的重链和轻链抗体结构域的组合物，该组合物包含引物对，其中一个引物具有根据seqidno:11的序列的3’末端。附图简述技术人员应该理解的是下文所述的附图仅是为了说明。附图无意于以任何方式限定本教导的范围。图1示出示例性b4κ轻链cdna序列(seqidno:10)的5’末端与具有序列atggacacgagggcccccac(seqidno:1)的3’末端的正向引物的比对。所编码的氨基酸序列为seqidno:13。图2示出示例性b4κ轻链cdna序列(seqidno:14)的3’末端与具有序列ctaacagtcx(seqidno:2)的3’末端的反向引物的比对，其中x为a,ac,acc或accc。所编码的氨基酸序列为seqidno:15。图3示出由本发明的方法(序列(seqidno:6)的正向引物和序列(seqidno:7)的反向引物)在44种不同的杂交瘤上得到的全长轻链扩增子进行的琼脂糖凝胶电泳。如4示出由240e-w融合伙伴衍生的杂交瘤细胞系的小图，其中所述的融合伙伴表达可变量的内源ig重链。由240e-w衍生的杂交瘤系分泌内源性的ig重链和轻链。通过western印迹，使用山羊抗兔igg抗体来分析由6种不同兔杂交瘤系分泌的igg蛋白质。在大约50kda处的蛋白质条带相当于ig重链，在大约25kda处的条带相当于igκ轻链。各个克隆产生大小稍微可变的脾衍生的轻链(脾-l链，下方的条带)以及大小恒定的240e-w衍生的轻链(内源-l链，上方的条带)。发明详述对于本领域的那些技术人员在阅读本发明公开时显而易见的是，本文所述并且示出的单个实施方案的每一个均具有分开的成分和特征，这些成分和特征在不脱离本发明教导的范围或精神的条件下可以容易地与其他多个实施方案的任意一个的特征分开或者结合。任何所述的方法可以以所述事件的顺序或者以逻辑上可行的任何其他顺序实施。根据本发明的第一个方面，提供了用于生产重组抗体的方法，该方法包括以下步骤：a)提供兔的产生抗体的b淋巴细胞，其具有b4同种异型；b)将步骤a)的b淋巴细胞与兔融合伙伴或其衍生物融合，从而生产能够产生抗体的杂交瘤细胞，其中所述的融合伙伴或其衍生物具有不同于b4的同种异型；c)由所述的杂交瘤分离cdna；d)使用以下物质，由步骤c)的cdna扩增重链可变结构域和轻链：(i)轻链引物对，其包含具有根据seqidno:1的序列的3’末端的正向引物，以及具有根据seqidno:2的序列的3’末端的反向引物，以及(ii)重链引物对，其包含具有根据seqidno:3的序列的3’末端的正向引物，以及具有根据seqidno:4的序列的3’末端的反向引物；e)将在步骤d)中得到的扩增的重链结构域和轻链克隆至一个或多个质粒中；f)将所述的质粒转染至能够表达抗体的哺乳动物宿主细胞中；g)在适于抗体生产的条件下培养所述哺乳动物宿主细胞；h)分离在步骤g)中生产的抗体。所述的方法进一步包括i)纯化在步骤h)中获得的抗体的可任选的步骤。在所述的方法中使用的兔融合伙伴可以为具有b5同种异型的240e细胞或其衍生物。轻链正向引物、轻链反向引物、重链正向引物和重链反向引物可以进一步包含限制性位点。所述的方法可以使用具有根据seqidno:6的序列的3’末端的轻链正向引物，具有根据seqidno:7的序列的3’末端的轻链反向引物，具有根据seqidno:8的序列的3’末端的重链正向引物，以及具有根据seqidno:9的序列的3’末端的重链反向引物。重链和轻链可以通过多重pcr在同一反应中扩增。重链和轻链可以克隆至分开的质粒中。本文所述的方法基于新的引物，所述引物被设计成能使得b4同种异型抗体优于b5同种异型抗体而被优先地表达，进一步生成杂交瘤。这提供了以直接且高效的方式选择性生产所需抗体的新方法，由此避免了额外的选择和纯化步骤。所述的方法的其他优点是减少了被“内源b5”的污染，其可以导致igg功能障碍。所述的方法提供了全长抗体的生产。本文中，提到“全长”是指包含编码多肽的dna序列的起始密码子和终止密码子的序列。例如，应该理解的是，“全长轻链”包含可变轻链结构域和轻链恒定区。考虑到成功地生成用于抗体生产的兔杂交瘤的有限数量以及与它们的生产有关的难度(weiminzhu,guo-liangyu,“rabbithybridoma”bookchapterp151-168.“therapeuticmonoclonalantibodies:frombenchtoclinic”,ajohnwiley&sons,inc.,publication2009)，当与具有b5同种异型的240e细胞系及其衍生物一起使用时，本发明是特别有用的。应该理解的是本发明可以用于与具有b5同种异型的兔融合伙伴一起使用。本发明还可以与具有b6或b95同种异型的兔融合伙伴一起使用，前提条件是所述的引物能够区分融b4同种异型和融合伙伴的同种异型。在一个实施方案中，具有不同于b4的同种异型的兔融合伙伴或其衍生物选自240e细胞或其衍生物。在抗体上下文中提及“同种异型”时是指，由于个体之间的遗传差异引起的遗传性等位基因变体，其可以被相同物种的成员识别为抗原性的。就本发明的目的而言以及在与兔永生细胞融合的上下文中，本文中提及“b淋巴细胞”或“b细胞”是指负责介导适应性免疫应答的细胞，这些细胞能够响应于抗原结合和活化而产生抗体。产生抗体的b淋巴细胞的来源包括脾、骨髓、淋巴结、或者其他淋巴器官和循环白细胞。在用抗原对兔进行免疫和建立合适免疫应答之后，可以使用本领域已知的常规方法来分离和获得产生兔抗体的b淋巴细胞，其具有例如b4同种异型。通常产生兔抗体的b淋巴细胞是由免疫的兔的脾分离得到的。用于免疫的过程是本领域已知的，并且在harlow(antibodies:alaboratorymanual,firstedition(1988)coldspringharbour,n.y.)和weir(handbookofexperimentalimmunologyvol4,blackwellscientificpublishers,oxford,england,1986)中有所描述。本文中提及可以互换使用的“抗体”或“免疫球蛋白”时是指由成对的异二聚体(每个异二聚体均包含一条重链和一条轻链)构成的四聚体分子，其通过链间和链内二硫键稳定化和交联形成，所述的分子特异性地结合抗原。轻链可以为κ或λ同种型。本文所述的抗体可以包括任何同种型的抗体，保留与抗原的结合特异性的抗体片段(包括但不限于fab,fv,scfv,vh和vl结构域,以及fd片段)，嵌合抗体，人源化抗体，单链抗体，以及包含抗体和非抗体蛋白质的抗原结合部分的融合蛋白质。抗体可以被检测标记，例如使用放射性同位素、生成可检测产物的酶、荧光蛋白质等。抗体可以进一步与其他部分缀合，例如特异性结合对的成员，例如生物素(生物素-亲和素特异性结合对的成员)等。抗体还可以与固体支持物结合，包括但不限于聚苯乙烯板或珠等。此外，所述的术语还涵盖fab’,fv,f(ab’)2,以及保留与抗原的特异性结合的其他抗体片段,和单克隆抗体。抗体可以以多种其他的形式存在，例如fv,fab,和(fab’)2,以及双功能(即，双特异性)杂合抗体(例如lanzavecchiaetal.,eur.j.immunol.17,105(1987))以及单链形式(例如hustonetal.,proc.natl.acad.sci.u.s.a.,85,5879-5883(1988)andbirdetal.,science,242,423-426(1988),这些文献以引用方式并入本文)(通常参见hoodetal.,“immunology”,benjamin,n.y.,2nded.,1984,和hunkapillerandhood,nature,323,15-16(1986))。免疫球蛋白轻链或重链可变区或结构域(vh或vl)由还称为“互补性决定区”或“cdr”的三个高变区所间断的构架区(fr)组成。已经精确地定义了构架区和cdr的范围(参见“sequencesofproteinsofimmunologicalinterest,”e.kabatetal.,u.s.departmentofhealthandhumanservices,1991)。不同轻链和重链的构架区的序列在物种内是相对保守的。抗体的构架区即构成性轻链和重链的组合构架区，起到定位和排列cdr的作用。cdr主要负责与抗原的表位结合。240e细胞(在本文中还称为兔融合伙伴)、骨髓瘤或浆细胞瘤的分离以及生产方法已经在文献中有所描述(us5,675,063；spieker-polet(proc.natl.acad.sci.199592:9348-52)。应该理解的是，此类细胞系是永生化的，特征为存在一个或多个癌基因，例如v-abl和c-myc。为了避免不清楚，提及“240e”及其衍生物时包括特征为具有b5同种异型的240e的所有衍生物。例如细胞系240e-1,240e1-1-2(如美国专利5,675,063和spieker-poletetal,proc.natl.acad.sci.199592:9348-52中所述，这些文献以引用方式并入本文，并且以编号no.hb-11870保藏于atcc)。240e-w和240e-w2也涵盖在本发明的范围内(weiminzhu,guo-liangyu,“rabbithybridoma”bookchapterp151-168.“therapeuticmonoclonalantibodies:frombenchtoclinic”,ajohnwiley&sons,inc.,publication2009)。本文所用的术语“它们的衍生物”是指通过几轮连续的铺板和选择而由240e衍生的细胞，例如增加融合率，减少或消除内源抗体的表达，增加稳定性，增加抗体的表达等。240e的衍生物具有240e的相同的基本特征(即，永生性，并且能够与b细胞融合从而产生杂交瘤，该杂交瘤生产b细胞编码的抗体)，但是有一些特征(例如融合率、内源抗体的表达水平、稳定性等)可以不同。240e的衍生物在us7429487中描述。产生抗体的b细胞与兔融合伙伴融合的方法是本领域已知的，并且在文献中有所描述(yametal,methodsmol.biol.2014,1131:71-9；spieker-poletetal,proc.natl.acad.sci.1995,92:9348-52；us5675063；us7429487)。术语“杂交瘤”是指b细胞与融合伙伴融合产生的细胞。此类杂交瘤无需是稳定的。提及杂交瘤时，术语“内源抗体”如本文所用是指通过融合伙伴提供给杂合体的遗传物质所编码的抗体。融合伙伴在融合之前产生内源抗体，并且杂交瘤仍能够制备所述的抗体。关于杂交瘤，术语“单克隆”如本文所用是指被通过b细胞提供给杂合体的遗传物质编码的抗体。所述的方法包括由所产生的杂交瘤分离c-dna的步骤，可以使用标准的过程实施，例如首先由杂交瘤的裂解物提取mrna，然后进行cdna合成反应，如本文所述的方法中描述的那样，从而产生dna片段，该dna片段作为模板用于扩增抗体重链和轻链结构域，或者全长重链和轻链。在一个实例中，示例性b4κ轻链cdna序列的5’末端是序列seqidno:10，如在图1中示出。seqidno:10示出针对轻链编码序列结构域下划线的起始密码子(atg)。在一个实例中，示例性b4κ轻链cdna序列的3’末端是序列seqidno:14，在图2中示出。划出终止密码子tag。使用本领域公知的技术由cdna扩增编码抗体重链和轻链的序列，例如polymerasechainreaction(pcr),us4683195和us4683195；polymerasechainreaction:currentcommunicationinmolecularbiology,coldspringsharbourpress,coldspringharbour,n.y.,1989。跨越重链和轻链cdna的起始密码子和终止密码子的寡核苷酸引物对能够扩增全长重链和轻链多核苷酸，或者vh和vl结构域。术语“引物”如本文所用，是本领域公知的，是指具有3’羟基的寡核苷酸，其在与多核苷酸模板形成双链体时能够起到核酸合成起始点的作用，并且能够沿着模板由其3’末端延伸，从而形成延长的双链体。在延伸过程中加入的核苷酸序列由模板多核苷酸的序列确定。引物通常为与它们的用途相容的长度，并且长度范围通常为8至100个核苷酸，例如10至75,15至60,15至40,18至30,20至40,21至50,22至45,25至40个核苷酸等，更通常在18-40,20-35,21-30个核苷酸长的范围内，以及所述范围内的任意长度。本文使用的术语“引物对”是本领域已知的，是指正向引物和反向引物，其中正向引物和反向引物向彼此引发，并且当在聚合酶链式反应(pcr)中与合适的模板一起使用时，会扩增双链dna片段或扩增子。本文中提及引物为“正向”或“反向”引物是随意的，除非另外明确地指出。应该理解的是术语“序列的3’末端”如本文所用，是指处于引物的3’末端的序列。例如具有序列ctarcagtcx(seqidno:11)的3’末端的引物以书面形式表示为ctarcagtcx-3’，其中通过x定义的核苷酸具有羟基，可以通过聚合酶延伸。本文所述的某些引物可以使用公式来描述。通过公式描述的引物可以涵盖在公式的范围内，或者可以为公式所涵盖的引物的混合物。例如具有公式“ctarcagtcx(seqidno:11)，其中r为a或g，x为a,ac,acc或accc”定义的3’末端的引物可以由单一引物表示，所述的单一引物具有下述的3’末端序列：ctaacagtcaca(seqidno:16),ctagcagtcaca(seqidno:17),ctaacagtcacc(seqidno:18),ctagcagtcacc(seqidno:19),ctaacagtcacc(seqidno:5),ctagcagtcacc(seqidno:20),ctaacagtcaccc(seqidno:21)或ctagcagtcaccc(seqidno:22),或它们的任何数量的混合物。如所理解的那样，任何数量的核苷酸(例如至多10个、至多20个、至多30个或至多40个核苷酸)可以存在于具有所定义的3’末端的引物的5’末端。引物可以具有与其靶物有互补性的至少10个、至少15个或至少20个核苷酸的3’末端。在一个实施方案中，正向κ轻链b4引物(正向引物)具有图1所示的3’末端序列atggacacgagggcccccac(seqidno:1)。应该理解的是，正向引物的序列可以根据待扩增的轻链dna片段的5’末端的核苷酸序列而可观地改变。正向引物可以设计成与atg序列的上游或下游杂交。正向引物可以进一步包含限制性位点，例如kpni，其有利于编码序列5’末端的酶切割和克隆。在另一个实例中，正向引物具有3’末端序列cgcaagcttgtacccttcaccatggacacgagggcccccac(seqidno:6)，其包含具有atg的kpni限制性位点(ccatgg)。根据seqidno:1和seqidno:6的引物在全长轻链编码序列的5’末端与κ轻链cdna序列杂交。因此，当与本文所述的任何轻链反向引物一起使用时，全长κ轻链(即，vl结构域加上恒定区)被扩增。在一个实施方案中，反向κ轻链b4引物具有公式ctarcagtcx(seqidno.11)序列的3’末端，其中r为a或g，并且x可以选自a、ac、acc和accc。在一个实例中，反向引物由ctaacagtcx(seqidno:2)表示，并且下划线序列相当于图2所示的终止密码子。在另一个实施方案中，反向引物的3’末端可以具有序列ctarcagtcacc(seqidno:12)，其中r为a或g，或者ctaacagtcacc(seqidno:5)。根据seqidno.11的反向κ轻链b4引物的3’末端的其他实例可以选自seqidno:16,seqidno:17,seqidno:18,seqidno:19,seqidno:20,seqidno:21和seqidno:22。如图2所示，反向引物的3’末端与b4特异性ggtg基元(下划线)的3个或4个碱基，以及可任选地所述b4特异性基元的3’侧的再一个碱基一起碱基配对。申请人确认与例如在b5同种异型中发现的aaga基元相比，该特异性ggtg基元对b4同种异型是独特的。在另一个实施方案中，反向引物可以包含限制性酶的位点(例如noti)，其位于相当于终止密码子的核苷酸的5’末端，从而有利于编码序列3’末端的克隆。在一个实例中，所用的反向引物可以具有序列cgcgcggccgctctcrctctaacagtcacc(seqidno:7)，其中r为a或g，并且下划线的序列相当于终止密码子和noti限制性位点。在一个实施方案中，可以使用正向引物(具有相当于seqidno:1或seqidno:6序列的3’末端)和反向引物(具有相当于seqidno:11序列的3’末端)来扩增全长κ轻链结构域序列。在一个实施方案中，重链正向引物和反向引物可以设计成它们与靠近b4兔同种异型的起始密码子和终止密码子的位点杂交。应该理解的是，用于扩增重链cdna或可变区(vh)cdna的合适的兔重链引物可以参照传统的方法来制备，并且这在本领域技术人员的水平范围内。在一个实例中，正向重链引物具有3’末端序列atggagactgggctgcgctggct(seqidno:3；atg下划线)。在另一个实例中，反向重链引物具有3’末端序列caggcagcccagggtcac(seqidno:4)。可以使用正向引物(具有根据seqidno:3或seqidno:8的序列的3’末端)和反向引物(具有根据seqidno:4或seqidno:9的序列的3’末端)来扩增b4兔可变重链结构域(vh)的序列。可以分别使用b4轻链正向引物(具有根据seqidno:1或seqidno:6的序列的3’末端)，b4轻链反向引物(具有根据seqidno:11或seqidno:7的序列的3’末端)，b4重链正向引物(具有根据seqidno:3或seqidno:8的序列的3’末端)，以及b4重链反向引物(具有根据seqidno:4或seqidno:9的序列的3’末端)来扩增b4可变重链结构域和b4轻链。可以通过多重pcr在同一反应中扩增重链和轻链。重链序列和轻链序列可以克隆至分开的质粒或同一质粒中。在一些实施方案中，所述的方法可以包括由cdna扩增单克隆抗体的重链编码序列；以及将重链编码序列克隆至第二表达载体中，从而产生第二质粒。然后，将扩增的重链和轻链扩增子克隆至一个或多个质粒中。可以将该质粒引入哺乳动物宿主细胞(例如细菌、昆虫、植物、酵母或哺乳动物宿主细胞，例如hek-293细胞,vero细胞,cho细胞,3t3细胞,cos等)中，以及在足以诱导编码抗体表达的条件下温育的细胞中。用于表达抗体的载体系统和宿主是公知的(例如参见vermaetal,j.immunol.methods.1998216:165-81,chartrainetal,curr.pharm.biotechnol.20089:447-67；arbabi-ghahroudietal,cancermetastasisrev.200524:501-19andmorrow(biotechnol.annu.rev.200713:95-113))。在具体的实施方案中，可以使用ptt5载体(例如参见jageretal,bmcbiotechnology2013,13:52andyouetal,bioscience,biotechnology,andbiochemistry201377:1207-1213)，但是其他的载体系统也是可用的。如所理解的那样，表达载体可以包含用于在细胞中表达单克隆抗体的重链和轻链的启动子和终止子。将核酸引入细胞中的方法是本领域公知的。合适的方法包括电穿孔，基因枪技术，磷酸钙沉淀，直接微注射等。方法的选择通常取决于待转化的细胞的类型以及进行转化的环境(即，体外、离体或体内)。这些方法的一般讨论可以在ausubel,etal,shortprotocolsinmolecularbiology,3rded.,wiley&sons,1995中找到。在一些实施方案中，使用脂转染胺(lipofectamine)和钙介导的基因转移技术。在题述核酸被引入细胞中之后，通常将该细胞在常用的37℃(有时在选择下)下温育大约1-24小时的时间，从而可以表达抗体。在大多数实施方案中，抗体通常被分泌至细胞生长的介质的上清液中。在哺乳动物宿主细胞中，大量的基于病毒的表达系统可以用于表达题述抗体。在其中腺病毒用作表达载体的情况下，所关注的抗体编码序列可以与腺病毒转录/翻译控制复合物连接，例如晚期启动子和三联体前导序列。然后可以通过体外或体内重组将所述的嵌合基因插入腺病毒基因组中。在病毒基因组的非必需区域(例如区域e1或e3)中的插入将得到活的并且能够在所感染的宿主中表达抗体分子的重组病毒(例如参见logan&shenk,proc.natl.acad.sci.usa81:355-359(1984))。表达效率可以通过包含合适的转录增强子元件、转录终止子等而增强(参见bittneretal.,methodsinenzymol.153:51-544(1987))。就重组抗体的长期、高产率的生产而言，稳定的表达可能是优选的。例如可以改造稳定表达所述抗体分子的细胞系。不使用包含病毒复制起点的表达载体，而是如使用免疫球蛋白表达盒和可选择标志物来转化宿主细胞。在引入外来dna后，可以使改造的细胞在富集介质中生长1-2天，然后转换至选择介质中。重组质粒中的选择标志物赋予对选择的抗性，使得细胞稳定地将质粒整合至染色体中，并生长，从而形成灶，其继而可以被克隆并扩增成细胞系。这种改造的细胞系可以特别用于筛选和评价与所述抗体分子直接或间接相互作用的化合物。一旦生产出了本发明的抗体分子，便可以通过本领域已知用于免疫球蛋白分子纯化的任何方法来纯化，例如通过层析(例如离子交换、亲和、特别是在蛋白质a后对特异性抗原的亲和性、以及分级柱层析)、离心、差异溶解度，或者通过用于蛋白质纯化的任何其他标准技术。在许多实施方案中，抗体由细胞分泌至培养介质中，并由培养介质收获。在一个实施方案中，本发明涉及克隆轻链兔单克隆抗体的全长编码序列的方法，该方法包括以下步骤：a)提供产生兔抗体的b淋巴细胞，其具有b4同种异型；b)将步骤a)的b淋巴细胞与兔融合伙伴或其衍生物融合，从而生产能够产生抗体的杂交瘤细胞，其中所述的融合伙伴或其衍生物具有不同于b4的同种异型；c)由所述的杂交瘤分离cdna；d)使用以下物质，由步骤c)的cdna扩增轻链结构域：(i)轻链引物对，其包含正向引物(i)和反向引物(ii)，所述的正向引物具有与seqidno:10中的位点杂交的序列的3’末端，所述的反向引物具有seqidno:11的序列的3’末端；e)将在步骤d)中得到的扩增的轻链结构域克隆至用于表达的质粒中。所述的方法进一步包括下述的额外步骤：f)在宿主细胞中表达所述的轻链。可以通过本领域已知的技术由表达轻链结构域的宿主细胞分离和纯化这些轻链结构域。本文所指的轻链结构域的纯化可以通过本领域已知的合适的方法来进行。例如可以通过层析、离子交换层析、尺寸排阻色谱、高效液相色谱(hplc)和亲和层析由宿主细胞或细胞培养介质中纯化所述轻链结构域(methodsinenzymology,vol.182,guidetoproteinpurification,eds.j.abelson,m.simon,academicpress,1stedition,1990)。根据本发明的另一个方面，提供了与上文所述的方法一致的多种组合物。在一个实施方案中，提供了一种组合物，其包含：a)得自杂交瘤的cdna序列，所述的杂交瘤是通过将由来自具有b5同种异型的兔的产生抗体的b细胞与240e细胞或其衍生物融合而产生的；以及b)pcr试剂，其包含(i)轻链引物对，其包含具有根据seqidno:1序列的3’末端的正向引物和具有根据seqidno:2序列的3’末端的反向引物；和(ii)重链引物对，其包含具有seqidno:3序列的3’末端的正向引物和具有seqidno:4序列的3’末端的反向引物。轻链反向引物可以具有根据seqidno:5的序列的3’末端。所述的组合物可以包含(i)轻链引物对，其包含具有seqidno:6序列的3’末端的正向引物和具有seqidno:7序列的3’末端的反向引物；以及(ii)重链引物对，其包含具有seqidno:8序列的3’末端的正向引物和具有seqidno:9序列的3’末端的反向引物。根据本发明的引物序列列于表1中。在本发明的一个实施方案中，提供了分离的合成核酸引物，其具有根据seqidno:11的序列的3’末端。在本发明的一个实施方案中，提供了分离的合成核酸引物，其具有根据seqidno:2的序列的3’末端。为了免于疑虑，在本发明的内容中，术语“合成”是指不能在自然界发现的非天然的dna序列。在一个实施方案中，提供了分离的合成核酸分子，其具有根据ctarcagtcx(seqidno.11)所表示的公式的序列的3’末端，其中r可以为a或g，而x可以选自a、ac、acc和accc。在一个实例中，r为a，而x选自a、ac、acc和accc(例如seqidno:2)。在另一个实例中，r为g，而x选自a、ac、acc和accc。在另一个实例中，x为acc或accc，而r为a或g(seqidno.12)。下文列出根据ctarcagtcx(seqidno.11)(其表示b4κ轻链反向引物的3’末端序列)的分离的合成核酸分子的具体实例：ctaacagtcacc(seqidno:5),ctaacagtcaca(seqidno:16),ctagcagtcaca(seqidno:17),ctaacagtcacc(seqidno:18),ctagcagtcacc(seqidno:19),ctaacagtcacc(seqidno:5),ctagcagtcacc(seqidno:20),ctaacagtcaccc(seqidno:21)或ctagcagtcaccc(seqidno:22)。应该理解的是，在具有定义的3’末端的引物的5’末端可以存在任何数量的核苷酸(例如至多10个、至多20个、至多30个或者至多40核苷酸)。引物可以具有与其靶物有互补性的至少10个、至少15个或至少20个核苷酸的3’末端。在另一个实施方案中，提供了分离的合成核酸引物，其包含表1中列出的核酸引物(例如seqidno:1,seqidno:2,seqidno:3,seqidno:4,seqidno:5,seqidno:6,seqidno:7,seqidno:8,seqidno:9,seqidno:11,seqidno:12,seqidno:16,seqidno:17,seqidno:18,seqidno:19,seqidno:20,seqidno:21和seqidno:22)。在另一个实例中，提供了分离的合成核酸分子，其具有根据seqidno:11的序列的3’末端，其进一步包含限制性位点，例如cgcgcggccgctctcrctctaacagtcacc(seqidno:7)，其中r为a或g。在一个实施方案中，提供了能够与seqidno:10中的位点杂交的核酸序列。在另一个实施方案中，提供了包含pcr引物对的pcr试剂，其中所述的引物对具有选自seqidno:11和seqidno:1中的序列的3’末端。pcr试剂可以进一步包含引物的正向和反向重链对，其具有选自seqidno:3和seqidno:4中的序列的3’末端。关于本文中的术语“pcr试剂”，是指用于在模板上实施聚合酶链式反应(pcr)所需的所有试剂。如本领域已知的那样，pcr试剂基本上包含第一引物、第二引物、热稳定的聚合酶以及核苷酸。根据所用的聚合酶，还可以存在离子(例如mg2+)。pcr试剂包含模板，由该模板可以扩增靶序列。在另一个实施方案中，pcr试剂包含pcr引物对，其中第一引物为具有根据seqidno:11的序列的3’末端的轻链反向引物，而第二引物为能够与seqidno:10中的位点杂交的轻链正向引物。在一个实例中，pcr试剂包含具有根据seqidno:11的序列的3’末端的轻链反向引物，以及具有根据seqidno:1的序列的3’末端的轻链正向引物。pcr试剂可以进一步包含具有根据seqidno:3和seqidno:4的序列的3’末端的正向和反向重链引物对。pcr试剂可以包含正向和反向引物，其进一步包含处于双链形式时可以被限制性酶切割的序列，例如具有根据seqidno:6,seqidno:7,seqidno:8和seqidno:9的序列的3’末端。除了上文所述的pcr试剂以外，所述的组合物进一步包含由杂交瘤衍生的cdna模板，所述的杂交瘤是通过将得自具有b4同种异型的兔的b细胞与具有除了b4以外的同种异型(例如b5同种异型)的融合伙伴(例如240e细胞或其衍生物)融合而产生的。具体而言，根据seqidno:10和/或seqidno:14的cdna。根据本发明的另一个方面，提供了分离的合成核酸分子在生产由具有b4同种异型的兔衍生的重组抗体中的用途，其中所述的核酸分子具有根据seqidno.11的序列的3’末端。根据这一方面，轻链反向引物(seqidno.11)可以与本文所述的任何合适的轻链正向引物(例如seqidno:1,seqidno:6或者能够与seqidno:10中的位点杂交的引物)配对，从而生产b4κ轻链。本文所公开的正向和反向重链引物(seqidno:3和seqidno:4)可以用于可变重链结构域的生产，当该结构域与重链恒定区一起表达时，其能够与b4κ轻链配对，从而产生重组b4抗体。应该理解的是seqidno:3和seqidno:4代表了非限定性实施方案，并且使用能够扩增b4可变重链的全长编码序列的备选引物在本领域技术人员的能力范围内。或者扩增b4重链的全长编码序列的重链引物可以与本文所述的轻链引物一起使用。类似地，当b4κ轻链正向引物(seqidno:1)与根据seqidno:11的公式定义的反向κ轻链引物结合使用时，可以使用能够扩增κ轻链的另一种引物替代b4κ轻链正向引物。此外，本文提供了分离的合成核酸分子(具有根据seqidno:2的序列的3’末端)在生产由具有b4同种异型的兔的重组抗体中的用途。在一个实例中，seqidno:2可以与具有根据seqidno:1或seqidno:6的序列的3’末端的轻链正向引物配对，并且与具有根据seqidno:3和seqidno:4或seqidno:8和seqidno:9的序列的3’末端的正向和反向重链引物结合，从而分别产生重组b4抗体。序列在以下非限定性实施例中进一步描述本发明。实施例通过所有已知的兔种系κ的多重比对来鉴定能够区分同种异型b4的兔κ链和b5的兔κ链的序列基元。由imgt数据库回收序列，并在使用clustalw多重比对后进行序列比较。引物被设计成在3’末端引入能够区分b4与b5κ链同种异型的4个碱基对。如下文所述，本文所述的轻链引物一致性地扩增κ轻链，脱靶扩增很少，如图3中缺乏次级条带所示。1.mrna提取a.向杂交瘤细胞中加入1:1v/v裂解缓冲剂(qiagenbuffertcl2xw/2％2-巯基乙醇)b.将80μl细胞裂解物加入至turbocapture平板中，在轨道摇床上在100rpm下温育90minc.洗涤3xw/缓冲剂tcw(留下最后的洗涤液，直至加入rtpcr混合物)d.立即进行cdna合成(由于可能会导致cdna合成抑制或mrna降解，不使用tris-hcl缓冲剂)2.cdna合成a.除去残余的缓冲剂tcwb.加入80ulrt混合物c.在热循环仪上开始反应“rt1”d.洗涤3xw/10mmtris-hcl,留下最后的洗涤液直至cdna的pcr扩增3.h和l链可变区的pcr扩增a.除去tris-hclb.加入80μlvhpcr混合物(在冰上制备混合物，从而避免活性聚合酶的非特异性引发)rabmab(兔单克隆抗体)引物重链：vh正向(oyz64-2)5’-cggaagcttgtacccttcaccatggagactgggctgcgctggct-3’(seqidno:8)vh反向(oyzvh3)5’-gggaggtaccctttgaccaggcagcccagggtcac-3’(seqidno:9)轻链(全长)：轻链正向(oyz62)5’-cgcaagcttgtacccttcaccatggacacgagggcccccac-3’(seqidno:6)轻链反向(oyz71)5’-cgcgcggccgctctcrctctaacagtcacc-3’(seqidno:7)a.热循环仪上开始反应b.转移并保存pcr反应混合物至新管中c.在1.2％琼脂糖凝胶上分开vh和轻链条带(40ul，保存另外的40ul)采用qiaquick凝胶提取试剂盒，从琼脂糖凝胶(切下每一条带，vh大约650bp，vl大约850bp)纯化vh和轻链dna(最终洗脱50μl)4.pcr产物的限制性酶消化在冰上制备消化混合物a.在37℃的水浴中温育2hr(重链首先使用hindiii消化1hr，然后加入kpni再消化1hr)b.通过qiaquickpcr纯化试剂盒纯化消化的产物(无需凝胶纯化)5.质粒的限制性酶消化在冰上制备消化混合物a.在37℃的水浴中温育2hrb.在65℃的水浴中加热20min使酶热灭活c.使用cip处理载体，以防止自连接：向100ul上述反应物中加入1ulcip+11ul10xneb缓冲剂3(你可以使用1ulantarctic磷酸酶+11ulantarctic磷酸酶缓冲剂替代cip加入至100ul反应物中)d.在37℃下温育1hr(如果使用antarctic磷酸酶，在65℃下热灭活5min)e.使用qiaquickgelextraction试剂盒通过琼脂糖凝胶纯化进行纯化(载体大约4.6kb，除去可变区插入物)(最终的洗脱体积为50ul)。6.将vh和轻链插入物连接到载体中a.在相同的1.2％琼脂糖凝胶上对插入物和载体(3ul)电泳b.基于条带强度，估计dna的使用量。载体与插入物的摩尔比为大约1:3和1:5c.基于10ul的总连接反应体积(成分＝载体+插入物+0.5ult4dna连接酶+1ul10xt4dna连接酶缓冲剂+dh2o至10ul)，在小的pcr反应管中加入适量载体+插入物+水(dh2o至多8.5ul)，不加连接酶和缓冲剂d.在42℃水浴中将装有载体+插入物+水的管加热3min，将帽打开，以使得来自凝胶提取操作的剩余醇蒸发(不包含连接酶和缓冲剂)e.加入0.5ult4dna连接酶+1ul10x缓冲剂f.在rt下温育1小时7.转化a.将1ul连接混合物加入25uldh5a中b.在冰上保持30minc.在42℃下保持45秒d.在冰上保持2min(将管浸没于冰中)e.加入250ulsocf.在37℃、225rpm下温育1hrg.将250ul转化混合物涂布在lb-amp平板上h.在37℃下温育16-20hri.每个克隆挑选5-10个集落，并在3mllb-amp肉汤中培养j.在37℃、225rpm下温育16-20hrk.仅使用1.5ml培养物，用qiaprepspinminiprepkit进行小量制备l.使用合适的酶(对于vh质粒使用hindiii/kpni；对于vl质粒使用hindiii/noti)在37℃下将2ul样品消化1hr；在琼脂糖凝胶上分开dnam.挑选正确的克隆样品，取5uldna加入到95ulh2o(1:20稀释)中用于测量od260nm，从而确定dna的浓度。将样品稀释至100ng/ul，取5ul用于测序结果使用us7,429,487中所述的方法，将得自数只b4兔的脾细胞与240e的衍生物融合。由从所测试的所有杂交瘤制得的cdna扩增全长轻链扩增子，使用上文所述的方法检验该扩增子，即，使用序列cgcaagcttgtacccttcaccatggacacgagggcccccac(seqidno:6)的正向引物和序列cgcgcggccgctctcrctctaacagtcacc(seqidno:7)的反向引物。图3示出本文所述的轻链引物可以用于可重复地扩增κ轻链，并且脱靶扩增(次级条带)很少。由240e对照没有得到产物(未示出)。将所选的扩增子克隆至表达载体中，将重组载体引入hek-293细胞中，并且与相应的全长重链一起表达编码的轻链。由培养介质生产并收获重组抗体。参考文献1.bystryn,j.c.etal,1982,“comparisonofcellsurfacehumanmelanoma-associatedantigensidentifiedbyrabbitandmurineantibodies”,hybridoma,1:465-72.2.weller,a.etal,1987“preparationandpropertiesofmonoclonalandpolyclonalantibodiestomouseepidermalgrowthfactor(egf)receptors:evidenceforcrypticegfreceptorsinembryonalcarcinomacells.”,development,100:351-63.3.raybould,t.j,&takahashi,m.,1988,“productionofstablerabbit-mousehybridomasthatsecreterabbitmabofdefinedspecificity”science,240:1788-90.4.helgaspieker-poletetal,1995,“rabbitmonoclonalantibodies:generatingafusionpartnertoproducerabbit-rabbitantibodies”,proc.natl.acad.sci.usa,92:9348-9352.5.weiminzhu,guo-liangyu,“rabbithybridoma”bookchapterp151-168.“therapeuticmonoclonalantibodies:frombenchtoclinic”,ajohnwiley&sons,inc.,publication2009.6.weiminzhu,“rabbitmonoclonalantibody:anewdiagnosticstechnology”,p22-28,ivdtechnology,spring2013.当前第1页12当前第1页12