用于利用寡核苷酸编辑细胞中核酸的组合物和方法与流程

相关申请的交叉引用

以下申请要求临时专利申请系列号62/252,693(2015年11月9日提交)、62/180,175(2015年6月16日提交)、62/141,077(2015年3月31日提交)和62/091,027(2014年12月12日提交)的优先权。

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本发明涉及修饰基因组或rna的序列的寡核苷酸应用于人和动物治疗(包括体内和体外治疗应用)、美容程序(美容手术，cosmeticprocedure)、临床前开发、基础研究和用于农业以提高食品储备、改良动物品种的畜牧业(农场动物和其他驯养动物)以提供理想的特征以及能源生产的领域中的用途。

背景技术：

寡核苷酸化学和体内核酸递送技术在过去十年的发展已经开启了dna和rna修饰疗法的潜力。许多临床试验中的阳性数据和美国首例系统性反义药物mipomersen(isispharmaceuticals，sandiego，ca)的批准已进一步证明了寡核苷酸药物的临床应用。

虽然已经证明使用治疗性寡核苷酸通过调节rna水平抑制蛋白质表达的临床益处，但是核酸编辑或修复方法的临床潜力可能会超过这些抑制方法的临床潜力(t.m.woolf,等人,pnasvol.92:8298-8302,1995和t.m.woolf,nat.biotechvol.16:341-344,1998)。稳健的编辑技术平台能够实现突变dna的位点特异性化学校正，保护性等位基因的产生或以其他方式产生针对研究、治疗、美容或农业目的所期望的在整个生物体、细胞或组织的基因组中的变化。这种平台作为对由基因点突变和其他基因病变引起的广泛疾病的治疗性干预以及潜在疗法将具有广泛应用。

有两种常规的用核酸的序列编辑机制。这些机制是化学修饰和将核酸序列掺入靶。通过化学修饰机制，编辑寡核苷酸引起被靶向的核苷酸的化学修饰，使得被靶向的核苷酸的编码改变。第二种常规机制是将一种或多种寡核苷酸掺入靶rna或dna序列。在这种机制中，寡核苷酸通常被称为“供体”dna。这种机制被不严格地称为同源重组(hr)或同源性定向修复，但也可以包括其他机制，诸如基因转换、反式剪接或链侵入后引发核酸合成。

由下一代测序(nextgenerationsequencing)和snp分析推动的关于遗传途径和分子途径的信息的激增已经提供了大量用于治疗性编辑的靶以治疗单基因疾病和多基因疾病。这些疾病的实例包括家族性阿尔茨海默病、高血压、高胆固醇、hiv(通过诱导ccr5突变)、镰状细胞性贫血症、肥胖症、糖尿病、某些形式的肌营养不良和许多先天性代谢缺陷(inbornerrorsofmetabolism)。dna编辑修复的治疗潜力已经被有前景的数据证明。已经使用工程化的锌指核酸酶(sangamobiosciences，inc.，richmond，ca)来治疗hiv并且外显子跳读反义吗啉(sareptatherapeutics，inc.，cambridge，ma)和2'-o-甲基硫代磷酸酯寡核苷酸(prosensa，leiden，thenetherlands)已被用于治疗某些形式的杜氏肌营养不良。此外，用于提高编辑效率的crispr/cas-9基因编辑方法已经产生了许多研究产品和在治疗应用方面的投入。

woolf等人在脊椎动物模型系统中首次证实了治疗性mrna编辑(pnasvol.92：8298-8302，1995)。在该系统中，杜氏肌营养不良mrna中的被靶向的终止密码子突变在靶位点处用编辑反义rna通过双链体形成(duplexformation)来修饰。woolf等人的工作诱导了限于特异性的编辑。

montiel等人(pnas110(45)：18285-90，2013)证实了囊性纤维化的mrna修复的相关机制，其中在哺乳动物细胞中实现了20％的校正。虽然这成功地证明了治疗性编辑的原理，但是montiel的方法并不容易应用于临床应用。其主要原因是montiel等人的方法需要通过基因治疗、mrna治疗或其他方法将修饰的基因、mrna或蛋白质引入细胞。因此，基因治疗和mrna治疗所公认的所有已知的缺点也与montiel的治疗编辑方法有关。

在另一方法中，singer等人(nucleicacidsresearch，27(24)：38-45，1999)用与由reca蛋白辅助的靶链杂交的烷基化寡聚物靶向dna。在该研究中，反应性氮芥基通过氨基-丙基接头与入侵寡核苷酸的内部du残基的5位缀合。并且在一个处理周期之后将复合物转染到哺乳动物细胞中时观察到高达50％的寡核苷酸与靶dna序列交联并证实了高达2％的靶序列突变。然而，将入侵的寡核苷酸交联到靶dna通常导致分布在dna区域上的各种突变，并且可能导致复制的抑制。已经实现了反应性碱基修饰化学物质与寡核苷酸的缀合和对被靶向的dsdna序列的序列特异性修饰(f.nagatsugi，等人nucleicacidsresearch，vol.31(6):e31doi:10.1093/nar/gng031，2003)。在本研究中，将2-氨基-6-乙烯基嘌呤核苷类似物合成地掺入三链形成寡核苷酸(tfo)中。该tfo与缓冲液中的靶dna质粒反应，实现靶dna序列的达25-40％的修饰。然后将这种交联的tfo和dna靶的混合物转染到细胞中，并测定诱变水平。该研究证明了具有针对被靶向的碱基的某种特异性的被靶向的序列的位点特异性突变以及显著却低的效率(一次处理为0.3％)。然而，这种方法具有与singer等人相同的缺点，因为其引起交联。

sasaki等人(j.am.chem.soc.，126(29)：8864-8865，2004；还参见美国专利号7,495,095)开发了一种将一氧化氮(no)递送到dna序列的特异性胞嘧啶位点后对胞嘧啶碱基特异性脱氨基的方法。在该方法中，用s-亚硝基-n-乙酰基青霉胺进行含有6-硫鸟嘌呤的寡脱氧核苷酸(odn)的亚硝化。然后将所得的s-亚硝基硫鸟嘌呤用于进行链间no转移反应，然后在靶位点脱氨基。观察到从dmc到dt的42％的转化率，而在靶位点处具有错配的dt、da或dg的互补odn未观察到no转移反应(和脱氨基)。该技术需要非生理ph以允许反应发生，以及长的孵育时间，其不一定适用于治疗干预。此外，化学反应性寡核苷酸策略即使在细胞中有效，也需要复杂的化学合成，并且可能与非被靶向的细胞成分(包括不理想的dna)有反应性。它们针对每种碱基变化还需要不同的靶向化学物质，并且仅适于转换而不适于颠换，这限制了它们的普遍应用。此外，该方法不修复缺失和插入，这是对其校正任何突变的普遍应用的进一步限制。尽管如此，这种化学修饰方法进行编辑具有如下的优点：其不需要向细胞添加外源蛋白质以便于编辑，并且其原则上可以与高度修饰的寡核苷酸主链一起使用，该主链可以允许更好的组织分布和细胞摄取。

一个研究组在二十世纪九十年代用嵌合寡核苷酸构建体实现了编辑，然后在二十一世纪前10年用单链寡核苷酸构建体实现了编辑(brachman和kmiec，dnarepair4：445-457，2005)。在该编辑方法中，所需编辑的序列包含在编辑寡核苷酸中，并且该序列取代了基因组中的现有序列(图1)。在二十世纪九十年代报道的用嵌合寡核苷酸构建体编辑的效率是可变的，并且尽管有大量投入，但该方法并未成功地用于临床应用。由同一研究组用单链编辑寡核苷酸进行的后续工作导致了一致的可重复编辑，但效率相对较低(约0.1-1％)。最活跃的单链编辑寡核苷酸具有未修饰的dna内部区域，其导致细胞中快速的核酸酶降解并且可能导致toll样受体激活。通过以下方法提高编辑效率：

1.在编辑寡核苷酸的每个端添加三个硫代磷酸酯残基(但是，所得到的编辑寡核苷酸其中仍然易受细胞内快速核酸内切酶消化并且硫代磷酸酯增加其毒性)；

2.同步细胞周期使得在s期期间用编辑寡核苷酸处理细胞。不幸的是，虽然这在一定程度上提高了编辑效率，但是对于体内治疗而言，该方法是麻烦的并且并不总是实用的；以及

3.用减慢复制叉进展和/或在细胞中诱导dna链切割的试剂处理细胞，这导致细胞中dna修复增加(然而尽管在一定程度上这提高了编辑效率，但是对于体内治疗而言，该方法是也是麻烦的并且并不总是实用的。

4.加入在被靶向的编辑附近结合的pna夹或链入侵单链pna(bahal等人currentgenetherapyvol.14(5):331-42(2014)，chin等人pnasvol105(36):13514-13519(2008)，rogers等人pnasvol.99(26):16695–16700(2002)，美国专利8,309,356)。

这些改进在模型体外细胞系统中提高编辑效率高达约5％，但是每种方法都有上述限制(kmiec，surgicaloncology24：95-99，2015)。

最近，crispr-cas9系统已用于增强编辑基因组的效率。然而，crispr-cas9系统经常导致脱靶修饰，并且需要在染色体中潜在危险的以及不期望的单链断裂和双链断裂。该系统还严格要求将外来细菌蛋白质表达或以功能形式递送到细胞。细菌蛋白cas9是免疫原性的，并因此对于治疗应用而言是不太合意的。此外，蛋白质到细胞的表达或递送是临床发展的实质性挑战。为了将一个序列特异性地改变为另一个定义的序列，除了cas9之外，crispr-cas9系统需要超过70个核苷酸的grna和用于插入到基因组中的一个或两个另外的寡核苷酸。因此，crispr/cas9编辑系统是非常复杂的，并且这种复杂性为临床开发产生了挑战。

因此，在生物医学和生物技术产业中对于总体上作用更加有效并特别是与较短的编辑寡核苷酸作用的核酸编辑化合物存在需要，且该化合物不严格要求：将编辑寡核苷酸与被靶向的核酸的核碱基交联作为作用方法；引入靶核酸中的断裂以实现修复；递送媒介物(vehicle)；将免疫原性蛋白质或未修饰的不稳定rna递送到细胞中；以及向靶核酸和/或细胞中引入载体序列(vectorsequence)。此外，希望这些核酸编辑化合物能够通过编辑被靶向的dna序列和在一些实施方式中的rna序列来修复大多数点突变以及小的插入和缺失、含有增强药代动力学的化学修饰、具有生物分布和细胞内核酸酶稳定性而不实质减少编辑活性，可选地减少toll样受体的激活，并且校正疾病背后的遗传原因。

技术实现要素：

本发明的一个方面是一种利用与基因组的dna链之一或rna互补的单链寡核苷酸用于序列编辑的方法。该方法包括以下步骤：将单链寡核苷酸引入细胞或生物体，而不严格需要外源蛋白质或核酸，来辅助编辑所述基因组序列。在某些实施方式中，除了相对于靶序列的一个或多个错配(包括插入或缺失)，寡核苷酸与靶序列基本上互补。这种寡核苷酸在本文中可以称为寡核苷酸、本发明的寡核苷酸或编辑寡核苷酸。在某些实施方式中，寡核苷酸与基因组中的靶序列基本上互补，并且包含与靶序列上的核苷酸反应或促进与靶序列上的核苷酸的反应的一种或多种化学修饰。这种反应的实例包括烷基化、乙酰化、交联、胺化、脱胺、产生游离的(非共价结合的)反应性化合物。这种化学修饰的实例是亚硝胺。这种寡核苷酸在本文中也可以称为寡核苷酸、本发明的寡核苷酸或编辑寡核苷酸。寡核苷酸可以优选地具有一种或多种化学修饰。这种化学修饰/这些化学修饰可以包括一种或多种主链修饰、糖修饰和/或核碱基修饰。寡核苷酸与基因组中的靶序列互补，并且可以具有错配，如下所述的。与未修饰的寡核苷酸相比或与每个末端上具有三个硫代磷酸酯的寡核苷酸相比，修饰可通过增加核酸酶稳定性提高编辑效率。

所期望的编辑可能是转换或颠换，或者是缺失或插入。在一种实施方式中，编辑寡核苷酸序列是编辑完成后所期望的序列。不希望受特定理论或机制约束，当在诸如转录或复制的细胞过程期间靶序列与相反的基因组链分离时，编辑寡核苷酸结合到部分互补的靶基因组dna序列。在一些情况下，编辑寡核苷酸与双链基因组dna靶的杂交可以在靶dna的“呼吸(breathing)”或瞬时溶解期间发生。一旦在编辑寡核苷酸和靶基因组dna链之间形成异源双链体，则通过细胞dna修复来校正非完美互补区域。当编辑寡核苷酸用作修复的“正确”模板时，所期望的编辑将被掺入被靶向的基因组dna链或rna链中。在细胞中还可能发生的第二种机制中，编辑寡核苷酸通过同源重组(hr)或其他导致编辑寡核苷酸序列掺入靶dna或rna的过程而被掺入靶核酸中，诸如dna中。

本发明的另一方面提供导致被靶向的核苷酸的位点特异性化学修饰的编辑寡核苷酸，使得被靶向的核苷酸的编码改变。这些编辑寡核苷酸可以包括以下结构：

其中每个寡核苷酸与所述靶核酸基本上互补，并且是约10个至约50个或10个至约200个核苷酸；x是h、oh、卤素、r¹、sr¹或or¹；卤素为cl、f、br或i；以及r¹为-ch3、-ch2ch3或-ch2och3。被靶向的核酸可以是rna或dna。靶为rna时，优选为mrna。

在一种实施方式中，编辑寡核苷酸的每个寡核苷酸包括以下核苷酸间键(internucleotidelinkage)或糖修饰中的至少一者：磷酸二酯、磷酸三酯(烷基、芳基、杂烷基、杂芳基)、甲基膦酸酯、硼烷磷酸酯、吗啉基、非桥联二烷基氨基磷酸酯(non-bridgingdialkylphosphoramidate)、桥联3'-nh-或5'-nh-、桥联3'-s-或5'-s-或2'-修饰的糖，或者图20和图22中列出的其他修饰。

其他实施方式包括药物组合物和含有一种或多种编辑寡核苷酸的细胞，该药物组合物包含药物载体(pharmaceuticalcarrier)或递送媒介物(deliveryvehicle)以及一种或多种编辑寡核苷酸，其中载体可以是水、盐水或生理缓冲盐水。

本发明的另一方面是一种改善需要针对医学病症进行治疗的个体的健康或者减少或消除或预防需要针对医学病症进行治疗的个体的病症的方法，包括将含有至少一种编辑寡核苷酸的组合物施用至个体。施用可以是肌内注射、腹腔注射、腹膜内注射、皮下注射、静脉内注射、透皮递送、雾化吸入、直肠栓剂或阴道栓剂。可以治疗的医学病症包括例如腺苷脱氨酶缺乏症、α-1抗胰蛋白酶缺乏症、阿尔茨海默病、淀粉样蛋白病、贝克肌营养不良症、乳腺癌易感性突变、canavan病、腓骨肌萎缩症(charcot-marie-tooth)、囊性纤维化、1型糖尿病、2型糖尿病、杜氏肌营养不良、法布里病、遗传性酪氨酸血症i型(hti)、家族性腺瘤性息肉病、家族性淀粉样性心肌病、家族性淀粉样多发性神经病、家族性自主神经功能障碍、家族性高胆固醇血症、弗里德希氏共济失调、戈谢病i型、戈谢病ii型、糖原贮积病ii型、gm2神经节苷脂沉积症、血色素沉着病、血友病a型、血友病b型、血友病c型、己糖胺酶a缺乏症、卵巢癌易感性突变、肥胖症、苯丙酮尿症、多囊肾病、朊病毒病、老年性系统性淀粉样变性病、镰状细胞病、smith-lemli-opitz综合征、脊髓性肌萎缩症、威尔逊病和遗传性盲症。其他疾病包括那些点突变或小的缺失或插入的疾病或者可以通过点变化或小的缺失或插入来修正的疾病，这些点变化或小的缺失或插入列在http://www.omim.org/上的2015年3月2日更新的人类基因和遗传疾病的在线目录的onlinemendelianinheritancein包括图23中所列的靶。

本发明的其他方面包括向疑似具有可通过这种施用治疗的病症的个体施用至少一种编辑寡核苷酸的方法，其中可以通过以下方式来减少、预防或消除该病症：将靶核酸中的突变的核苷酸回复到野生型核苷酸；修饰靶核酸中的突变的密码子的非突变核苷酸以产生野生型密码子；将靶核酸中的成熟前终止密码子转变为通读非野生型密码子；或修饰靶核酸中的突变的密码子以产生导致非致病氨基酸的非野生型密码子，还编辑寡核苷酸插入或缺失多个核苷酸(例如，在一些情况下小于约10个、小于5个或小于3个)。在这些方法中，可以用编辑寡核苷酸治疗的病症或医学病症包括例如β地中海贫血、囊性纤维化、杜氏肌营养不良症和hurler综合征。

本发明的另一方面是用于修饰编码蛋白质或功能性rna的核酸、或者调控基因的转录水平以调节所述蛋白质的或rna的活性或者修饰突变蛋白质以抑制其致病影响的方法，其包括以下步骤：向细胞或个体施用至少一种编辑寡核苷酸。在这些方法中，用于编辑的靶核酸是dna。

本发明的编辑寡核苷酸可以执行以下功能中的一种或多种，所述功能包括：突变的碱基精确回复到具有野生型dna或rna序列的编码特异性的碱基；改变突变的密码子以编码导致非致病氨基酸的非野生型；将终止密码子修饰为非野生型通读密码子(仍然允许被靶向的蛋白质的活性或部分活性的密码子)；改变突变的密码子的非突变碱基，这导致野生型密码子或非疾病氨基酸密码子；改变蛋白质的核酸序列，以增加或减少(或消除)该蛋白质的结构域的活性；改变rna或dna的序列，以产生已知能够防护疾病的等位基因；改变被靶向的突变蛋白质中除突变的或疾病变异的密码子以外的位点，这抑制突变基因的致病影响；改变基因或rna中除突变的或疾病变体以外的位点，这抑制突变基因的致病影响(第二位点抑制物)；改变基因的启动子、增强子或沉默区域，这调节疾病相关基因的表达，使疾病状态变弱(向上或向下调控或调节基因表达对环境变化的反应)；dna中糖的甲基化，以改变被靶向的序列的表观遗传状态和/或在dna或rna水平上改变剪接位点序列以影响治疗疾病状态的剪接模式。

其他实施方式包括用可逆的电荷-中和磷酸酯主链修饰来编辑寡核苷酸。这些修饰具有在寡核苷酸行进至靶细胞的细胞质时赋予寡核苷酸改善的递送和核酸酶稳定性的优点。当编辑寡核苷酸使用错配修复时，这在中央编辑区域可能是优选的，并且在使用自递送编辑寡核苷酸时特别有用。自递送寡核苷酸是指有效进入细胞内部而没有递送媒介物的化学物质，诸如gal-nac(n-乙酰-d-半乳糖胺)缀合的寡核苷酸、亲脂基团缀合的编辑寡核苷酸(美国专利申请20120065243a1)或者具有硫代磷酸酯尾部或具有约8个或更多个硫代磷酸酯键的寡核苷酸(美国专利申请20120065243a1)，其必须经过富含核酸酶的内溶酶体途径才能存活]。一旦在靶细胞细胞质中，修饰被细胞酯酶去除，释放具有被细胞同源重组和错配修复机构更好地识别的天然或更天然的结构的编辑寡核苷酸。

附图说明

图1：是由brachman,erine.和ericb.kmiec先前描述的编辑机制的示意图。

图2：显示了来自表1中提供的一些寡核苷酸的数据，通过百分比示出了编辑效率。gen3a为100013号和100014号寡核苷酸，gen3b为100015号和100016号寡核苷酸，gen3c为100017号和100018号寡核苷酸，gen1为100003号和100004号寡核苷酸，以及gen2为100005号和100006号寡核苷酸。

图3：用于腺苷转变为肌苷的具有2'-脱氧尿苷-noc-18缀合物的编辑寡核苷酸的合成，(a)含有5-羧基乙烯基-2'-脱氧尿苷残基的寡核苷酸，(b)1-羟基-2-氧代-3,3-双(2-氨基乙基)-1-三氮烯(noc-18)以及(c)2'-脱氧尿苷-noc-18缀合物。

图4：5-(4,4'-二甲氧基三苯甲基)-戊酸乙酯3-亚磷酰胺的合成。(a)3,5-双-o,o-(叔丁基二甲基甲硅烷基)戊酸的制备，(b)3,5-双-o,o-(叔丁基二甲基甲硅烷基)戊酸乙酯的制备，(c)3-羟基-5-(4,4'-二甲氧基三苯甲基)-戊酸乙酯的制备，以及(d)5-(4,4'-二甲氧基三苯甲基)-戊酸乙酯3-亚磷酰胺的制备。

图5：noc-18与含有内部戊酸残基的羧基的寡核苷酸的缀合。

图6：n²-异丁酰基-7-脱氮-7-氨甲基-2'-脱氧鸟苷的合成。(a)9-[3',5',n²-三(叔丁基二甲基甲硅烷基)-β-d-2'-脱氧呋喃糖基]-7-脱氮-7-脲基-6-氯嘌呤的制备，(b)9-β-d-2'-脱氧呋喃糖基-7-脱氮-7-脲基-6-氯嘌呤的制备，(c)7-脱氮-7-脲基-2'-脱氧鸟苷的制备，(d)7-脱氮-7-脲基-n²-异丁酰基-2'-脱氧鸟苷的制备，以及(e)7-脱氮-7-氨甲基-n²-异丁酰基-2'-脱氧鸟苷的制备。

图7：5'-二甲氧基三苯甲基-n²-异丁酰基-7-脱氮-7-(三氟乙酰胺基)甲基-2'-脱氧鸟苷3'-亚磷酰胺的合成。(a)5'-二甲氧基三苯甲基-n²-异丁酰基-7-脱氮-7-(三氟乙酰氨基)甲基-2'脱氧鸟苷的制备以及(b)5'-二甲氧基三苯甲基-n²-异丁酰基-7-脱氮-7-(三氟乙酰氨基)甲基-2'-脱氧鸟苷3'-亚磷酰胺的制备。

图8：1-(4,4-二甲氧基三苯甲基)-2-d2-三氟乙酰氨基]乙基-3-亚磷酰胺的合成。(a)2,2,2-三氟-n-[4-羟基-3-(羟甲基)丁基]乙酰胺的制备，(b)2,2,2-三氟-n-[4-二甲氧基三苯甲基-3-(羟甲基)丁基]乙酰胺的制备，以及(c)1-(4,4-二甲氧基三苯甲基)-2-[2-三氟乙酰氨基]乙基-3-亚磷酰胺的制备。

图9：2,2,2-三氟-n-(2,2,5-三氧代氧硫杂环戊烷-4-基)乙酰胺的合成。

图10：2,2,2-三氟-n-(2,2,5-三氧代氧硫杂环戊烷-4-基)乙酰胺与具有伯氨基的寡核苷酸的缀合。

图11：用于g转变为o⁶-me-g的具有2-脱氧胞嘧啶-亚硝基烷基缀合物的寡核苷酸的合成。5'-二甲氧基三苯甲基-5-(e)-(3-三氟乙酰氨基烯丙基)-n⁴-甲脒-2'-脱氧胞苷(a)的制备和5'-二甲氧基三苯甲基-5-(e)-(3-三氟乙酰氨基烯丙基)-n⁴-甲脒-2'-脱氧胞苷3'-亚磷酰胺(b)的制备。

图12：4-{[甲基(亚硝基)氨基]甲氧基}-4-氧代-丁酸的n-羟基琥珀酰亚胺(“nhs”)酯的合成。

图13：4-{[甲基(亚硝基)氨基]甲氧基}-4-氧代-丁酸的nhs酯与具有伯氨基的寡核苷酸的缀合。

图14：用于u转变为o⁴-me-u的具有2'-脱氧腺苷-亚硝基-n-甲基缀合物的编辑寡核苷酸的合成。(a)7-脱氮-7-甲氧基羰基-n⁶-苯甲酰基-2'-脱氧腺苷的制备，(b)7-脱氮-7-氨甲基-n⁶-苯甲酰基-2'-脱氧腺苷的制备，(c)5'-二甲氧基三苯甲基-n⁶-苯甲酰基-7-脱氮-7-(三氟乙酰胺基)甲基-2'-脱氧腺苷的制备，以及(d)5'-二甲氧基三苯甲基-n⁶-苯甲酰基-7-脱氮-7-(三氟乙酰氨基)甲基-2'-脱氧腺苷3'-亚磷酰胺的制备。

图15：4-{[甲基(亚硝基)氨基]甲氧基}-4-氧代-丁酸的nhs酯与含有伯氨基的修饰的寡核苷酸的缀合。

图16：使用含有亚硝胺甲基化基团的编辑寡核苷酸将mrna中的u转变为o⁴-me-u。

图17：使用含有亚硝胺甲基化基团的编辑寡核苷酸将mrna中的g转变为o⁶-me-g。

图18：使用含有亚硫酸氢盐生成基团的编辑寡核苷酸将mrna中的c转变为u。

图19：通过化学修饰被靶向的核碱基起作用的编辑寡核苷酸的实施方式的组分(大矩形代表嘧啶，以及较小矩形代表嘌呤)。

图20：主链修饰的示例性列表

图21：核碱基修饰的示例性列表

图22：糖修饰的示例性列表

图23：可以用本发明的寡核苷酸治疗的疾病和疾患的示例性列表。

图24：靶向代表性疾病和疾患相关基因的编辑寡核苷酸的示例性列表。氨基酸位置从信号肽的起始或成熟蛋白质的起始开始编号，从与靶序列的比较是清楚的。“编辑的主要结果”是在成功编辑常见靶突变或其他所需编辑后编码的所得氨基酸。注意时，编辑位点由小写序列表示。“链”相对于被转录的序列为正义。

图25：具有可选区段的编辑寡核苷酸的示意图。

具体实施方式

除非另有定义，本文使用的所有术语具有与本发明所属领域的技术人员通常理解的相同的含义。本文整个公开内容所提及的所有专利、专利申请、网站发布和出版物均通过引用以其整体并入本文。在本文术语中有多个定义的情况下，以本节定义为准。

如本文所用的，字母“g”、“c”、“a”、“t”和“u”各自通常分别代表含有鸟嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶和尿嘧啶作为碱基的核苷酸。然而，应当理解，术语“核苷酸”也可以指经修饰的核苷酸，如下面进一步详述的。在序列中可以理解如果所采用的化学物质是rna或修饰的rna，则“t”是指“u”。类似地，在序列中，“u”被理解为在dna或修饰的dna中的“t”。本领域技术人员十分清楚，鸟嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶和尿嘧啶可以被其他部分替换，而基本上不改变包含具有这种替换部分的核苷酸的寡核苷酸的碱基配对性质。例如，不限于，含有肌苷作为其碱基的核苷酸可以与含有腺嘌呤、胞嘧啶或尿嘧啶的核苷酸碱基配对。此外，例如，5-甲基c可以代替c存在于靶位点dna中或在编辑寡核苷酸中。

本文所用的术语“寡核苷酸”是指核苷酸(核糖核苷酸(rna)、脱氧核糖核苷酸(dna)或诸如肽核酸(pna)的其他替代物)的聚合形式，其是掺入以下长度范围的天然和非天然核苷酸的核碱基的聚合形式：至少8个、或一般约5个至约200个或当化学制备时最高500个，或者更常见至约100个可从许多来源(包括trilinkbiotechnologies(sandiego，ca)、exiqon(woburn，ma))商业获得的以及用本领域已知的方法所制备的寡核苷酸(oligonucleotidesynthesis：methodsandapplications(寡核苷酸合成：方法和应用)，inmethodsinmolecularbiology(分子生物学中的方法)288卷(2005)pietherdewijn(编辑)isbn：1588292339springer-verlagnewyork，llc)c或更长的寡核苷酸，integrateddnatechnologies(coralville，iowa)。在采用专门的合成方法的情况下，诸如当采用非化学合成的单链dna源时，诸如单链载体dna或来自体外转录的质粒mrna的逆转录cdna，单链编辑“寡核苷酸”或供体dna可以高达2,000个核苷酸。因此，该术语包括双链和单链dna以及单链rna。此外，寡核苷酸可以是核酸酶抗性的，并且包括但不限于2'-o-甲基核糖核苷酸，约束的核酸或锁核酸(lna)，2'氟、硫代磷酸酯核苷酸(包括手性富集的硫代磷酸酯核苷酸)，二硫代磷酸酯核苷酸，氨基磷酸酯核苷酸和甲基膦酸酯核苷酸(包括手性富集的甲基膦酸酯)。寡核苷酸还可以含有非天然核苷间键(internucleosidyllinkage)，诸如pna或吗啉基核酸(mna)中的那些。包括在短语“编辑寡核苷酸”中的上述定义是指可以进一步包含与靶序列(例如，亚硝胺)上的核苷酸反应或促进与靶序列上的核苷酸的反应的一种或多种化学修饰(例如，亚硝胺)的寡核苷酸。

本文所用的术语“核酸”是指多核苷酸化合物，其包括寡核苷酸，包含具有通过标准磷酸二酯键或其他键(linkage)共价键合的含氮杂环碱基或碱基类似物的核苷或核苷类似物。核酸包括具有2'-修饰的糖的核酸、dna、rna、嵌合dna-rna聚合物或其类似物。在核酸中，主链可以由多种键组成，包括糖-磷酸二酯键、肽-核酸(pna)键(pct申请号wo95/32305)、硫代磷酸酯键或其组合中的一者或多者。核酸中的糖部分可以是核糖、脱氧核糖或具有取代(例如，2'甲氧基和2'卤化物(例如，2'-f)、lna(或其他构象约束修饰的寡核苷酸)和una(未键合的核酸)取代)的类似化合物。

本文所用的关于核酸的术语“2'修饰的糖”是指2'f、2'氨基、2'-o-x(其中x是本领域已知的导致杂交能力寡核苷酸的修饰，包括但不限于烷基(例如，甲基、乙基或丙基)或取代的烷基，诸如甲氧基乙氧基或将2'核糖桥联到4'核糖位置的基团(即通常称为约束的核苷酸)，包括但不限于lna和cet-bna、桥联3'-ch2-或5'-ch2-、桥联3'-酰胺(-c(o)-nh-)或5'-酰胺(-c(o)-nh-)或其任何组合。

本文所用的术语“靶序列”是指待由编辑寡核苷酸修饰的细胞中的dna序列或细胞中的rna序列的核苷酸序列的连续部分。

术语“互补的”当用于描述与第二核苷酸序列相关的第一核苷酸序列时(例如编辑寡核苷酸和靶核酸)是指包含第一核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸在某些条件下与包含第二核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸杂交并形成双链体(或三链体)结构的能力，如将被技术人员理解的。优选的条件是在生物体内可能遇到的生理学相关条件，可以应用。技术人员将能够根据杂交核苷酸的最终应用来确定最适合于两个序列的互补性检验的一组条件。

杂交包括包含第一核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸与包含第二核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸在第一和第二核苷酸序列的整个长度上的碱基配对。这样的序列在本文中可以被称为相对于彼此“完全互补”，但是在本发明的编辑寡核苷酸的某些情况下，至少一个碱基与靶序列的互补碱基不同。

如本文所用的，术语“基本互补”是指本发明的寡核苷酸与靶基因组序列之间的关系，其中寡核苷酸的足够百分比的核苷酸与靶序列的核苷酸配对以促进杂交。在一些实施方式中，百分比大于百分之99、大于百分之95或大于百分之90。在一些实施方式中，百分比大于百分之80、大于百分之70或大于百分之60。

如本文所用的，术语“互补序列”还可以包括或完全由非沃森-克里克碱基对和/或由非天然和修饰的核苷酸形成的碱基对形成，只要满足上述关于其杂交能力的要求即可。

本文所用的术语“杂交(hybridization)”、“杂交(hybridize)”、“退火(anneal)”或“退火(annealing)”是指在适当条件下具有基本上互补序列的核酸通过沃森和克里克碱基配对彼此结合的能力。核酸退火或杂交技术是本领域公知的。参见例如，sambrook等人,molecularcloning:alaboratorymanual,secondedition,coldspringharborpress,plainview,n.y.(1989)；ausubel,f.m.,等人,currentprotocolsinmolecularbiology,johnwiley&sons,secaucus,n.j.(1994)，或者细胞内的生理条件。

如本文所用的术语“引入(introducinginto)细胞”、“引入(introductioninto)细胞”是指促进摄取或吸收到细胞中，如本领域技术人员所理解的。编辑寡核苷酸的吸收或摄取可以通过独立扩散或活性细胞过程或者通过助剂或辅助装置进行。该术语的意义不限于体外细胞；编辑寡核苷酸也可以被“引入细胞”，其中细胞是活生物体的一部分。在这种情况下，引入细胞将包括递送到生物体。例如，对于体内递送，可以将编辑寡核苷酸注射到组织部位或全身施用。进入细胞的体外引入包括本领域已知的方法，诸如电穿孔、微量注射、核孔化(nucleoporation)、脂质转染或弹道方法(ballisticmethod)。

当用于提及靶序列时，术语“编辑”在此是指靶基因的至少部分编辑，如由靶基因序列的变化所表现的。编辑的程度可以通过第一细胞或第一组细胞中分离rna或dna来确定，其中所述第一细胞或第一组细胞中靶基因被转录并且所述第一细胞或第一组细胞与第二细胞或第二组细胞相比已经用编辑寡核苷酸处理，所述第二细胞或第二组细胞与第一细胞或第一组细胞基本上相同但未被如此处理(对照细胞)。

可替换地，编辑程度可以根据与靶基因转录在功能上相关的参数(例如靶基因编码的由细胞分泌的蛋白质的量或显示某种表型(例如凋亡)的细胞的数量)的减少或增加来给出。原则上，可以通过任何适当的测定在任何表达靶的细胞中确定编辑。

例如，在某些情况下，通过本发明的编辑寡核苷酸的施用，在至少约0.1％、1％、3％、5％、10％、20％、25％、35％或50％的靶细胞中编辑靶基因。在具体实施方式中，通过本发明的编辑寡核苷酸的施用，在至少约60％、70％或80％的靶细胞中编辑靶基因。靶细胞通常含有两个拷贝的靶基因，并且可以对这些拷贝中的一个或两个进行编辑。在某些情况下，靶细胞仅包含一个拷贝的为编辑所靶向的基因，并因此每个细胞只能进行一次所期望的编辑。

术语“治疗(treat)”、“治疗(treatment)”等是指缓解或减轻病症。在本发明的上下文中，只要涉及下文所述的任何其他病症，术语“治疗(treat)”、“治疗(treatment)”等意味着缓解或减轻与这种病症相关的至少一种症状，或者减慢或逆转这种病症的进展，或者防止将来的疾病形成。治疗还可以包括在农业和工业应用的情况下改变生物体的性质。

如本文所用，语句“治疗有效量”和“预防有效量”是指在治疗、预防或管理病症或病症的明显症状的情况下提供治疗益处的量。治疗有效的具体量可以由普通医师容易地确定，并且可以根据本领域已知的因素而变化，诸如例如，疾病的类型、患者的病史和年龄、疾病的阶段以及可能的其他治疗剂的施用。

如本文所用的，“药物组合物”包含药理学有效量的编辑寡核苷酸和药学上可接受的载体。如本文所用的，“药理学有效量”、“治疗有效量”或简称“有效量”是指有效产生预期药理学、治疗性或预防性结果的编辑寡核苷酸的量。例如，如果在与疾病或疾患相关的可测量参数至少降低25％时将给定的临床治疗视为有效，则用于治疗该疾病或疾患的药物的治疗有效量是实现该参数降低至少25％所需的量(包括可能的多个剂量)。

术语“药学上可接受的载体”是指用于治疗剂的施用的载体。这样的载体包括但不限于盐水、缓冲盐水、葡萄糖、水、甘油、乙醇及它们的组合。对于口服施用的药物，药学上可接受的载体包括但不限于药学上可接受的赋形剂，诸如惰性稀释剂、崩解剂、粘合剂、润滑剂、甜味剂、调味剂、着色剂和防腐剂。合适的惰性稀释剂包括碳酸钠和碳酸钙、磷酸钠和磷酸钙以及乳糖，而玉米淀粉和藻酸是合适的崩解剂。粘合剂可以包括淀粉和明胶，而润滑剂(如果存在)通常是硬脂酸镁、硬脂酸或滑石。如果需要，片剂可以用诸如单硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯的材料包衣，以延迟编辑寡核苷酸在胃肠道中的吸收。

在本发明的一个方面，与基因组的dna链之一互补的单链寡核苷酸用于序列编辑(参见图19)。所期望的编辑可能是转换或颠换，或者缺失或插入。在本发明的这个方面，编辑寡核苷酸序列是完成编辑之后期望的序列。不受特定理论或机制的束缚，当在诸如转录或复制的细胞过程期间靶序列与相反的基因组链分离时，编辑寡核苷酸结合部分互补或完全互补的靶基因组dna序列。在一些情况下，编辑寡核苷酸与双链基因组dna靶的杂交可以在靶dna的“呼吸(打开，breathing)”、瞬时熔解或解开期间发生。一旦在编辑寡核苷酸和靶基因组dna链之间形成异源双链体，则通过细胞dna修复(包括同源重组(hr))来校正非完美互补区域。当使用编辑寡核苷酸作为修复模板时，所期望的编辑将被掺入靶基因组dna链。

本发明的编辑寡核苷酸包括以下片段中的一些或全部，以从5'至3'的顺序列出：5'末端片段；5'近端片段；5'编辑片段；编辑位点；3'编辑片段；3'近端片段；以及3'末端片段。这些片段通过其位置和/或化学修饰而被识别，但是被核酸主链(无论是修饰的还是天然的dna或rna)毗连地连接。

可以可选地修饰这些片段中的每一个中的核苷酸以改善编辑寡核苷酸的一种或多种以下特性：编辑效率；药代动力学特性；生物分布；血清中核酸酶稳定性；核内体/溶酶体途径中的核酸酶稳定性；细胞质和核质中的核酸酶稳定性；毒性(例如toll样受体的免疫刺激)和有效编辑所需的最小长度(例如，较短的寡核苷酸通常以较少的成本制造并且在体内更容易递送至细胞)。本文提供了这些修饰的非限制性实例。

编辑寡核苷酸可以包括上面列出的七种片段的子集或全部，并且将包括编辑位点和编辑位点5'和3'的至少一种片段。这些片段中的每一种可以可选地含有相同或不同的化学修饰以增强编辑寡核苷酸的特性，且在一些情况下，修饰在整个片段中是均匀的，并在其他情况下仅在片段中核苷酸的一部分上发生。

其他实施方式包括编辑具有可逆的电荷中和磷酸三酯主链修饰的寡核苷酸。这些修饰具有在寡核苷酸行进至靶细胞的细胞质时赋予寡核苷酸改善的递送和核酸酶稳定性的优点。一旦在靶细胞细胞质中，修饰被细胞酯酶去除，释放具有被细胞同源重组和错配修复机构更好地识别的天然或更天然结构的编辑寡核苷酸(meade,b.r.等人efficientdeliveryofrnaiprodrugscontainingreversiblecharge-neutralizingphosphotriesterbackbonemodifications.naturebiotechnology32:1256-1261(2014).doi:10.1038/nbt.3078)。

i.编辑寡核苷酸：

在某些实施方式中，本发明的编辑寡核苷酸具有根据式(i)的结构：

t5-p5-e5-se-e3-p3-t3

(i)

参见图25的公式(i)的示意图。

a.5'末端片段(t5)

5'末端片段可能比3'末端更适合于多种不同类型的修饰，因为3'末端可能在启动dna延伸中起作用，这可能将3'末端片段限制为具有一般游离的3'羟基的修饰。在5'末端通常不需要这种起动功能。可选的5'末端片段(其长度可以为零至五个核苷酸)用于阻断5'核酸外切酶，否则可能容易在体液(例如，血液或间质液)、培养基、内吞途径或者细胞质或核质中降解编辑寡核苷酸。此片段可以包含比5'近端片段(例如，反向碱基，诸如反向t)更具核酸酶抗性的非核苷酸端基封闭基团和/或一种或多种修饰的核苷酸。如果不采用5'末端片段，则5'近端片段就是编辑寡核苷酸的最5’部分。非核苷酸端基封闭基团可以包括本领域技术人员已知的用于实施该任务的任何接头，诸如例如：3'c3氨基接头、3'c7氨基接头、5'&3'c6氨基接头、5'c12氨基接头、5'可光解氨基接头、3'c3二硫键接头、5'&3'c6、二硫键接头、二巯基(dithiol)接头、4-甲酰基苯甲酰胺、醛、c8-炔-胸苷、羧基-dt接头、dade接头(5'羧基接头)、3'甘油基、5'-己炔基、胸苷-5-c2和c6氨基接头、2'-脱氧腺苷、8-c6氨基接头、2'-脱氧胞苷-5-c6氨基接头、2'-脱氧鸟苷-8-c6氨基接头、c7和内部氨基接头。接头长度可以在一个碳到约二十个碳的范围内，也可以是其他化学物质等同的长度，但优选地低于十个碳原子或十个碳等同的长度。

5'末端核苷酸核酸外切酶抗性片段可以包含一个、两个、三个或四个硫代磷酸酯修饰。除了这些一个或多个硫代磷酸酯修饰或代替它们之外，5'末端核酸外切酶抗性核苷酸可以包含2'糖修饰，已知其增强核酸外切酶的稳定性。此外，中性核苷酸类似物(诸如甲基膦酸酯、吗啉基或pna)对核酸外切酶具有高度抗性，并且在5'末端的一种、两种、三种、四种或五种这样的修饰可以用作端基封闭基团。在优选的实施方式中，5'末端是两个甲基膦酸酯(表1)。这些端基团不一定必须与靶互补。

b.5'近端片段(p5)

由于与对上述5'末端片段前面所述的一些相同的原因，5'近端片段可能比3'末端更适合多种不同类型的修饰。长度可以为1个至150个核苷酸，以及优选地长度为约五个至约二十个核苷酸。5'近端片段的主要功能是增强编辑寡核苷酸与靶序列杂交的亲和性和能力。因此，该片段可以可选地比编辑片段更实质地被修改。5'近端片段可以含有本文提及的任何寡核苷酸修饰。该片段可以包括dna或rna(可选地2'修饰的rna广泛地定义为包括lna和其他受约束的主链)。尽管在该区域中另外的硫代磷酸酯(例如，具有增强的手性纯度的二硫代磷酸酯和硫代磷酸酯)对于核酸酶稳定性不是严格要求的，但是另外的硫代磷酸酯将用于增强rna和dna键的核酸酶稳定性。同样，即使当该片段中的硫代磷酸酯对核酸酶稳定性不是必需的时，它们可增加总硫代磷酸酯含量，这由于硫代磷酸酯的化学“粘性”性质会增加血清蛋白结合和细胞结合，这导致动物和人类中的血清半衰期增加，并增强细胞质摄取。由于这些原因，在优选的实施方式中，编辑寡核苷酸的总硫代磷酸酯含量可以大于五个、十个、十五个或二十个。约二十个硫代磷酸酯的含量通常提供优异的血清蛋白结合和细胞结合/摄取。然而，因为编辑寡核苷酸的互补区中的大量(例如，多于6个)的硫代磷酸酯键可以抑制编辑效率，所以可以将硫代磷酸酯尾加到与靶dna互补的区的5'或3'末端。该尾的长度可以为1个至约4个、约5个至约9个核苷酸或约10个至约25个核苷酸，并且可优选地位于与靶不互补的区中。

c.5'编辑片段(e5)

5'编辑片段长度为1个至约十个核苷酸、或1个至约100个核苷酸、或1个至约200个核苷酸，并位于编辑位点的5'端，其足够接近编辑位点以影响导致相反的基因组dna链的编辑的细胞机构。虽然不受任何理论约束，但dna错配修复系统可以使用编辑片段(其是5'编辑片段、编辑位点和3'编辑片段)作为用于编辑的模板链。因此，5'编辑片段、编辑位点和3'编辑片段中的核苷酸优选地基本上与天然dna(例如，在图2中，化合物100013具有编辑位点5'的约8个未修饰的核苷酸，与母体化合物相比其不抑制整体编辑效率)或天然dna化学相似，并且可能未经修饰或包括一种或多种修饰，诸如硫代磷酸酯、5's、2'f、2'氨基或3's、可逆的电荷-中和磷酸三酯和核碱基修饰。

在本发明的一个优选实施方式中，编辑寡核苷酸中的一个、一些或全部的脱氧胞嘧啶被修饰为5甲基胞嘧啶，特别是在一个或多个编辑位点的5'或3'约五个至约10个碱基以内的胞嘧啶核苷。将5甲基胞嘧啶掺入编辑寡核苷酸的一个原因是在复制之后进行错配修复期间，错配修复机构将未甲基化的胞嘧啶识别为新生链，并优先地使用含有5甲基胞嘧啶的dna链作为模板链进行修复。另外，如果编辑寡核苷酸含有很少或没有5甲基胞嘧啶，那么在导致编辑的dna修复反应期间，修复机构将很可能不会选择该链作为模板。本领域编辑寡核苷酸不含有多个5-甲基胞嘧啶的事实是其编辑效率相对较低的原因之一。

在优选的实施方式中，编辑寡核苷酸在编辑位点cpg序列中具有5-甲基胞嘧啶。在更优选的实施方式中，编辑位点中的该cpg对靶序列中的tpg错配。在这种情况下，细胞的5-甲基结合蛋白将与错配的甲基化cpg结合，并导致细胞错配修复系统将错配的t转变成匹配的c。5'编辑片段可以不包含修饰或包含最高达片段中的碱基数的一种或多种修饰。

d.编辑位点(se)

编辑位点含有不与靶基因组dna互补的一种或多种核苷酸，并且其长度可以为一个至六个核苷酸，但根据需要可以更长。在转换/颠换修饰的情况下，编辑位点等于错配碱基数(例如，一个至约六个核苷酸，特别是1个)。在创建缺失的编辑的情况下，编辑位点是与靶基因组dna链进行碱基配对的两个5'和3'核苷酸之间的接合点，靶基因组dna链正好与基因组dna中的非碱基配对的核苷酸相反。在一些情况下，可以使用一种编辑寡核苷酸来处理在与群体中不同患者中发生的靶dna互补的区内的附近位点处的不同突变。在这种情况下，根据患者的突变基因型，将有不同的编辑位点。在这些情况下，编辑位点将包括5'和3'大多数突变以及这些突变之间的区。在一个优选的实施方式中，编辑位点与靶基因中的整个外显子杂交。

e.3'编辑片段(e3)

3'编辑片段除了其处于编辑位点的3'的位置以外具有与e53'编辑片段相同的特征、特性和参数的范围。

f.3'近端片段(p3)

3'近端片段除了其相对于其他片段的位置以外具有与5'近端片段相同的特征和参数的范围。在优选的实施方式中，3'近端片段由2'修饰的核苷酸组成，并且在更优选的实施方式中，其由2'f修饰的核苷酸组成。在最优选的实施方式中，其包含8个2'f修饰的核苷酸(图2)。

g.3'末端片段(t3)

3'末端片段除了下面详细说明的以外可以包括与5'末端片段相同的特征和特性的范围。3'末端片段可以用作dna复制和修复期间dna合成的引物，从而允许编辑寡核苷酸变得连续地掺入基因组dna中。因此，在一种实施方式中，该片段将具有游离的3'羟基并且可以由天然样修饰或未修饰的dna或rna制成。

尽管在3'末端的非核苷酸端基封闭基团在某些情况下可能会减少或消除编辑活性，但如果在编辑位点和编辑寡核苷酸的3'末端之间存在当编辑寡核苷酸与靶dna杂交时被rna酶h切割的rna区域，则将会产生适合作为链延伸的引物的游离的3'羟基。同样，称为错配修复的另一编辑机制可能不需要游离3'羟基或在3'末端与靶配对的编辑寡核苷酸碱基的区域。在这种情况下，3'末端片段中可以采用3'非核苷酸端基封闭基团或其他实质性修饰。这些端基封闭基团或修饰类似于或相似于上文在5'末端片段的描述中所描述的5'端封闭基团。3'特异性的修饰将改变为5'特异性部分。例如，放置在5'端上的倒置t将具有3'至5'的键。

式(i)的寡核苷酸可以包含20-2000个核苷酸。在一种实施方式中，寡核苷酸可以包含100-250个核苷酸。在另一实施方式中，寡核苷酸可以包含250-2000个核苷酸。在具体实施方式中，寡核苷酸包含20-100个核苷酸。更具体地，寡核苷酸包含25-90个核苷酸。

使用brachman和kmiec的方法的单链编辑寡核苷酸的当前设计采用未修饰的dna(其编辑效率较低)，或者每个端上的三个硫代磷酸酯，同时其余编辑寡核苷酸包含未修饰的dna，这对编辑更有效，在两种情况下具有约七十二个核苷酸的最佳长度。虽然brachman和kmiec发现在s期中处理的同步细胞被最有效地编辑(engstrom和kmiec,cellcycle7(10):1402-1414,2008)，但是现在我们知道上述kmiec的编辑寡核苷酸设计对于细胞核酸内切酶是高度敏感的。为了提高编辑效率和不需要细胞同步(例如因为稳定的编辑寡核苷酸将保持在每个细胞中，直到细胞自然地进入s期)，本发明提供具有增强的核酸酶抗性的编辑寡核苷酸。表1-3提供了这些编辑寡核苷酸的实例。通过将一种或多种核苷酸键修饰为位于5'和/或3'末端附近的硫代磷酸酯键可实现对细胞核酸内切酶的抗性的增加。在一种实施方式中，四种或更多种硫代磷酸酯键是优选的。还可以通过用硫代磷酸酯键取代除了“编辑片段”之外所有核苷酸键来实现抗性。在一些实施方式中，硫代磷酸酯修饰可以包含围绕编辑碱基(例如，与靶序列不同的碱基)的一个至七个核苷酸键。在一种实施方式中，所有的键是硫代磷酸酯dna。磷酸硫酸酯键也可以是全部地或部分地交替的，同时每隔一个键是硫代磷酸酯键，或者每第三个键是硫代磷酸酯键，或者两个硫代磷酸酯键与一个或两个磷酸二酯键等交替。编辑寡核苷酸可以包含约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的硫代磷酸酯键。这些硫代磷酸酯构型可与如本文所述的其他修饰或天然糖结合。特别地，dna糖中的一些可以用rna糖代替。优选地，rna取代将包含在3'末端开始并沿5'方向延伸的一个、两个、三个、四个、五个、七个、八个、九个或十个碱基的封闭rna键。这是为了使3'端出现为天然的冈崎片段(okazakifragment)，这将导致更自然的合成的启动和被rna酶h的去除。然而，rna修饰在“编辑片段”中不是优选的，因为不希望使编辑片段被rna酶h去除。

h.其他修饰

使编辑寡核苷酸更有效的另一方法是通过化学修饰增加亲和力。本文所述的修饰可以组合在编辑寡核苷酸中并且包括2'-o-甲基rna、2'frna和约束核酸(constrainednucleicacid)(包括lna)。这些修饰具有以下额外的优点：它们也可以减少免疫刺激。可以将修饰分组以形成用于杂交的高亲和力“种子”区。在优选的实施方式中，该种子区将位于5'近端片段中，具有约两个至约十二个连续修饰。在其他实施方式中，种子区可以位于3'近端片段中。在不太优选的实施方式中，修饰可以位于“编辑片段”中。这不太优选，因为编辑片段必须与细胞修复机构相互作用，并且此片段中的某些修饰可能会干扰修复。修饰可以是在5'片段、编辑片段和/或3'片段中的交替或是每第三个或第四个键。5'片段、3'片段或编辑片段中的化学修饰的核碱基的总比例可以从约20％、30％、50％、60％、70％、80％、90％或100％独立地变化。

本文提供了式(i)的寡核苷酸的各种实施方式。在一种实施方式中，式(i)是rna。在另一实施方式中，式(i)是dna。在一具体的实施方式中，式(i)是单链的。在一种实施方式中，式(i)是未修饰的。在一种实施方案中，式(i)是经化学修饰的。化学修饰包括糖修饰(特别是例如，2'-o-甲基和2'-氟)。在一种实施方式中，式(i)包含主链修饰。在另一实施方式中，式(i)包含主链修饰，如本文所述的。在另一实施方式中，式(i)包含接头，如本文所述的。在另一实施方式中，式(i)还包含缀合分子(例如，n-乙酰-d-半乳糖胺或亲脂性修饰)。上述修饰可以以各种组合存在。例如，一种、两种或三种主链修饰可以与一种、两种或三种糖修饰和/或接头和/或缀合分子一起存在。

本发明的某些寡核苷酸包含与靶序列上的核苷酸反应或促进其与靶序列上的核苷酸的反应的一种或多种化学修饰。此类反应的实例包括烷基化、乙酰化、交联、胺化、脱胺、产生游离的(非共价结合的)反应性化合物。

本发明的寡核苷酸可以包含保护基团。合适的保护基团是本领域技术人员已知的，以在合成、纯化、储存期间和在使用过程中保护化学反应性基团(例如，以保护寡核苷酸免受包括酸性、细胞内酯酶或还原条件的条件)。虽然仅使用单个寡核苷酸来实现编辑是方便的，但是对本文的实施方式的某些增强包括另外的寡核苷酸。使用一种“辅助”寡核苷酸或多种“辅助”寡核苷酸，其中一种或多种“辅助”寡核苷酸是指将与编辑寡核苷酸串联结合(例如，在两种辅助寡核苷酸的情况下在3'端、5'端或两端或更远离编辑寡核苷酸结合位点，例如编辑位点5'或3'的200个核苷酸)的寡核苷酸。辅助寡核苷酸将帮助打开靶位点的结构，或以其他方式提高编辑寡核苷酸的结合效率。辅助寡核苷酸的另一靶可能是由编辑序列靶向的dna链的相反链。在这种情况下，一种或多种辅助寡核苷酸优选地仅结合编辑寡核苷酸的结合位点的5'和/或3'，从而不与编辑寡核苷酸本身强烈杂交。在其他实施方式中，5'和/或3'辅助寡核苷酸与编辑寡核苷酸结合位点重叠约1-5个、约5-10个或约1-15个碱基。以这种方式，辅助寡核苷酸不会太紧密地结合编辑寡核苷酸而不利地影响编辑寡核苷酸结合靶。这些辅助寡核苷酸可以可选地通过磷酸二酯或修饰的磷酸二酯键或通过其他共价接头共价地键合到编辑寡核苷酸。在另一实施方式中，形成寡核苷酸或寡核苷酸类似物的三链体在编辑位点的约200个核苷酸内结合到靶dna，从而导致提高了编辑效率(mcneer,n.a.等人,naturecomm.doi:10.1038/ncomms7952pgs.1-11,2015),bahal等人currentgenetherapy14(5)pp331-42(2014),chin等人pnas105(36):13514-13519(2008),rogers等人pnas99(26):16695–16700(2002),以及美国专利8,309,356.)。

一些辅助寡核苷酸保护与编辑寡核苷酸互补的寡核苷酸，并通过单链特异性核酸酶阻断核酸酶降解。保护性寡核苷酸覆盖编辑寡核苷酸的全部或所期望的部分。它们通常短于编辑寡核苷酸，使得编辑寡核苷酸的一部分保持单链，并因此可用于与靶dna杂交。在一种实施方式中，保护寡核苷酸由与编辑寡核苷酸的dna部分互补的一些或所有rna区域组成，使得它们可以在细胞中被rna酶h去除，以暴露编辑寡核苷酸更多的单链区。

i.外源蛋白

虽然在编辑组合物中不严格地需要外源蛋白是有利的，但是通过保护编辑寡核苷酸免于核酸酶降解并通过增强编辑寡核苷酸与靶基因组dna的结合，某些外源蛋白可以增强上述实施方式。一种或多种以下蛋白质或核糖核蛋白可以与编辑寡核苷酸一起加入：包括锌指核酸酶的可设计的核酸酶(carrolld.genetics188:773e82.(2011))，talen，大型talen，其他归巢核酸内切酶、crispr-cas9(jinek等人elife2013；2:e00471)，或已被选择通过减少dna结合亲和力而增加靶特异性的同源或类似作用的核糖核蛋白(即cpf1、c2c1或c2c3)(包括其突变形式)(espcas9,slaymaker等人,rationallyengineeredcas9nucleaseswithimprovedspecificity,science(2015))，以及已被选择以耐受crrna区中更多的dna取代使得“crrna”可以作为用于编辑的供体dna的突变形式，以及其中cas9核酸酶灭活的突变形式，reca，λ噬菌体β蛋白(美国专利号7,566,535)，ssdna结合蛋白，rad或argonaut。

蛋白质可以与编辑寡核苷酸分开制备，纯化，然后与一种或多种编辑寡核苷酸预先复合(kim等人genomeres.24:1012e9(2014))，或者蛋白质可以在靶细胞/组织中表达。外源蛋白在细胞或组织中的表达可以用本领域已知的方法进行，所述方法包括基因治疗载体、裸dna转染或mrna转染。

在cas9的情况下，优选的实施方式是施展具有通过本领域已知的突变而失活的两个核酸酶结构域的cas9。crrna优选与tracrna分离并具有所期望的编辑序列。crrna还具有在如本文所定义的编辑位点中且可选地在编辑位点周围被取代的至少一个和至多约十五个dna键。以这种方式，由cas9驱动的增强的杂交形成将在功效上增强brachmankmiec型基因组编辑或采用含有化学反应性基团的寡核苷酸的编辑的特异性和非染色体切割优势，所述化学反应性基团如本文所述修饰靶核碱基以改变其编码。在另一实施方式中，使用编辑寡核苷酸将crrna或tracrna的约18个核苷酸的引导rna部分延伸至5'或3'。编辑寡核苷酸可以是未修饰的或具有本文所述的各种修饰。编辑寡核苷酸将通过磷酸二酯(或磷酸二酯类似物)键或化学接头共价地或者通过碱基配对于crispr引导rna的一部分或crispr引导rna的延伸部分非共价地附着至crrna或tracrna引导。在优选的实施方式中，编辑寡核苷酸部分将与互补于tracrna或crrna的引导部分的序列连续地杂交，将具有靶dna的双链体延伸至被靶向的突变的区域中。由于cas-9/crispr增强了链侵入的效率，这种方法将比不使用crispr-cas9的寡核苷酸导向基因组方法更有效。这种方法比常见的切割被靶向的染色体并且需要单独的供体寡核苷酸的cas-9/crispr方法更具选择性和简单性。

在每种情况下，可以通过用药物处理靶细胞或生物体来可选地增强编辑效率，所述药物使细胞在暴露于编辑寡核苷酸期间或之前在s期同步，减慢复制叉(erine.brachman和ericb.kmiecdnarepair4:445–457(2005)，或以其他方式增加同源dna修复机构的表达和/或活性，诸如羟基脲、hdac抑制剂或喜树碱(ferrara和kmiecnucleicacidsresearch,32(17):5239–5248,2004)。

本文所述的化学修饰的编辑寡核苷酸可用作同源重组编辑的供体寡核苷酸。尽管具有crispr-cas9的精确编辑使用供体dna，但crispr-cas9通常不与本文所述的化学修饰的供体dna一起使用。用于增强化学修饰的“供体”编辑寡核苷酸的同源重组效率的另一方法是在靶突变附近添加pna-钳(pna-clamp)(schleifman等人,chem.biol.18(9):1189-1198,2011)。虽然glazer已经使用具有第二代编辑化学品的这种技术(例如在供体dna寡核苷酸的两端之一上的三个磷酸硫酸酯修饰)，但pna-钳没有与本文描述和参考的第三代更严格修饰的供体dna一起被使用。(bahal等人currentgenetherapy14(5):331-42(2014)，chin等人pnas105(36):13514-13519(2008)，rogers等人pnas99(26):16695–16700(2002)和美国专利8,309,356。)

j.合成

关于要用作本发明的编辑寡核苷酸的特定寡核苷酸的合成的教导可以在以下美国专利中找到：美国专利号5,138,045和5,218,105，涉及多胺缀合的寡核苷酸；美国专利号5,212,295，涉及用于制备具有手性磷键的寡核苷酸的单体；美国专利号5,378,825和5,541,307，涉及具有修饰的主链的寡核苷酸；美国专利号5,386,023，涉及主链修饰的寡核苷酸以及其通过还原偶联的制备；美国专利号5,457,191，涉及基于3-脱氮嘌呤环体系的修饰的核碱基及其合成方法；美国专利号5,459,255，涉及基于n-2取代嘌呤的修饰核碱基；美国专利号5,512,302，涉及用于制备具有手性磷键的寡核苷酸的过程；美国专利号5,539,082，涉及肽核酸；美国专利号5,554,746，涉及具有β-内酰胺主链的寡核苷酸；美国专利号5,571,902，涉及合成寡核苷酸的方法和材料；美国专利号5,578,718，涉及具有烷硫基的核苷，其中这样的基团可以用作在核苷的多种位置中任一位置处附着的其他部分的接头；美国专利号5,587,361和5,599,797，涉及具有高手性纯度的硫代磷酸酯键的寡核苷酸；美国专利号5,506,351，涉及用于制备2'-o-烷基鸟苷和相关化合物(包括2,6-二氨基嘌呤化合物)的方法；美国专利号5,587,469，涉及具有n-2取代嘌呤的寡核苷酸；美国专利号5,587,470，涉及具有3-脱氮嘌呤的寡核苷酸；美国专利号5,223,168和美国专利号5,608,046，均涉及缀合的4'-去甲基核苷类似物；美国专利号5,602,240和5,610,289，涉及主链修饰的寡核苷酸类似物；美国专利号6,262,241和5,459,255，尤其涉及合成2'-氟-寡核苷酸的方法。

将2'-o-甲基、2'-o-乙基、2'-o-丙基、2'-o-烯丙基、2'-o-氨基烷基或2'-脱氧-2'-氟基团掺入到寡核苷酸的核苷对寡核苷酸赋予增强的杂交特性。此外，含有硫代磷酸酯主链的寡核苷酸具有增强的核酸酶稳定性。因此，本发明的官能化键合的核苷可进一步修饰为包括lna、约束糖、2'-脱氧-2'-氟基团、硫代磷酸酯主链和/或2'修饰的糖，其中糖可以被修饰为包括2'-o-甲基、2'-o-乙基、2'-o-丙基、2'-o-氨基烷基、2'-o-烯丙基或2'-甲氧基乙氧基。

k.保护基团

在许多情况下，在制备本发明化合物期间使用保护基团。如本文所用的，术语“受保护的”是指所指出的部分具有附着在其上的保护基团。在本发明的一些优选实施方式中，化合物含有一种或多种保护基团。在本发明的方法中可以采用多种保护基团。通常，保护基团致使化学官能团对特定反应条件产生惰性，并且可以在分子中附加至这些官能团和从这些官能团除去，而基本上不会破坏分子的其余部分。

代表性的羟基保护基团，例如，由beaucage等人公开(tetrahedron,48:2223-2311,1992)。其他羟基保护基团以及其他代表性的保护基团公开于greene和wuts,protectivegroupsinorganicsynthesis,chapter2,2ded.(有机合成中的保护基团，第二章，第二版),johnwiley&sons,newyork,1991，以及oligonucleotidesandanaloguesapracticalapproach,ekstein,f.ed.,irlpress,n.y,1991。

羟基保护基团的实例包括但不限于叔丁基、叔丁氧基甲基、甲氧基甲基、四氢吡喃基、1-乙氧基乙基、1-(2-氯乙氧基)乙基、2-三甲基甲硅烷基乙基、对氯苯基、2,4-二硝基苯基、苄基、2,6-二氯苄基、二苯基甲基、p,p'-二硝基二苯甲基、对硝基苄基、三苯基甲基、三甲基甲硅烷基、三乙基甲硅烷基、叔丁基二甲基甲硅烷基、叔丁基二苯基甲硅烷基、三苯基甲硅烷基、苯甲酰甲酸酯、乙酸酯、氯乙酸酯、三氯乙酸酯、三氟乙酸酯、新戊酸酯(pivaloate)、苯甲酸酯、对苯基苯甲酸酯、9-芴基甲基碳酸酯、甲磺酸酯和甲苯磺酸酯。

对酸处理稳定的氨基保护基团通过碱基处理选择性地除去，并且用于制备选择性地可用于取代的反应性氨基。这些基团的实例是fmoc(e.atherton和r.c.sheppardinthepeptides,s.udenfriend,j.meienhofer,eds.,academicpress,orlando,1987,volume9,p.1)和各种取代的磺酰乙基氨基甲酸酯，例如nsc基团(samukov等人,tetrahedronlett.,35:7821,1994；verhart和tesser,rec.trav.chim.pays-bas,107:621,1987)。

另外的氨基保护基团包括但不限于：氨基甲酸酯保护基团，诸如2-三甲基甲硅烷基乙氧基羰基(teoc)、1-甲基-1-(4-联苯基)乙氧基羰基(bpoc)、叔丁氧基羰基(boc)、烯丙氧基羰基(alloc)、9-芴基甲氧基羰基(fmoc)和苄氧羰基(cbz)；酰胺保护基团，诸如甲酰基、乙酰基、三卤代乙酰基、苯甲酰基和硝基苯基乙酰基；磺酰胺保护基团，诸如2-硝基苯磺酰基；以及亚胺和环状酰亚胺保护基团，诸如苯二甲酰亚氨基和二硫代琥珀酰基。这些氨基保护基团的等同物也包括在本发明的化合物和方法中。

l.固体支持物

许多固体支持物是可商购的，并且本领域普通技术人员可以容易地选择固体支持物以用于固相合成步骤中。在某些实施方式中，使用通用支持物。通用支持物允许制备具有位于寡核苷酸3'末端的异常或修饰的核苷酸的寡核苷酸。通用支持物500和通用支持物ii是可从glenresearch，22825davisdrive，sterling，va商业获得的通用支持物。有关通用支持物的更多详细信息，请参见scott等人,innovationsandperspectivesinsolid-phasesynthesis,3rdinternationalsymposium,1994,ed.rogerepton,mayflowerworldwide,115-124]；azhayev,a.v.tetrahedron,55,787-800,1999；以及azhayev和antopolskytetrahedron,57,4977-4986,2001。此外，已报道，当寡核苷酸通过更容易经历碱性水解的顺(syn)-1,2-乙酰氧基磷酸酯基团键合到固体支持物时，寡核苷酸可以在较温和的反应条件下从通用支持物上被切割。参见guzaev,a.i.；manoharan,m.j.am.chem.soc.,125:2380,2003。

设想用在本发明的配体缀合的寡核苷酸中的优选修饰的寡核苷酸的具体实例包括含有修饰的主链或非天然核苷间键的寡核苷酸，诸如肽核酸(pna)、吗啉基核酸(mna)或其他修饰的主链。如本文所定义的，具有修饰的主链或核苷间键的寡核苷酸包括在主链中保留磷原子的那些和在主链中不具有磷原子的那些。为了本发明的目的，在修饰的寡核苷酸的糖间(intersugar)主链中不具有磷原子的修饰的寡核苷酸也可以被认为是寡核苷酸。

具体的寡核苷酸化学修饰如下所述。给定化合物中的所有位置不必均匀地修饰。相反，可以在单个编辑寡核苷酸化合物中或甚至在其单个核苷酸中掺入多于一种的修饰。

m.核苷酸间键合

优选的修饰的核苷间键合或主链包括，例如，硫代磷酸酯，手性硫代磷酸酯，二硫代磷酸酯，磷酸三酯，氨基烷基磷酸三酯，甲基和其他烷基膦酸酯(包括3'-亚烷基膦酸酯和手性膦酸酯)，次膦酸酯，包括3'-氨基氨基磷酸酯和氨基烷基氨基磷酸酯的氨基磷酸酯，硫代氨基磷酸酯，硫代烷基磷酸酯，硫代烷基磷酸三酯，和具有正常3'-5'键的硼烷基磷酸酯、其2'-5'键合的类似物以及具有相反极性的那些，其中3'-5'至5'-3'或2'-5'至5'-2'键合相邻的核苷单位对。还包括各种盐、混合盐和游离酸形式。还参见图20。

关于制备上述含磷原子的键的代表性的美国专利包括但不限于美国专利号3,687,808；4,469,863；4,476,301；5,023,243；5,177,196；5,188,897；5,264,423；5,276,019；5,278,302；5,286,717；5,321,131；5,399,676；5,405,939；5,453,496；5,455,233；5,466,677；5,476,925；5,519,126；5,536,821；5,541,306；5,550,111；5,563,253；5,571,799；5,587,361；5,625,050；以及5,697,248，其各自通过引用并入本文。

不包括磷原子在其中的优选的修饰核苷间键或主链(即，寡核苷酸)具有由短链烷基或环烷基糖间键、混合杂原子和烷基或环烷基糖间键或者一种或多种短链杂原子的或杂环的糖间键所形成的主链。这些包括具有可能部分由核苷的糖部分形成的吗啉基键的那些；硅氧烷主链；硫化物、亚砜和砜主链；甲酰乙酰和硫代甲酰乙酰基主链；亚甲基甲酰乙酰基和硫代甲酰乙酰主链；含烯烃的主链；氨基磺酸酯主链；亚甲基亚氨基和亚甲基肼基主链；磺酸酯和磺酰胺主链；酰胺主链；以及具有混合n、o、s和-ch2组分部分的其他主链。

关于制备上述寡核苷酸的代表性的美国专利包括但不限于美国专利号5,034,506；5,166,315；5,185,444；5,214,134；5,216,141；5,235,033；5,264,562；5,264,564；5,405,938；5,434,257；5,466,677；5,470,967；5,489,677；5,541,307；5,561,225；5,596,086；5,602,240；5,610,289；5,602,240；5,608,046；5,610,289；5,618,704；5,623,070；5,663,312；5,633,360；5,677,437；以及5,677,439。参见图20的可能的主链修饰的列表。

n.核苷模拟物

在其他优选的寡核苷酸模拟物中，核苷单位的糖和核苷间键(即主链)都被新的基团取代。维持核碱基单位以与合适的核酸靶化合物杂交。已经显示具有优异杂交特性的一种这样的寡核苷酸(寡核苷酸模拟物)被称为肽核酸(pna)。在pna化合物中，寡核苷酸的糖主链被含酰胺的主链特别是氨基乙基甘氨酸主链取代。核碱基被保留并且直接或间接地结合于主链的酰胺部分的原子。教导pna化合物制备的代表性的美国专利包括但不限于美国专利号5,539,082、5,714,331和5,719,262。pna化合物的更多教导可发现于nielsen等人,science,254:1497,1991。

本发明的一些优选实施方式采用具有硫代磷酸酯键的寡核苷酸和具有杂原子主链的寡核苷酸，特别是以上引用的美国专利号5,489,677的-ch2-nh-o-ch2-、-ch2-n(ch3)-o-ch2-(称为亚甲基(甲基亚氨基)或mmi主链)、-ch2-o-n(ch3)-ch2-、-ch2-n(ch3)-n(ch3)-ch2-和-o-n(ch3)-ch2-ch2-(其中天然磷酸二酯主链表示为-o-p-o-ch2-)以及以上引用的美国专利号5,602,240的酰胺主链。还优选的是具有以上引用的美国专利号5,034,506的吗啉基主链结构的寡核苷酸，参见图20。

o.核碱基修饰

在本发明的编辑寡核苷酸中采用的寡核苷酸可另外地或可替换地包含核碱基修饰或取代。如本文所用的，“未修饰的”或“天然的”核碱基包括嘌呤碱基腺嘌呤(a)和鸟嘌呤(g)，以及嘧啶碱基胸腺嘧啶(t)、胞嘧啶(c)和尿嘧啶(u)。修饰的核碱基包括其他合成的和天然的核碱基，诸如5-甲基胞嘧啶(5-me-c)、5-羟甲基胞嘧啶、黄嘌呤、次黄嘌呤，2-氨基腺嘌呤、腺嘌呤和鸟嘌呤的6-甲基以及其他烷基衍生物、腺嘌呤和鸟嘌呤的2-丙基以及其他烷基衍生物、2-硫尿嘧啶、2-硫代胸腺嘧啶和2-硫代胞嘧啶、5-卤尿嘧啶和胞嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶和胞嘧啶、6-偶氮尿嘧啶、胞嘧啶和胸腺嘧啶、5-尿嘧啶(也称为假尿嘧啶)、4-硫尿嘧啶、8-卤代，8-氨基、8-巯基、8-硫代烷基、8-羟基和其他8-取代的腺嘌呤和鸟嘌呤、5-卤代(特别是5-溴)、5-三氟甲基和其他5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶、7-甲基鸟嘌呤和7-甲基腺嘌呤、8-氮杂鸟嘌呤和8-氮杂腺嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤和7-脱氮腺嘌呤以及3-脱氮鸟嘌呤和3-脱氮腺嘌呤。也参见图21和22。

关于制备某些上述修饰的核碱基以及其他修饰的核碱基的代表性的美国专利包括美国专利号3,687,808、4,845,205；5,130,302；5,134,066；5,175,273；5,367,066；5,432,272；5,457,187；5,459,255；5,484,908；5,502,177；5,525,711；5,552,540；5,587,469；5,594,121、5,596,091；5,614,617；5,681,941；以及5,808,027。

在某些实施方式中，本文提供的反义化合物或其指定部分为或至少为70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％互补于靶核酸、靶区域、靶片段或其指定部分。参见图21的可能的核碱基修饰的列表。

p.互补性

当足够数量的寡核苷酸核碱基可以与靶核酸的相应核碱基氢键合时，编辑寡核苷酸和靶核酸彼此互补，从而将产生期望的效果(例如，允许杂交后发生所期望的碱基修饰)。

只要剩余的编辑寡核苷酸能够与靶核酸特异性杂交，则可以耐受编辑寡核苷酸和靶核酸之间的非互补核碱基。在某些实施方式中，本文提供的编辑寡核苷酸或其指定部分为或至少为70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％互补于靶核酸或其指定部分。使用常规方法可以确定编辑寡核苷酸与靶核酸的互补性百分比。例如，其中20个核碱基中的16个与靶核酸互补且因此将特异性杂交的编辑寡核苷酸将表示80％的互补性。在该实例中，剩余的非互补核碱基可以被聚集或散布有互补核碱基并且不需要彼此邻接或与互补核碱基邻接。它们可以在编辑寡核苷酸的5'端、3'端或内部位置。在另一实例中，如下的编辑寡核苷酸将具有与靶核酸的94.4％整体互补性，并将因此将落入本发明的范围内：所述编辑寡核苷酸长度为18个碱基，具有1个(一个)非互补核碱基，所述非互补核碱基的侧翼是与靶核酸完全互补的两个寡核苷酸。

编辑寡核苷酸与靶核酸区的互补性百分比可以使用本领域已知的blast程序(基本局部比对检索工具)和powerblast程序常规地确定(altschul等人,j.mol.biol.,215:403410,1990；zhang和madden,genomeres.,7:649-656,1997)。也可以使用利用默认设置，利用smith和waterman的算法(adv.appl.math.,2:482-489,1981)的gap程序(wisconsinsequenceanalysispackage,version8forunix,geneticscomputergroup,universityresearchpark,madisonwi)。

ii.作用的方式

a.杂交

编辑寡核苷酸和靶核酸之间的杂交可以在不同的严格条件下发生，是序列依赖性的，并且由待杂交的核酸分子的性质和组成决定。最常见的杂交机制涉及核酸分子的互补核碱基之间的氢键(例如，watson-crick，hoogsteen或反向的hoogsteen氢键)。

确定序列是否与靶核酸特异性杂交的方法是本领域公知的。在某些实施方式中，本文提供的编辑寡核苷酸是与靶核酸可特异性杂交的。

b.靶向结合

本发明的编辑寡核苷酸被设计为靶向dna或rna。一种或多种编辑核苷酸可以在一侧或两侧侧翼具有与靶核酸完全互补或基本上互补的寡核苷酸。

优选的结合方法是通过导致与dna的watson或crick链杂交的链置换，或者当rna是靶时通过反义编辑寡核苷酸与正义rna链杂交。

c.编辑寡核苷酸

编辑寡核苷酸可以可选地含有将递送部分共价附着至寡核苷酸的“接头”。接头可以附着至编辑寡核苷酸中的任何核碱基，到5'末端、到3'末端、到糖残基或者到主链。接头可以是本领域技术人员已知的用于执行该任务的任何接头。可替换地，可以使用和检验接头以确定其在编辑寡核苷酸中的表现。例如，可用于本发明的接头包括：3'c3氨基接头、3'c7氨基接头、5'和3'c6氨基接头、5'c12氨基接头、5'可光解氨基接头、3'c3二硫键接头、5'和3'c6二硫键接头、二巯基接头、4-甲酰基苯甲酰胺醛、c8-炔-胸苷、羧基-dt接头，dade接头(5'羧基接头)、3'甘油基、5'己炔基(hexynyl)、胸苷-5-c2和c6氨基接头、2'-脱氧腺苷、8-c6氨基接头、2'-脱氧胞苷-5-c6氨基接头、2'-脱氧鸟苷-8-c6氨基接头、c7、内氨基接头、可光解接头或含有嵌入物的接头，其中嵌入基团用于定位在被靶向核碱基附近的反应性基团。接头长度可以在1个碳至约20个碳的范围内或其他化学成分等同的长度，但优选地低于10个碳或10个碳等同的长度。

在编辑的化学修饰模式的情况下，用编辑寡核苷酸的成功处理导致“靶核酸”的一些部分被修饰。

在编辑的化学修饰模式的情况下，由单个核苷酸变化产生的核酸序列中的突变可以是转变或颠换。当点突变将嘌呤核苷酸改变为另一嘌呤核苷酸(诸如腺苷改变为鸟苷)或者将嘧啶核苷酸改变为另一嘧啶核苷酸(诸如胞苷改变为胸苷)时，转换发生。

当在遗传密码中出现转换或颠换时，它们可以通过干扰mrna的产生或通过在翻译期间引入蛋白质的氨基酸序列的变化直接影响由mrna表达的蛋白质。dna中提供的转录成mrna的信息提供了翻译成蛋白质的核酸的离散片段(discretesegment)或长度。此外，这些片段包含控制元件，其指示翻译应在何处开始和结束，使得核糖体能够产生具有适当氨基酸序列的蛋白质。沿着mrna的产生终止密码子的点突变发出翻译终止信号，并且可以阻止产生所期望的蛋白质或导致翻译的提前终止从而产生非功能性蛋白质。虽然起始密码子需要附近的序列或启动因子来开始翻译，但是单独的终止密码子足以启动终止。

本发明提供了将被靶向的序列返回到野生型或等同物的对点突变的校正，修饰点突变使得密码子虽然不是野生型但是翻译为合适的氨基酸，或者修饰点突变使得终止密码子变成允许产生蛋白质的通读密码子。可转变为mrna中的通读密码子的点突变的实例包括转换5'uaa至caa；5'uag至cag或ugg或5'uga至cga或ugg以及在dna中为5'taa至caa；3'att至gtt；5'tag至cag或tgg；3'atc至gtc或acc；5'tga至cga或tgg；以及3'act至gct或acc。

当点突变发生在mrna的蛋白质翻译片段中时，所得到的密码子可以被读取为不同的氨基酸。例如，可以由腺嘌呤至鸟嘌呤颠换产生的具体密码子变化包括：蛋氨酸至缬氨酸；酪氨酸至半胱氨酸；组氨酸至精氨酸；谷氨酰胺至精氨酸；天冬氨酸至丝氨酸；赖氨酸至精氨酸；天冬氨酸至甘氨酸；以及谷氨酸至甘氨酸。此外，终止密码子可以突变为氨基酸密码子，诸如amber终止突变为色氨酸或uga终止密码子突变为色氨酸。

当dna或rna中发生点突变时，诸如例如t至c转换，转录后翻译可改变所得蛋白质中的氨基酸。例如，从t到c的变化可能导致以下氨基酸变化：苯丙氨酸至亮氨酸；半胱氨酸至精氨酸；色氨酸至精氨酸；苯丙氨酸至丝氨酸；酪氨酸至组氨酸；异亮氨酸至苏氨酸；蛋氨酸至苏氨酸；缬氨酸至丙氨酸；六个连续丝氨酸中的四个至脯氨酸；四个连续亮氨酸中的两个至丝氨酸；或六个亮氨酸中的四个至脯氨酸。此外，终止密码子可以突变为氨基酸密码子，诸如uaa或uag终止密码子突变为色氨酸或者uga终止密码子突变为精氨酸。

d.通过被靶向的核碱基的化学修饰进行编辑

图19示出了利用本发明的编辑寡核苷酸的编辑化学修饰模式的编辑机制。编辑寡核苷酸的长度可以根据编辑过程的若干物理方面而变化，包括例如用于执行编辑的化学类型、要在靶上执行的编辑类型和接头的长度。

化学修饰编辑方法中的编辑寡核苷酸包含至少三种成分，其包括“引导寡核苷酸”、将“序列修饰反应性基团”共价附着至“引导寡核苷酸”的“接头”。在图19中，示出接头附着至编辑寡核苷酸的核碱基。然而，可以附着至编辑寡核苷酸中的任何核碱基、到5'末端、到3'末端、到糖残基或者到主链。接头可以是本领域技术人员已知的用于执行该任务的任何接头。可替换地，可以使用和检验接头以确定其在编辑寡核苷酸中的表现。例如，可用于本发明的接头包括：3'c3氨基接头、3'c7氨基接头、5'和3'c6氨基接头、5'c12氨基接头、5'可光解氨基接头、3'c3二硫键接头、5'和3'c6二硫键接头、二巯基接头、4-甲酰基苯甲酰胺醛、c8-炔-胸苷、羧基-dt接头，dade接头(5'羧基接头)、3'甘油基、5'己炔基、胸苷-5-c2和c6氨基接头、2'-脱氧腺苷、8-c6氨基接头、2'-脱氧胞苷-5-c6氨基接头、2'-脱氧鸟苷-8-c6氨基接头、c7、内氨基接头、可光解接头或含有嵌入物的接头，其中嵌入基团用于定位在被靶向的核碱基附近的反应性基团。接头长度可以在1个碳至约20个碳的范围内或其他化学成分等同的长度，但优选地低于10个碳或10个碳等同的长度。

用化学修饰模式的编辑寡核苷酸成功处理导致“靶核酸”的一些部分被修饰。在图19中，“化学修饰”(三角形)表示化学部分(例如甲基)的添加，但是如本文所述的修饰可以是从靶核酸序列的被靶向的核碱基中的化学基团的多种添加或去除之一(例如脱氨)。

由单个核苷酸变化产生的核酸序列中的突变可以是转换或颠换。当点突变将嘌呤核苷酸改变为另一嘌呤核苷酸(诸如腺苷改变为鸟苷)或者将嘧啶核苷酸改变为另一嘧啶核苷酸(诸如胞苷改变为胸苷)时，转换发生。转换可以由氧化脱氨、互变异构和烷基化试剂的作用引起。当嘌呤核苷酸转变为嘧啶核苷酸或者嘧啶核苷酸转变为嘌呤核苷酸(诸如例如胞苷转变为腺苷以及鸟苷转变为胸苷)时，颠换发生。电离辐射和烷基化试剂的作用可能引起颠换。

本发明提供了可以减少或消除由多种突变引起的影响的编辑寡核苷酸。例如，如果突变是转换突变，则潜在的编辑功能可能包括：a到g样的转变，其可以通过一氧化氮介导的处于位置6的腺嘌呤碱基的脱氨基来实现，导致形成优选地与胞嘧啶配对的肌苷；g到a样的转变，其可以通过鸟嘌呤碱基的o6-烷基化来实现，得到o6-烷基鸟嘌呤，其优选地与尿嘧啶或胸腺嘧啶碱基配对；c到t样的转变，其可以通过一氧化氮介导的或亚硫酸盐介导的处于位置4的胞嘧啶碱基的脱氨基来实现，导致形成与腺嘌呤碱基配对的尿嘧啶；以及t或u到c样的转变，其可以通过胸腺嘧啶或尿嘧啶碱基的o4-烷基化来实现，得到4-烷基胸腺嘧啶碱基或4-烷基尿嘧啶碱基，其优选地与鸟嘌呤碱基配对。

如果突变是颠换突变，则潜在的编辑功能可能包括：a到c样的转变是与苯并[a]芘反应以产生腺嘌呤碱基的加合物，得到被t7rna聚合酶绕过(bypass)的腺嘌呤的n6-苯并[a]芘二醇环氧化物(bpde)加合物，t7rna聚合酶指导g相对的修饰的腺嘌呤的高概率错误掺入；a至t样的转变是与苯并[a]芘反应以产生腺嘌呤碱基的加合物，得到被t7rna聚合酶绕过的腺嘌呤的n6-苯并[a]芘二醇环氧化物(bpde)加合物，t7rna聚合酶指导a相对的修饰的腺嘌呤的高概率错误掺入；以及g到t样的转变可以通过将g氧化成8-氧代-g来进行，这导致a被rna聚合酶约50％掺入到与8-氧代-g修饰相对的rna链中。

e.化学

采用本发明的化学修饰模式的编辑寡核苷酸通过各种特定化学反应(包括烷基化和脱氨基)执行其功能。在每种类型的反应中，可以使用可选的反应性基团来提高特异性(singh,等人theresurgenceofcovalentdrugsnaturereviews:drugdiscoveryvolume10april2011)，避免在合成、纯化和储存期间的反应性，并且达到靶细胞之前通过ph(诸如内涵体或溶酶体中的低ph)、细胞内酯酶、温度、光或细胞的还原性环境可以释放反应性基团。

f.编辑作用

本发明提供了可以减少或消除由多种突变引起的影响的编辑寡核苷酸。

在本发明的一个实施方式中，可以校正在西方人群中引起囊性纤维化的常见突变序列δf508。可以通过用编辑寡核苷酸插回缺失的3个核苷酸来实现对如δf508的缺失突变的修复。mcneer，n.a.等人(naturecomm.doi:10.1038/ncomms7952pgs.1-11,2015)提供了在每端上具有三个硫代磷酸酯修饰的编辑寡核苷酸的实例。靶向相同区的具有本发明的编辑寡核苷酸的改进的化学修饰模式和构型的寡核苷酸可以代替在每端上具有三个硫代磷酸酯修饰的编辑寡核苷酸，类似于mcneer等人使用的寡核苷酸。然而，与插入相比，通过编辑可以更有效地实现单碱基转换或颠换，因此在cf蛋白编码序列中从r553到m(r553m)的变化是纠正这种突变的表型效应另一种替换方法，该变化抑制了δf508突变的有害作用(x.liu1等人biochemistry51(25):5113–5124,2012.doi:10.1021/bi300018e。这是治疗性编辑第一次应用于产生δf508的抑制突变。

在cf蛋白编码序列中从r555到k(r555k)的另一变化抑制了δf508突变的有害作用(x.luul等人同上)。

本发明的另一方面包括将编辑寡核苷酸施用至个体以在其dna或rna中产生对一种或多种疾病有保护作用的等位基因序列。例如，在脑中dna水平上诱导从app蛋白的普通等位基因到app的阿尔茨海默病保护性等位基因序列的变化将导致个体对阿尔茨海默病的发展有抗性(jonsson,t.等人nature,488(7409):96-9,2012.pubmed以及kero,m.等人neurobiolaging,34(5):1518,2013)。优选的等位基因序列是对阿尔茨海默病具有约80％的终身保护作用的ala673thr等位基因。例如，可以通过将此位置的密码子gca改变为aca来进行此改变。

产生保护性等位基因以降低阿尔茨海默病的风险和/或减慢阿尔茨海默病的进展的另一实例是编辑apoe中编码精氨酸112到半胱氨酸112的核酸序列的变化，以将阿尔茨海默病的风险等位基因apoe4转变为apoe3等位基因。这种改变可以可选地与从精氨酸158到半胱氨酸158的改变一起完成，这会将阿尔茨海默病的风险等位基因apoe4改变为保护性等位基因apoe2。双重变化可以用单个长的编辑链或两个独立的较小的编辑寡核苷酸来完成。从精氨酸158到半胱氨酸158的单一变化将apoe3转变为更保护的等位基因apoe2。参见图24中的示例性编辑寡核苷酸序列。

产生保护性等位基因的另一实例是通过产生提前成熟的终止密码子或者将失活或降低pcsk9活性的无数修饰之一来使肝脏中pcsk9失活。pcsk9中天然存在的无效突变体等位基因对基于动脉硬化的疾病(诸如闭塞性中风和冠状动脉疾病)具有高达90％的保护性终身影响。此外，中和功能性pcsk9的治疗性抗体降低血清胆固醇水平。这些抗体是昂贵的，并且必须长期施用，而dna水平的编辑将导致血清胆固醇水平的永久降低。使用编辑寡核苷酸以产生保护性等位基因(与修复突变的等位基因相反)的一个非显而易见的优点是，用于保护性编辑的靶序列在群体内是更均质的序列，而许多引起人类疾病的突变在群体内是异质的，并且因此将需要一组不同的编辑寡核苷酸以可用于治疗具有不同基因型的患者。

iii.治疗

a.疾病

本发明的编辑寡核苷酸可用于减少、降低或消除疾病的影响。可用本发明的编辑寡核苷酸治疗的疾病包括：腺苷脱氨酶缺乏症；α-1抗胰蛋白酶缺乏症；阿尔茨海默氏症；氨基酰化酶2缺乏；天冬酰胺酶缺乏症；动脉硬化、动脉粥样硬化、canavan-范-贝三氏病(canavan-vanbogaert-bertranddisease)；腓骨肌萎缩症；囊性纤维化；乳腺癌易患突变；由胰岛素受体突变引起的1型糖尿病；2型糖尿病(例如靶基因ptp-1b和abca1c69t等位基因(alharbi等人,j.biosci.38(5):893–897(2013))、镰状细胞病；法布里病；家族性腺瘤性息肉病；家族性淀粉样心肌病；家族性淀粉样多发性神经病；家族性自主神经功能障碍；家族性高胆固醇血症；弗里德希氏共济失调；戈谢病i型；戈谢病ii型；糖原贮积病ⅱ型；gm2神经节苷脂沉积症；血色素沉着病；血友病a型；血友病b型；血友病c型；遗传性盲症(参见andrieu-solermolecularvision13：692-706,2007，将校正rd1中的突变的编辑寡核苷酸递送至视网膜的实例)；遗传性酪氨酸血症i型(hti)(由富马酰乙酰乙酸水解酶(fah)中的突变引起的，yin,等人naturebiotechnology32(6),2014)氨基糖苷酶a缺乏症；高胆固醇血症、卵巢癌易感性突变；苯丙酮尿症；多囊肾病；朊病毒病；老年系统性淀粉样变性病；镰状细胞病；镰状细胞性贫血症；smith-lemli-opitz综合征；脊髓肌萎缩；以及威尔逊病。

具体疾病靶包括：囊性纤维化跨膜电导调节基因(cftr)；肌营养不良蛋白基因(dmd)；淀粉样β(a4)前体蛋白基因(app)；因子xii基因；因子ix基因；因子xi基因；hgbs；胰岛素受体基因；腺苷脱氨酶基因；α-1抗胰蛋白酶基因；乳腺癌1基因(brca1)；乳腺癌2基因(brca2)；天冬氨酸环化酶基因(aspa)；半乳糖苷酶α基因(gla)；腺瘤性息肉病基因(apc)；b细胞中κ轻多肽基因增强子的抑制剂、激酶复合物相关蛋白(ikbkap)；葡萄糖苷酶β酸基因(gba)；葡萄糖苷酶α酸基因(gaa)；血色素沉着病基因(hfe)；载脂蛋白b基因(apob)；低密度脂蛋白受体基因(ldlr)、低密度脂蛋白受体衔接蛋白1基因(ldlrap1)；前蛋白转变酶枯草溶菌素9型基因(pcsk9)；多囊肾病1(常染色体显性遗传)基因(pkd-1)；朊蛋白基因(prnp)；ptp-1b；7-脱氢胆固醇还原酶基因(dhcr7)；运动神经元1存活端粒基因(smn1)；双蛋白样修饰酶活化酶1基因(uba1)；动力蛋白、细胞质1、重链1基因(dync1h1)、运动神经元2存活着丝粒基因(smn2)；(囊泡相关膜蛋白)相关的蛋白b和c(vapb)；氨基糖苷酶a(α多肽)基因(hexa)；转甲状腺素蛋白基因(ttr)；atp酶、cu++转运、β多肽基因(atp7b)；苯丙氨酸羟化酶基因(pah)；视紫红质基因；色素性视网膜炎1(常染色体显性)基因(rp1)；色素性视网膜炎2(x-连接的隐性)基因(rp2)及其他已知的基因靶。

当突变是错义突变(诸如镰状细胞病(scd)、镰状细胞性贫血症(sca)或镰状细胞病)，无义突变(诸如杜氏肌营养不良症和贝克肌营养不良症)，剪接突变(诸如在家族性自主神经功能障碍中)时，编辑寡核苷酸可用于改善疾病症状，以产生诸如在2型糖尿病(例如，靶基因ptp-1b)、阿尔茨海默病(app)和家族性高胆固醇血症(pcsk9)中的保护等位基因，或者产生基因内抑制因子诸如囊性纤维化δ508突变。其他错义突变或无义突变包括腺苷脱氨酶缺乏症、α-1抗胰蛋白酶缺乏症、氨基酰化酶2缺乏、淀粉样蛋白病、天冬氨酸酰基转移酶缺乏、乳腺癌易感性突变、卡canavan-范-贝三氏病、腓骨肌萎缩症、囊性纤维化、1型糖尿病(由胰岛素受体突变引起的)、法布里病、家族性腺瘤性息肉病、家族性淀粉样变性心肌病、家族性淀粉样多发性神经病、弗里德希氏共济失调、戈谢病i型、戈谢病ii型、糖原贮积病ii型、gm2神经节苷脂沉积症、血色素沉着病、血友病a型、血友病b型、血友病c型、氨基糖苷酶a缺乏症、卵巢癌易感性突变、苯丙酮尿症、多囊肾病、朊病毒病、老年系统性淀粉样变性病、smith-lemli-opitz综合征、脊髓肌萎缩、威尔逊病和遗传性盲症。

可以用本发明的寡核苷酸治疗的疾病和疾患的另外的实例以及使用所述寡核苷酸的方法在图23中公开。

与代表性疾病和疾患相关的靶基因的编辑寡核苷酸的非限制性实例在图24中公开。

b.药物组合物

本发明的药物组合物以足以实现靶基因表达的剂量施用。通常，合适剂量的编辑寡核苷酸将在每天接受者每千克体重0.01至5.0毫克的范围内，如果需要，最高达每千克50毫克，优选地在每天每千克体重0.1至200微克的范围内，更优选地在每天每千克体重0.1至100微克的范围内，甚至更优选地在每天每千克体重1.0至50微克的范围内以及最优选地在每天每千克体重1.0至25微克的范围内。药物组合物可以每天施用一次，或者编辑寡核苷酸可以在整个一天中以适当的间隔或甚至使用连续输注施用2次、3次、4次、5次、6次或更多次的亚剂量。在这种情况下，每亚剂量中所含的编辑寡核苷酸必须相应地较小以达到总日剂量。剂量单位也可以复合用于在几天内递送，例如使用在几天内提供编辑寡核苷酸持续释放的常规持续释放制剂。持续释放制剂是本领域中公知的。在此实施方式中，剂量单位含有每日剂量的相应倍数。

i.剂量

技术人员将理解，某些因素可能影响有效治疗受试者所需的剂量和时间，包括但不限于疾病或疾患的严重性、先前的治疗、受试者的一般健康和/或年龄以及存在的其他疾病。此外，用治疗有效量的组合物治疗受试者可以包括单次治疗或一系列治疗。对本发明所涵盖的用于个体的编辑寡核苷酸的有效剂量和体内半衰期的估算可以使用常规方法或基于使用适当的动物模型的体内测试来进行，如本文别处所述的。

ii.施用途径

本发明所涵盖的药物组合物可以通过本领域中已知的任何方式施用，包括但不限于口服的或肠胃外的途径，包括静脉内的、肌内的、腹膜内的、皮下的、透皮的、气道(气雾剂)、直肠的、阴道的和局部的(包括口腔的和舌下的)施用。在优选的实施方式中，将药物组合物静脉内施用。

对于肌内的、皮下的和静脉内的使用，本发明的药物组合物将通常以被缓冲至适当的ph和等渗性的无菌水溶液或悬浮液提供。合适的水性媒介物包括林格氏液和等渗氯化钠。在优选的实施方式中，载体仅仅由水性缓冲液构成。在这种情况下，“仅仅”是指不存在可能影响或介导编辑寡核苷酸在表达靶基因的细胞中的摄取的辅助剂或包封物质。这样的物质包括例如胶束结构，诸如脂质体或衣壳，如下所述的。根据本发明的水性悬浮液可以包括悬浮剂(诸如纤维素衍生物、藻酸钠、聚乙烯吡咯烷酮和黄蓍胶)和润湿剂(诸如卵磷脂)。水性悬浮液的合适防腐剂包括对羟基苯甲酸乙酯和正丙酯。

根据本发明有用的药物组合物还包括包封的制剂以保护编辑寡核苷酸免于从身体快速消除，诸如控制释放制剂，包括植入物和微囊化递送系统。可以使用可生物降解的生物相容性聚合物，诸如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸。制备这些制剂的方法对于本领域中的技术人员是显而易见的。这些材料也可以从johnson&johnson，inc.(newbrunswick，nj)和novapharmaceuticals，inc.(bellavista，australia)商购获得。脂质体悬浮液(包括被靶向到受感染的细胞的具有针对病毒抗原的单克隆抗体的脂质体)也可以用作药学上可接受的载体。这些可以根据本领域的技术人员已知的方法制备，例如，如在美国专利号4,522,811；pct申请号wo91/06309；以及欧洲专利公开ep-a-43075中所述的，或者从northernlipids(burnaby，britishcolumbia)、avantipolarlipids(alabaster，alabama)或arbutusbiopharma(burnaby，britishcolumbia)商购获得。也可以使用纳米颗粒递送并描述于j.zhou等人pharmaceuticals,6:85-107,2013；doi：10.3390/ph6010085，mcneer等人,genether.20(6):658–669,2013；doi：10.1038/gt.2012.82，mcneer等人,naturecomm.doi:10.1038/ncomms7952pgs.1-11,2015和yueny.c.等人pharmaceuticals,5:498-507,2013；doi：10.3390/pharmaceuticalics(制药学/配药学)5030498。

iii.毒性和功效

这种化合物的毒性和治疗功效可以通过在细胞培养物或实验动物中的标准药物程序来测定，例如，用于测定ld50(对群体的50％致死的剂量)和ed50(在群体的50％中治疗有效的剂量)的标准药物程序。毒性和治疗效果之间的剂量比是治疗指数，并且其可以表示为ld50/ed50的比例。表现出高治疗指数的化合物是优选的。

从细胞培养测定和动物研究获得的数据可以用于配制用于人类的剂量范围。本发明的组合物的剂量优选地在包括ed50的循环浓度的范围内，具有很少或没有毒性。剂量可以在此范围内变化，这取决于所采用的剂型和所用的施用途径。对于本发明的方法中使用的任何化合物，最初从细胞培养测定可以估算治疗有效剂量。可以在动物模型中配制剂量以实现化合物的或者适当时靶序列的多肽产物的循环血浆浓度范围(例如，达到减少的多肽浓度)，其包括如在细胞培养物中所测定的ic50(即，达到症状的半数最大抑制的测试化合物的浓度)。这种信息可用于更精确地确定人类中的有用剂量。可以例如通过高效液相色谱来测量血浆的水平。

iv.组合物和方法

本发明的寡核苷酸以下述组合物和方法提供。

在一方面，本文提供了一种修饰在分离的细胞内或生物体中的细胞内的核酸序列的方法，包括将寡核苷酸引入所述细胞的步骤，致使互补细胞核酸结果的一种修饰或多种修饰，其中所述修饰创建一种防护免受疾病的等位基因、修复突变或敲除基因。

在另一实施方式中，防护免受疾病的等位基因不会使被靶向的基因的功能失活，而是调节被靶向的基因的功能。

在又另一实施方式中，该方法导致被靶向的基因功能的调节。被靶向的基因功能的调节可增加基因产物的活性或表达。被靶向的基因功能的调节可部分地降低翻译后加工的基因产物的活性或表达。

被靶向的基因功能的调节可将修饰细胞中的翻译后加工的基因产物的活性或表达部分地降低不超过50％。被靶向的基因功能的调节可将修饰细胞中的翻译后加工的基因产物的活性或表达部分地降低不超过75％。被靶向的基因功能的调节可将修饰细胞中的翻译后加工的基因产物的活性或表达部分地降低不超过90％。

在该方法的某些实施方式中，被靶向的基因产物是被蛋白酶切割所翻译后修饰的蛋白质。在具体实施方式中，被靶向的基因蛋白是app，并且该基因的修饰改变了app的序列以使得其不太容易被β-分泌酶切割。app中序列编码位置673可以从丙氨酸改变为苏氨酸。

在另一方面本文提供的是包含本发明的寡核苷酸的组合物。该组合物可以用于本文所述的方法中。在一些实施方式中，寡核苷酸存在于制剂(例如，编辑寡核苷酸制剂)中。在一种实施方式中，编辑寡核苷酸制剂包含增加编辑效率的外源蛋白或核糖核蛋白(或表达所述蛋白或核糖核蛋白的核酸)。提高编辑效率的外源蛋白质或核糖核蛋白可以是可设计的核酸酶。提高编辑效率的外源蛋白或核糖核蛋白可以是crispr-cas9、锌指或talen可设计的核酸酶。编辑寡核苷酸可以是单链的未修饰的dna。编辑寡核苷酸可以是单链的并含有至少10个脱氧核糖。编辑寡核苷酸可以被化学地修饰。

编辑寡核苷酸的化学修饰可以包括硫代磷酸酯。编辑寡核苷酸的化学修饰可以在每个末端上包括3个硫代磷酸酯核苷酸间键。编辑寡核苷酸的化学修饰可以在末端包括总共1-5个硫代磷酸酯核苷酸间键。编辑寡核苷酸的化学修饰可以包括总共7个或更多个硫代磷酸酯核苷酸间键。在一种实施方式中，编辑寡核苷酸的化学修饰包括总共7个或更多个硫代磷酸酯核苷酸间键，但仍保留至少10个不是硫代磷酸酯修饰的核苷酸间键。在一种实施方式中，修饰不包含任何硫代磷酸酯修饰。在一种实施方式中，修饰包括不是硫代磷酸酯的核酸外切酶端基封闭基团。

在某些实施方式中，该组合物包含具有化学修饰的核碱基的寡核苷酸。一个或多个化学修饰的核碱基可以是5甲基脱氧胞苷。在一些实施方式中，存在1个至约500个5甲基脱氧胞苷。在其他实施方式中，存在1个至约50个5甲基脱氧胞苷。在其他实施方式中，存在1个至约10个5甲基脱氧胞苷。在其他实施方式中，存在1个至约5个5甲基脱氧胞苷。在其他实施方式中，存在1个至约5个5甲基脱氧胞苷。在其他实施方式中，存在一个5甲基脱氧胞苷。在其他实施方式中，5甲基脱氧胞苷中的一个位于与错配的5'tg杂交的5'cpg序列中。在具体实施方式中，此5'tg靶位点是甲硫氨酸起始密码子的tg，并且此编辑减少了或消除了功能性靶蛋白的产生。

在本文所述的方法和组合物的具体实施方式中，编辑寡核苷酸包含2'修饰。在本文所述的方法和组合物的另一具体实施方式中，编辑寡核苷酸仅包含2'修饰。在具体实施方式中，编辑寡核苷酸包含编辑位点5'的2'f和编辑位点3'的2'-o-mt或者这两者。在另一具体实施方式中，编辑寡核苷酸包含增加编辑位点附近亲和力的修饰碱基，其中所述修饰的碱基不是5甲基c。

在本文所述的方法和组合物的具体实施方式中，寡核苷酸被包封在递送媒介物中(参见yin等人naturereviews,genetics.15:541-555(2014)对核酸的递送媒介物的描述)。

在本文所述的方法和组合物的具体实施方式中，寡核苷酸还包含赋予增强的细胞摄取的缀合分子。

在本文所述的方法和组合物的具体实施方式中，该方法和组合物还包含辅助寡核苷酸。

在一方面，本文提供的是编辑寡核苷酸，其中所述编辑寡核苷酸可以编辑细胞内的互补靶序列，并且其中编辑寡核苷酸包含选自图20中所列的修饰的一种或多种主链修饰。

在编辑寡核苷酸的一种实施方式中，主链修饰是中性的。主链修饰可以包含1个至约20个中性修饰。在具体实施方式中，主链修饰包括2个至约4个中性修饰。

在另一实施方式中，主链修饰是甲基膦酸酯。主链修饰可以包含1个至约20个甲基膦酸酯。在具体实施方式中，主链修饰包含2-4个甲基膦酸酯。在具体实施方式中，主链修饰包含2个甲基膦酸酯。在更具体的实施方式中，主链修饰包括5'末端上的2个甲基膦酸酯。

在另一实施方式中，编辑寡核苷酸可以在单个被修饰的主链编辑寡核苷酸中包含1个至约20个主链修饰。在一种实施方式中，至少两种修饰在末端片段中。在具体实施方式中，该编辑寡核苷酸在5'末端包含两种修饰。

在另一方面，本文提供的是使用本文所述的编辑寡核苷酸来编辑细胞或生物体中的基因的方法。在一种实施方式中，细胞是分离的人类细胞。在一种实施方式中，生物体是人类。在某些实施方式中，该方法用于治疗从图23中列出的适应症中所选择的适应症。在具体实施方式中，适应症选自图24中列出的适应症。

在一种实施方式中，该基因是图24中所列的靶基因。在具体实施方式中，编辑寡核苷酸包含图24所列序列的至少25％。在另一具体实施方式中，编辑寡核苷酸包含图24中序列的至少51％。

在另一方面，本文提供的是编辑寡核苷酸，其中所述编辑寡核苷酸可以编辑细胞内的互补靶序列，并且其中所述编辑寡核苷酸包含图21中所列的一种或多种主链核碱基修饰。在一种实施方式中，编辑寡核苷酸包含来自图21的1个至100个修饰的核碱基。在一种实施方式中，编辑寡核苷酸包含来自图21的1个至约30个修饰的核碱基。在一种实施方式中，编辑寡核苷酸包含来自图21的1个至约10个修饰的核碱基。在具体实施方式中，编辑寡核苷酸包含根据表1中的修饰类型种类的一个或多个修饰的核碱基。

在编辑寡核苷酸的另一实施方式中，修饰的核碱基通过对哺乳动物中的寡核苷酸进行编辑来降低免疫刺激。在具体实施方式中，修饰的核碱基包含5'甲基c化学修饰。在另一具体实施方式中，核碱基修饰增加了编辑寡核苷酸对其互补靶的亲和力。

在另一方面，本文提供的是编辑寡核苷酸，其中所述编辑寡核苷酸可以编辑细胞内的互补靶序列，并且其中编辑寡核苷酸包含图22中所列的一种或多种糖修饰。在一种实施方式中，糖修饰选自2'糖修饰。2'糖修饰可以是2'f。2'糖修饰可以是2'o-甲基。2'糖修饰可以是2'f和2'o-甲基修饰的组合。

在编辑寡核苷酸的一种实施方式中，大多数(例如，大于50％)的2'f修饰是在编辑位点的3'。在编辑寡核苷酸的另一实施方式中，大多数(例如，大于50％)的2'-o-甲基修饰是在编辑位点的5'。

2'糖修饰可以增加寡核苷酸对其靶核酸的亲和力。在一种实施方式中，编辑寡核苷酸包含1-75个糖修饰。在另一实施方式中，编辑寡核苷酸包含2-30个糖修饰。在另一实施方式中，编辑寡核苷酸包含2-16个糖修饰。

在一种实施方式中，编辑寡核苷酸包含约5-100％化学修饰的碱基。在另一实施方式中，编辑寡核苷酸包含约25-75％化学修饰的碱基。在另一实施方式中，编辑寡核苷酸包含约40-60％化学修饰的碱基。在具体实施方式中，编辑寡核苷酸包含2种修饰。在一种具体实施方式中，编辑寡核苷酸含有2'f和2'o-甲基修饰。

在一种实施方式中，编辑寡核苷酸靶向图24中所列的基因。

在另一方面，本文提供的是通过基因组编辑治疗人类疾病的方法，其包括将本文所述的编辑寡核苷酸施用于需要这种治疗的人的步骤。

在又另一方面，本文提供的是编辑寡核苷酸，其包含一种或多种递送缀合物。在具体实施方式中，编辑寡核苷酸包含一种递送缀合物。递送缀合物可以促进寡核苷酸的细胞摄取。递送缀合物可以增强寡核苷酸在生物体中进入细胞的摄取。递送缀合物可以是与编辑寡核苷酸中的核苷酸直接或间接共价键合的化学部分。直接共价键合包括例如化学部分与寡核苷酸的共价键合。间接共价键合包括例如使用与寡核苷酸和化学部分均共价键合的接头。在一种实施方式中，编辑寡核苷酸不被增强生物体细胞中摄取的递送媒介物包封。

在一种实施方式中，递送缀合物是受体的配体。在具体实施方式中，配体是1至10个n-乙酰-d-半乳糖胺。在另一具体实施方式中，配体是三个n-乙酰-d-半乳糖胺。在一种实施方式中，递送缀合物是亲脂基团。亲脂基团可以具有约10个至约50个碳。亲脂基团可以是胆固醇形式。

包含一种或多种递送缀合物的编辑寡核苷酸用于治疗疾病。在一方面，本文提供的是通过将如本文所述的包含一种或多种递送缀合物的编辑寡核苷酸施用于需要这种治疗的患者来治疗或预防人类疾病的方法。在一种实施方式中，该方法靶向用于编辑的基因，其中该靶基因列于图23中。在另一实施方式中，用于治疗的被靶向基因列于图24中。在该方法的一种实施方式中，编辑寡核苷酸序列包含图24中的序列之一。

v.结果

表1中显示的寡核苷酸构建物用于研究和治疗应用(尽管它们在细胞培养物中的活性可能低于母体化合物)，因为这些寡核苷酸中的每一种都添加了化学物质，有助于其他预期的治疗益处，诸如减少的免疫刺激、更高的核酸酶稳定性、更高的靶特异性、降低的化学毒性和/或更高的亲和力。

表1：编辑寡核苷酸构建物

etagen序列号100001(seqidno.1)

序列5’:

catgtggtcggggtagcggctgaagcactgcacgccgtaggtcagggtggtcacgagggtgggccagggcac

糖:

dddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddd

主链:

sssoooooooooooooooooooooooooooooooooooooooooooooooooooooooooooooooosss

长度:72

碱基修饰:每个末端上3个硫代磷酸酯端基封闭

野生型

％编辑效率:0.58+/-0.09

etagen序列号100002(seqidno.2)

序列5':

catgtggtcggggtagcggctgaagcactgcacgccctaggtcagggtggtcacgagggtgggccagggcac糖:

dddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddd

主链:

sssoooooooooooooooooooooooooooooooooooooooooooooooooooooooooooooooosss

长度:72

碱基修饰:每个末端上3个硫代磷酸酯端基封闭

野生型

％编辑效率:0.00+/-0.00

etagen序列号100003(seqidno.3)

序列5':

cggctgaagcactgcacgccgtaggtcagggtggtcacga

糖:

dddddddddddddddddddddddddddddddddddddddd

主链:

oooooooooooooooooooooooooooooooooooooo

长度:40

碱基修饰:无修饰的dna

野生型

％编辑效率:0.03+/-0.00

etagen序列号100004(seqidno.4)

序列5':

cggctgaagcactgcacgccctaggtcagggtggtcacga

糖:

dddddddddddddddddddddddddddddddddddddddd

主链:

oooooooooooooooooooooooooooooooooooooo

长度:40

碱基修饰:无修饰的dna

突变体

％编辑效率:0.03+/-0.01

etagen序列号100005(seqidno.5)

序列5’:

cggctgaagcactgcacgccgtaggtcagggtggtcacga

糖:

dddddddddddddddddddddddddddddddddddddddd

主链:

sssooooooooooooooooooooooooooooooooosss

长度:40

碱基修饰:每个末端上3个硫代磷酸酯端基封闭(母体)

野生型

％编辑效率:1.69+/-0.63

etagen序列号100006(seqidno.6)

序列5’:

cggctgaagcactgcacgccctaggtcagggtggtcacga

糖:

dddddddddddddddddddddddddddddddddddddddd

主链:

sssooooooooooooooooooooooooooooooooosss

长度:40

碱基修饰:每个末端上3个硫代磷酸酯端基封闭

突变体

％编辑效率:0.00+/-0.00

etagen序列号100007(seqidno.7)

序列5’:

cggctgaagcactgcacgccgtaggtcagggtggtcacga

糖:

dddddddddddddddddddddddddddddddddddddddd

主链:

sssssssssoooooooooooooooooooossssssssss

长度:40

碱基修饰:具有未修饰编辑区的约一半硫代磷酸酯阳性率(positive)的40mer(9s-20o-10s)

野生型

％编辑效率:0.01+/-0.01

etagen序列号100008(seqidno.8)

序列5’:

cggctgaagcactgcacgccctaggtcagggtggtcacga

糖:

dddddddddddddddddddddddddddddddddddddddd

主链:

sssssssssoooooooooooooooooooossssssssss

长度:40

碱基修饰:具有未修饰编辑区的约一半硫代磷酸酯阳性率的40mer(9s-20o-10s)

突变体

％编辑效率:0.11+/-0.01

etagen序列号100009(seqidno.9)

序列5’:

ctgcgagatcgcggcagcgccatgctgaggctcgtacaga

糖:

dddddddddddddddddddddddddddddddddddddddd

主链:

sssssssssoooooooooooooooooooossssssssss

长度:40

碱基修饰:具有未修饰编辑区的约一半硫代磷酸酯阳性率40mer(9s-20o-10s)

加扰的(scrambled)

％编辑效率:0.01+/-0.01

etagen序列号100010(seqidno.10)

序列5’:

cggctgaagcactgcacgccgtaggtcagggtggtcacga

糖:

dddddddddddddddddddddddddddddddddddddddd

主链:

ssssssssssssssssoooooosssssssssssssssss

长度:40

碱基修饰:除了编辑区中的为多数硫代磷酸酯(16s-6o-17s)

野生型

％编辑效率:0.00+/-0.00

etagen序列号100011(seqidno.11)

序列5’:

cggctgaagcactgcacgccctaggtcagggtggtcacga

糖:

dddddddddddddddddddddddddddddddddddddddd

主链:

ssssssssssssssssoooooosssssssssssssssss

长度:40

碱基修饰:除了编辑区中的为为多数硫代磷酸酯(16s-6o-17s)

突变体

％编辑效率:0.01+/-0.00

etagen序列号100012(seqidno.12)

序列5’:

ctgcgagatcgcggcagcgccatgctgaggctcgtacaga

糖:

dddddddddddddddddddddddddddddddddddddddd

主链

ssssssssssssssssoooooosssssssssssssssss

长度:40

碱基修饰:除了编辑区中的为多数硫代磷酸酯(16s-6o-17s)

加扰的

％编辑效率:0.03+/-0.01

etagen序列号100013(seqidno.13)

序列5’:

cggctgaagcactgcacgccgtaggtcagggtggtcacga

糖:

dddddddddddddddddddddddddddddffffffffddd

主链:

sssooooooooooooooooooooooooooooooooosss

长度:40

碱基修饰:具有s端基封闭的3'8×2'f高亲和力臂

野生型

％编辑效率:1.16+/-0.11

etagen序列号100014(seqidno.14)

序列5’:

cggctgaagcactgcacgccctaggtcagggtggtcacga

糖:

dddddddddddddddddddddddddddddffffffffddd

主链:

sssooooooooooooooooooooooooooooooooosss

长度:40

碱基修饰:具有s端基封闭的3'8×2'f高亲和力臂

突变体

％编辑效率:0.01+/-0.00

etagen序列号100015(seqidno.15)

序列5’:

ttcggctgaagcactgcacgccgtaggtcagggtggtcacga

糖:

dddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddd

主链:

mmoooooooooooooooooooooooooooooooooooosss

长度:42

碱基修饰:5'非-硫代磷酸酯端基封闭(甲基膦酸酯)、3'3s端基封闭

野生型

％编辑效率:0.90+/-0.17

etagen序列号100016(seqidno.16)

序列5’:

ttcggctgaagcactgcacgccctaggtcagggtggtcacga

糖:

dddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddd

主链:

sssooooooooooooooooooooooooooooooooosss

长度:42

碱基修饰:5'非-硫代磷酸酯端基封闭(甲基膦酸酯)、3'3s端基封闭

突变体

％编辑效率:0.00+/-0.00

etagen序列号100017(seqidno.17)

序列5’:

mmmmmmmmm

cggctgaagcactgcacgccgtaggtcagggtggtcacga

糖:

dddddddddddddddddddddddddddddddddddddddd

主链:

sssooooooooooooooooooooooooooooooooosss

长度:40

碱基修饰:关于哪条链是新生的方面愚弄修复机构的用5'甲基c代替c的s

野生型

％编辑效率:1.36+/-0.03

etagen序列号100018(seqidno.18)

序列5’:

mmmmmmmmmm

cggctgaagcactgcacgccctaggtcagggtggtcacga

糖:

dddddddddddddddddddddddddddddddddddddddd

主链:

sssooooooooooooooooooooooooooooooooosss

长度:40

碱基修饰:关于哪条链是新生的方面愚弄修复机构的用5'甲基c代替c的s

突变体

％编辑效率:0.00+/-0.00

etagen序列号100019(seqidno.19)

序列5’:

agugcuucagccg(所有2'-o-mt)

糖:

mmmmmmmmmmmmm

主链:

ssoooooooooss

长度:29

碱基修饰:对编辑寡核苷酸的位置1-13互补的2'-o-甲基“保护剂”寡核苷酸

野生型

％编辑效率:nd+/-

etagen序列号100020(seqidno.20)

序列5’:

gaccuacggcgugc

糖:

mmmmmmmmmmmmmm

主链:

ssoooooooooss

长度:17

碱基修饰:对编辑寡核苷酸的位置14-27互补的2'-o-甲基“保护剂”寡核苷酸

野生型

％编辑效率:nd+/-

etagen序列号100021(seqidno.21)

序列5’:

ucgugaccacccu

糖:

mmmmmmmmmmmmm

主链:

ssooooooooss

长度:16

碱基修饰:对编辑寡核苷酸的位置28-40互补的2'-o-甲基“保护剂”寡核苷酸

野生型

％编辑效率:nd+/-

etagen序列号100022(seqidno.22)

序列5’:

gcactgcacgccctaggtcagggtg

糖:

ddddddddddddddddddddddddd

主链:

ssssssssssssssssssssssss

长度:25

碱基修饰:25mer全硫代磷酸酯dna

野生型

％编辑效率:nd+/-

etagen序列号100023(seqidno.23)

序列5’:

gcactgcacgccgtaggtcagggtg

糖:

ddddddddddddddddddddddddd

主链:

ssssssssssssssssssssssss

长度:25

碱基修饰:25mer全硫代磷酸酯dna

突变体

％编辑效率:nd+/-

etagen序列号100024(seqidno.24)

序列5’:

tcgcggcagcgccatgctgaggatc

糖:

ddddddddddddddddddddddddd

主链:

ssssssssssssssssssssssss

长度:25

碱基修饰:25mer全硫代磷酸酯dna

加扰的

％编辑效率:nd+/-

etagen序列号100031(seqidno.25)

序列5’:

cggctgaagcactgcacgccgtaggtcagggtggtcacga

糖:

dddddddddddddddddddddddddddddddddddddddd

主链:

sssooooooooooooooooooooooooooooooooosss

长度:40

碱基修饰:每个末端上3个硫代磷酸酯端基封闭(母体)

野生型

％编辑效率:2.07+/-0.46

etagen序列号100032(seqidno.26)

序列5’

cggctgaagcactgcacgccctaggtcagggtggtcacga

糖:

dddddddddddddddddddddddddddddddddddddddd

主链:

sssooooooooooooooooooooooooooooooooosss

长度:40

碱基修饰:40mer(每个末端上具有3个硫代磷酸酯)

突变体

％编辑效率:0.04+/-0.01

etagen序列号100033(seqidno.27)

序列5’:

cggctgaagcactgcacgccctaggtcagggtggtcacga

糖:

dddffffffffddddddddddddddddddffffffffddd

主链:

sssooooooooooooooooooooooooooooooooosss

长度:40

碱基修饰:具有s端基封闭的5'和3'8×2'f高亲和力臂

突变体

％编辑效率:0.00+/-0.00

etagen序列号100034(seqidno.28)

序列5’:

cggctgaagcactgcacgccgtaggtcagggtggtcacga

糖:

dddffffffffddddddddddddddddddffffffffddd

主链

sssooooooooooooooooooooooooooooooooosss

长度:40

碱基修饰:具有s端基封闭的5'和3'8×2'f高亲和力臂

野生型

％编辑效率:0.25+/-0.04

etagen序列号100035(seqidno.29)

序列5’:

cggctgaagcactgcacgccgtaggtcagggtggtcacga

糖:

dddddddddddddddddddddddddddddmmmmmmmmddd

主链:

sssooooooooooooooooooooooooooooooooosss

长度:40

碱基修饰:具有s端基封闭的3'8×2'-o-甲基高亲和力臂

野生型

％编辑效率:0.06+/-0.03

etagen序列号100036(seqidno.30)

序列5’:

cggctgaagcactgcacgccctaggtcagggtggtcacga

糖:

dddddddddddddddddddddddddddddmmmmmmmmddd

主链:

sssooooooooooooooooooooooooooooooooosss

长度:40

碱基修饰:具有s端基封闭的3'8×2'-o-甲基高亲和力臂

突变体

％编辑效率:0.00+/-0.00

etagen序列号100037(seqidno.31)

序列5’:

cggctgaagcactgcacgccgtaggtcagggtggtcacga

糖:

dddmmmmmmmmddddddddddddddddddddddddddddd

主链:

sssooooooooooooooooooooooooooooooooosss

长度:40

碱基修饰:具有s端基封闭的5'8×2'-o-甲基高亲和力臂

野生型

％编辑效率:0.9+/-0.07

etagen序列号100038(seqidno.32)

序列5’:

cggctgaagcactgcacgccctaggtcagggtggtcacga

糖:

dddmmmmmmmmddddddddddddddddddddddddddddd

主链:

sssooooooooooooooooooooooooooooooooosss

长度:40

碱基修饰:具有s端基封闭的5'8×2'-o-甲基高亲和力臂

突变体

％编辑效率:0.00+/-0.00

etagen序列号100039(seqidno.33)

序列5’:

cggctgaagcactgcacgccctaggtcagggtggtcacga

糖:

dddmmmmmmmmddddddddddddddddddmmmmmmmmddd

主链:

sssooooooooooooooooooooooooooooooooosss

长度:40

碱基修饰:具有s端基封闭的5'和3'8×2'-o-甲基高亲和力臂

突变体

％编辑效率:0.00+/-0.00

etagen序列号100040(seqidno.34)

序列5’:

cggctgaagcactgcacgccgtaggtcagggtggtcacga

糖:

dddmmmmmmmmddddddddddddddddddmmmmmmmmddd

主链:

sssooooooooooooooooooooooooooooooooosss

长度:40

碱基修饰:具有s端基封闭的5'和3'8×2'-o-甲基高亲和力臂

野生型

％编辑效率:0.03+/-0.02

etagen序列号100041(seqidno.35)

序列5’:

mmmmmmmm

cggctgaagcactgcacgccctaggtcagggtggtcacga

糖:

dddddddddddddddddddddddddddddddddddddddd

主链:

sssooooooooooooooooooooooooooooooooosss

长度:40

碱基修饰:关于哪条链是新生的方面愚弄修复机构的用5'甲基c代替c的s

突变体

％编辑效率:0.01+/-0.01

etagen序列号100042(seqidno.36)

序列5’:

cggctgaagcactgcacgccgtaggtcagggtggtcacga

糖:

dddddddddddddddddddddddddddddddddddddddd

主链:

sssooooooooooooooooooooooooooooooooosss

长度:40

碱基修饰:关于哪条链是新生的方面愚弄修复机构的用5'甲基c代替c的s

野生型

％编辑效率:0.94+/-0.10

etagen序列号100043(seqidno.37)

序列5’:

m

cggctgaagcactgcacgccgtaggtcagggtggtcacga

糖:

dddddddddddddddddddddddddddddddddddddddd

主链:

sssooooooooooooooooooooooooooooooooosss

长度:40

碱基修饰:关于哪条链是新生的方面愚弄修复机构的用5'甲基c代替c的s

野生型

％编辑效率:1.27+/-0.36

etagen序列号100044(seqidno.38)

序列5’:

m

cggctgaagcactgcacgccctaggtcagggtggtcacga

糖:

dddddddddddddddddddddddddddddddddddddddd

主链:

sssooooooooooooooooooooooooooooooooosss

长度:40

碱基修饰:关于哪条链是新生的方面愚弄修复机构的用5'甲基c代替c的s

突变体

％编辑效率:0.02+/-0.01

etagen序列号100045(seqidno.39)

序列5’:

mmmmmm

ttcggctgaagcactgcacgccgtaggtcagggtggtcacgatt

糖:

ddffffffffddddddddddddddddddddddddffffffffdd

主链:

mmooooooooooooooooooooooooooooooooooooooomm

长度:44

碱基修饰:无硫代磷酸酯的甲基膦酸酯端基封闭、5甲基c的s和2'f臂

野生型

％编辑效率:nd+/-

etagen序列号100047(seqidno.40)

序列5’:

mmmmmmmmm

ttcggctgaagcactgcacgccgtaggtcagggtggtcacga

糖:

dddddddddddddddddddddddddddddddfffffffdddd

主链:

mmoooooooooooooooooooooooooooooooooooosss

长度:42

碱基修饰:5'甲基膦酸酯端基封闭、3's-端基封闭、5甲基c的s和3'2'f臂

野生型

％编辑效率:0.19+/-0.06

etagen序列号100048(seqidno.41)

序列5’:

ttcggctgaagcactgcacgccctaggtcagggtggtcacga

糖:

dddddddddddddddddddddddddddddddfffffffdddd

主链:

mmoooooooooooooooooooooooooooooooooooosss

长度:42

碱基修饰:5'甲基膦酸酯端基封闭、3's-端基封闭、5甲基c的s和3'2'f臂

突变体

％编辑效率:0.00+/-0.00

etagen序列号100049(seqidno.42)

序列5’:

ttcggctgaagcactgcacgccctaggtcagggtggtcacgatt

糖:

dddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddd

主链:

mmooooooooooooooooooooooooooooooooooooooomm

长度:44

碱基修饰:无硫代磷酸酯的5'和3'甲基膦酸酯端基封闭

突变体

％编辑效率:0.00+/-0.00

etagen序列号100050(seqidno.43)

序列5’:

ttcggctgaagcactgcacgccgtaggtcagggtggtcacgatt

糖:

dddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddd

主链:

mmooooooooooooooooooooooooooooooooooooooomm

长度:44

碱基修饰:无硫代磷酸酯的5'和3'甲基膦酸酯端基封闭

野生型

％编辑效率:0.24+/-0.09

etagen序列号100058(seqidno.44)

序列5’:

cggctgaagcactgcacgccgtaggtcagggtggtcacga

糖:

dddmmmmmmmmddddddddddddddddddffffffffddd

主链:

sssooooooooooooooooooooooooooooooooosss

长度:40

碱基修饰:具有s端基封闭的5'8×2'-o-甲基和8×3'2'f高亲和力臂

野生型

％编辑效率:nd+/-

etagen序列号100060(seqidno.45)

序列5’:

mmmmmm

cggctgaagcactgcacgccgtaggtcagggtggtcacga

糖:

dddmmmmmmmmddddddddddddddddddffffffffddd

主链:

sssooooooooooooooooooooooooooooooooosss

长度:40

碱基修饰:具有s端基封闭、具有中央5甲基c的5'8×2'-o-甲基和3'8×2'f高亲和力臂

野生型

％编辑效率:nd+/-

etagen序列号100062(seqidno.46)

序列5’:

cggctgaagcactgcacgccgtaggtcagggtggtcacga

糖:

dddddddddddddddddddddddffffffffffffffddd

主链:

sssooooooooooooooooooooooooooooooooosss

长度:40

碱基修饰:具有s端基封闭的3'14×2'f高亲和力臂

野生型

％编辑效率:nd+/-

etagen序列号100064(seqidno.47)

序列5’:

cggctgaagcactgcacgccgtaggtcagggtggtcacga

糖:

dddddddddddddddddffffffffffffffffffffddd

主链:

sssooooooooooooooooooooooooooooooooosss

长度:40

碱基修饰:具有s端基封闭的3'20×2'f高亲和力臂

野生型

％编辑效率:nd+/-

etagen序列号100066(seqidno.48)

序列5’:

cggctgaagcactgcacgccgtaggtcagggtggtcacga

糖:

dddmmmmmmmmmmmmmmddddddddddddddddddddddd

主链:

sssooooooooooooooooooooooooooooooooosss

长度:40

碱基修饰:具有s端基封闭的5'14×2'-o-甲基高亲和力臂

野生型

％编辑效率:nd+/-

etagen序列号100068(seqidno.49)

序列5’:

cggctgaagcactgcacgccgtaggtcagggtggtcacga

糖:

dddmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmddddddddddddddddd

主链:

sssooooooooooooooooooooooooooooooooosss

长度:40

碱基修饰:具有s端基封闭的5'20×2'-o-甲基高亲和力臂

野生型

％编辑效率:nd+/-

etagen序列号100070(seqidno.50)

序列5’:

catgtggtcggggtagcggctgaagcactgcacgccgtaggtcagggtggtcacgagggtgggccagggcac

糖:

dddmmmmmmmmddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddd

主链:

sssooooooooooooooooooooooooooooooooooooooooooooooooooooooooooooooooosss

长度:72

碱基修饰:具有s端基封闭的5'8×2'-o-甲基高亲和力臂

野生型

％编辑效率:nd+/-

etagen序列号100072(seqidno.51)

序列5’:

catgtggtcggggtagcggctgaagcactgcacgccgtaggtcagggtggtcacgagggtgggccagggcac

糖:

dddmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddd

主链:

sssooooooooooooooooooooooooooooooooooooooooooooooooooooooooooooooooosss

长度:72

碱基修饰:具有s端基封闭的5'24×2'-o-甲基高亲和力臂

野生型

％编辑效率:nd+/-

etagen序列号100074(seqidno.52)

序列5’:

cggctgaagcactgcacgccgtaggtcagggtggtcacgacgcg

糖:

ldddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddd

主链:

oooooooooooooooooooooooooooooooooooooooossss

长度:45

碱基修饰:l＝5'cy3(trilinkbiotechnologies,sandiego,ca)端基封闭3'硫代磷酸酯端基封闭

野生型

％编辑效率:nd+/-

etagen序列号100076(seqidno.53)

序列5’:

cggctgaagcactgcacgccgtaggtcagggtggtcacga

糖:

lddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddq

主链:

ooooooooooooooooooooooooooooooooooooooooo

长度:41

碱基修饰:l＝5'cy3和q＝c-3氨基接头(trilinkbiotechnologies,sandiego,ca)端基封闭

野生型

％编辑效率:nd+/-

etagen序列号100078(seqidno.54)

序列5’:

cggctgaagcactgcacgccgtaggtcagggtggtcacga

糖:

lddddddddddddddddddddddddddddddddddddddl

主链:

ooooooooooooooooooooooooooooooooooooooo

长度:40

碱基修饰:l＝una(解锁核酸)5'和3'端基封闭

野生型

％编辑效率:nd+/-

etagen序列号100079(seqidno.55)

序列5’:

cggctgaagcactgcacgccgtaggtcagggtggtcacga

糖:

qmmddddddddddddddddddddddddddddddddddddddq

主链:

ooooooooooooooooooooooooooooooooooooooooo

长度:41

碱基修饰:q＝c3氨基接头5'和3'端基封闭(trilinkbiotechnologies,sandiego,ca)

野生型

％编辑效率:nd+/-

etagen序列号100080(seqidno.56)

序列5’:

cggctgaagcactgcacgccgtaggtcagggtggtcacga

糖:

qmmmmmmmmmmmddddddddddddddddddffffffffffq

主链:

oooooooooooooooooooooooooooooooooooooooo

长度:41

碱基修饰:l＝unaq＝c3具有3'10×2'f臂5'11×2'-o-甲基和5甲基c编辑区的氨基接头端基封闭

野生型

％编辑效率:nd+/-

etagen序列号100082(seqidno.57)

序列5’:

tcgtgaccaccctgacctacggcgtgcagtgcttcagccg

糖:

dddddddddddddddddddddddddddddddddddddddd

主链:

sssooooooooooooooooooooooooooooooooosss

长度:40

碱基修饰:与具有硫代磷酸酯端基封闭的母体互补的dna链

野生型

％编辑效率:nd+/-

etagen序列号100083(seqidno.58)

序列5’:

tcgtgaccaccctgacctacggcgtgcagtgcttcagccg

糖:

rrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrr

主链:

sssooooooooooooooooooooooooooooooooosss

长度:40

碱基修饰:与具有硫代磷酸酯端基封闭的母体互补的rna链

野生型

％编辑效率:nd+/-

etagen序列号100084(seqidno.59)

序列5’:

cggctgaagcactgcacgccgtaggtcagggtggtcacga

糖:

dddrrrrrrrrddddddddddddddddddffffffffddd

主链:

sssooooooooooooooooooooooooooooooooosss

长度:40

碱基修饰:具有s端基封闭的5'8×rna和3'8×2'f高亲和力臂

野生型

％编辑效率:nd+/-

etagen序列号100085(seqidno.60)

序列5’:

catgtggtcggggtagcggctgaagcactgcacgccgtaggtcagggtggtcacgagggtgggccagggcac

糖:

mrmrmrmrmrmrmrmrmrmddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddd

主链:

oooooooooooooooooooooooooooooooooooooooooooooooooooooooooooooooooooosss

长度:73

碱基修饰:具有交替的rna/2'-o-甲基的5'risc进入位点的编辑/引导链

野生型

％编辑效率:nd+/-

etagen序列号100086(seqidno.61)

序列5’:

ccgctaccccgaccacatgtt

糖:

mmrrrrrrrrrrrrrrrrrdd

主链:

oooooooooooooooooooo

长度:21

碱基修饰:将允许具有100085的双链体形成能够risc进入的编辑化合物的正义链

野生型

％编辑效率:nd+/-

图例：

主链：o＝磷酸二酯、s＝硫代磷酸酯以及m＝甲基膦酸酯，字母串中指出的第一个主链对应于序列的第一个核苷酸和第二个核苷酸之间的修饰，字母串中的第二个主链对应于序列的第2个核苷酸和第3个核苷酸之间的修饰等等。

糖：d＝dna、r＝rna、m＝2'-o-甲基、f＝2'f以及l和q＝如修饰说明中所述的

碱基：m＝5'甲基c

nd：无数据

编辑寡核苷酸100034具有5'和3'2'f臂(5'和3'近端片段)，并且显示低但显著的编辑。这是意想不到的，因为2'f在空间上比2'-o-甲基更类似于dna，并且2'f在掺入3'臂中时在编辑方面高度活跃。在5'臂中，2'-o-甲基修饰比2'f修饰更好地耐受，这又是意想不到的。这意味着像编辑寡核苷酸100058的构建物优于在每个臂中具有相同修饰的构建体。

编辑寡核苷酸100047所见的广泛修饰与编辑相容，这是有用的，因为每种修饰相对于本领域常用的母体寡核苷酸(5'和3'硫代磷酸酯dna核酸外切酶封闭末端片段是本领域中通常使用的)降低了预期毒性。据信这种降低毒性的部分是由于与dna中的2'h或rna中的2'oh相比，2'修饰键减少了toll样受体的活化。实现更高的靶特异性是因为臂不能作为有效的编辑位点，因此存在较少潜在的脱靶相互作用。

尽管5'甲基膦酸酯核酸外切酶封闭末端片段相当活跃，但使用5'和3'甲基膦酸酯末端片段是有用的，但较不活跃。这种结构在许多体外测定中除去了与阻断细胞增殖相关的所有硫代磷酸酯。

编辑位点附近的单个5'甲基c修饰与相对高的编辑效率一致，多个5'甲基c修饰也是。

由于干扰编辑反应，将一段3'近端片段修饰向3'编辑片段延伸可能不太优选，但这些另外的修饰被预计进一步增加核酸酶稳定性并降低免疫刺激(例如编辑寡核苷酸100062)。5'修饰也是如此情况(例如编辑寡核苷酸100066)。

预料将更像rna而非dna的2'-o-甲基修饰延伸进入编辑位点(例如编辑寡核苷酸100068)大幅减少或消除编辑活性。此外，预料将3'2'f修饰延伸进入编辑位点(例如编辑寡核苷酸100064)减少或消除编辑活性。

更长的编辑寡核苷酸具有可以在远离5'或3'编辑片段或编辑位点(例如编辑寡核苷酸100072)的位置被修饰的更多键。

而甲基膦酸酯成为优异的5'端基封闭。编辑寡核苷酸100074具有cy35'端基封闭和在3'端上3个互补的硫代磷酸酯dna，并提供另一种新的组合。

锁核酸(lna)也可以用作端基封闭基团，但它们可以增加体内毒性。因此，我们优选采用解锁核酸(una)(例如编辑寡核苷酸100078)或在一个或两个末端上的简单接头作为核酸酶端基封闭。虽然核酸外切酶可以跳过dna的单个修饰，但是与2'-修饰的末端残基组合(例如编辑寡核苷酸100080)可能不是问题。端基封闭接头具有额外的优点：它们也可以用于将缀合物键合到编辑寡核苷酸。这些缀合物(例如，与胆固醇(美国专利申请号20130131142a1)和n-乙酰-d-半乳糖胺(美国专利号8,106,022)的缀合已显示增加了在培养物中和动物体内的细胞中寡核苷酸的摄取。可以使用本领域已知的方法制备这些部分与编辑寡核苷酸的缀合物，并且将消除对添加费用和/或毒性的递送媒介物(例如脂质体)的需要。

关于用于编辑单链dna是否比双链体更好，有一些争议。编辑寡核苷酸100082包含与编辑寡核苷酸100005、10003和该修饰系列中的其他编辑寡核苷酸互补的端基封闭。编辑寡核苷酸可以与互补寡核苷酸分开加入细胞中，或者可以与本文所述的任何修饰的化学物质的互补编辑寡核苷酸预杂交以形成双链体。预形成双链体的优点是双链dna对单链核酸酶具有抗性。然而，双链体的感知缺点可能是碱基无法自由地与靶dna杂交，除非一些细胞修复/重组机构促进靶结合。根据靶基因、细胞类型和施用途径，单链或双链编辑寡核苷酸可能更适合于编辑。

编辑寡核苷酸100083是具有端基封闭的rna保护性寡核苷酸，所述端基封闭与编辑寡核苷酸100005、10003以及本文公开的一系列化学修饰的编辑寡核苷酸gfp序列中的其他编辑寡核苷酸互补。该寡核苷酸保护互补的编辑引导寡核苷酸免受血清、内溶酶体途径和细胞质中的核酸酶的影响。当在细胞质或核质中时，rna链最终将被内源性rna酶h降解，释放单链编辑寡核苷酸以与靶dna杂交。这是对2'-o-甲基保护寡核苷酸的改进，其降低了编辑寡核苷酸的活性，这可能是由于干扰了与靶dna的杂交。

已经设计了编辑寡核苷酸(例如，100085)，使得5'近端区在与保护性寡核苷酸10086杂交时形成能够载入rna诱导沉默复合物(risc)中的双链体。由于被载入argonaut中，引导链对互补靶核酸(rna和dna靶；saloman,等人cell162:84-96,2015)的杂交率显著增加。通过risc的杂交速率的这种增强使得sirna是相应的反义(例如，用反义观察到的通过risc没有增强)效力的约10-100倍。因此，被载入argonaut中的编辑寡核苷酸的5'端将更快地与靶染色体dna杂交，增加基因组编辑的效力和/或效率。该机制使用内源性细胞机构来增强靶结合，并因此不需要添加外源蛋白如cas9以加速增强靶结合。本发明的此实施方式的优点在于它避免了将外源蛋白递送到细胞的挑战。一旦与靶dna的结合被与argonaut复合的编辑寡核苷酸的5'近端区开始(引发，seed)，则剩余的双链体将快速形成。

基于本文关于编辑寡核苷酸100037的数据，似乎编辑寡核苷酸的5'端区可以用2'-o-甲基rna进行修饰，同时保持编辑效率，而用2'-o-甲基修饰的寡核苷酸的部分修饰与risc载入是相容的(美国专利申请号20130317080、20150267200、20150105545、20110039914和美国专利申请系列号12/824,011)。保护性寡核苷酸(过客链(随从链，passengerstrand))优选为10-50个核苷酸、更优选为12-30个核苷酸以及最优选为19-27个核苷酸，并且完全或基本上与靶互补。在这种构建物中，编辑寡核苷酸是按照一般公认的制备rnai或微小rna(mirna)的设计规则设计的。例如，过客链的两个碱基对3'悬突(overhang)是优选的，但与rnai相容的平端结构和其他端结构也是有用的。还提供了引导(编辑链)上的游离的5'羟基或磷酸化的5'羟基。在该编辑策略中可以采用与rnai相容的一系列化学修饰和结构。优选的是与过客rna成双链体的编辑寡核苷酸的5'端不具有与过客链中rna结合的多于约4个dna键，这可以激活过客链的rna酶h切割，降低risc载入。在优选的实施方式中，当采用长度足以用作dicer底物(dicersubstrate)的编辑寡核苷酸内的risc载入双链区时，可以以本领域中已知的方式插入化学修饰或错配以减少或消除dicer切割，诸如在一个或多个dicer切割位点上掺入一个或多个2'-o-甲基修饰(salomon等人nucleicacidsresearch,38(11):3771-9feb.2010)。减少dicer切割是有益的，因为编辑寡核苷酸在双链体最接近编辑位点的侧上被dicer切割将使risc载入的区从编辑寡核苷酸的其余部分分离，如果这发生在链侵入被靶向的dna双链体之前则这将消除risc载入的优势。

能够载入到risc中的双链结构是本领域中已知的，并且包括stealthrnai化合物(lifetechnologies，sandiegoca和美国专利号8,815,821)、dicer底物(美国专利号8,349,809、8,513,207和8,927,705)、rxrnaori(rxipharmaceuticals，marlborough，massachusetts)、具有缩短双链体的rnai触发(2009年提交的美国专利申请号20120065243)和sirna(美国专利号7,923,547；7,956,176；7,989,612；8,202,979；8,232,383；8,236,944；8,242,257；8,268,986；8,273,866和美国专利申请系列号13/693,478)。只要在细胞内保持或释放编辑链上自由的5'羟基或磷酸化的5'羟基，可将具有已知支持risc载入并在一些情况下增强组织和细胞摄取的各种化学修饰模式的这些rnai触发配置掺入编辑寡核苷酸中，正如在本文所述的risc载入编辑寡核苷酸(与100086杂交的etagen系列号100085)中的sirna已经完成的。

vi.优点

采用kmiec方法的本发明的实施方式相对于化学修饰方法具有一些优点，因为kmiec方法不需要将化学反应性基团附着至编辑寡核苷酸，实现碱基到任何其他天然碱基的编辑并允许小插入或缺失。

采用化学修饰方法的本发明的实施方式相对于kmiec方法具有一些优点，因为化学修饰方法包括添加或除去特定基团(即甲基化、乙基化或脱氨基)以改变被靶向的核碱基碱基配对特异性，并因此不需要活性细胞重组机构。

可以使用本发明的编辑寡核苷酸而不需crispr或蛋白质(诸如锌指或工程可设计核酸酶)。使用crispr和/或锌指的方法是使用单链寡核苷酸，该单链寡核苷酸不是crispr中的引导rna、而是作为修复该位点的供体的单独的单链寡核苷酸。然而，本发明的方法和组合物不严格需要这些其他外源蛋白质组分，并且导致与当前方法的精确编辑相似或基本相似的效率。

本发明是与crispr/cas9、锌指和talendna编辑方法不同的核酸修复方法，因为它直接且准确地修复突变序列而不会在dna中产生潜在的危险破坏。此外，在不递送颗粒或免疫原性蛋白质的情况下本发明可以可选地施用。

本发明可以用于通过产生位点特异性突变来沉默任何基因，例如在期望位置处防止转录的终止密码子。然而，本发明的独特应用之一是对调节或校正不能通过其他已知沉默方法处理的基因功能的点突变(例如，由显性突变引起的功能获得性突变)进行靶向。

诸如竞争基因治疗和mrna替代策略的其他方法可以替代突变的基因产物。然而，本发明具有的优点是在不掺入载体序列或不在载体插入位点引起染色体损伤的情况下实现完全正常的基因调节和表达水平。

应当理解的是，任何上述方法可以与本文中的某些其他方法组合使用，或不以这样的组合使用。此外，任何上述组合物可以可选地用本文所述的某些方法使用。

vii.实施例

表1和图2描述了本发明编辑寡核苷酸的实施例。表1图2中的编辑寡核苷酸序列靶向绿色荧光蛋白中的无效突变(nullmutation)，并将该突变校正为可以通过测定荧光来容易地监测的功能序列(erine.braachman和ericb.kakiec，同上))。这些化学修饰模式可用于编辑靶向突变的寡核苷酸、用于产生保护性等位基因的编辑寡核苷酸或用于在基因组中产生其他所期望的变化的编辑寡核苷酸。在这些实施例的每种情况下，当尚未由所公开的序列确定时，并且在本发明的其他实施方式中，编辑位点可以在编辑寡核苷酸的中心区中，或者可以朝向5'-末端或3'-末端偏移(offset)。在优选的实施方式中，编辑位点是来自任一末端多于五个的核苷酸。在每种情况下，也可以优选在未修饰的或如果修饰具有仍被细胞dna修复和复制机构认定为dna的保守修饰(即硫代磷酸酯或5'甲基c)的dna区中具有编辑位点。

编辑寡核苷酸可以被设计为与基因组dna的任一链互补。优选的是它们将被设计成结合用于滞后链合成的模板链，因为这往往导致更有效的编辑。然而，可以靶向每个链，并且可以容易地确定哪条链导致更有效的编辑。

图2示出了来自表1中的一些寡核苷酸的数据。gen3a是寡核苷酸#100013和#100014，gen3b是寡核苷酸#100015和#100016，gen3c是寡核苷酸#100017和#100018，gen1是寡核苷酸#100003和#100004以及gen2是寡核苷酸#100005和#100006。

图2和表1实验中所用的方法

a.细胞系和培养条件

hct116细胞从atcc(americantypecellculture,manassas,va)获得。通过整合含有突变的egfp基因的pegfp-n3载体(clontech,paloalto,ca)来产生hct116-19。突变的egfp基因在167位具有无义突变，导致非功能性egfp蛋白。对于这些实验，将hct116-19细胞在补充有10％的胎牛血清、2mm的l-谷氨酰胺和1％的青霉素/链霉素的mccoy's5amodifiedmedium(改良培养基)(thermoscientific,pittsburgh,pa)中培养。将细胞保持在37℃和5％的二氧化碳之下。

b.hct116-19细胞的转染

对于利用同步细胞的实验，将hct116-19细胞在100mm培养皿中以2.5×10⁶个细胞接种，并在靶向前与6mm的阿非迪霉素(aphidicolin)同步24小时。在胰蛋白酶消化和转染前通过用pbs(2/2)洗涤和加入完全生长培养基将细胞释放4小时(或指示时间)。在4mm间隙比色皿(bioexpress,kaysville,ut)中以5×10⁵个细胞/100μl的浓度转染同步和不同步的hct116-19细胞。使用bio-radgenepulserxcell^tm电穿孔系统(bio-radlaboratories,hercules,ca)对单链寡核苷酸进行电穿孔(250v，lv，13ms脉冲长度，2个脉冲，1秒间隔)。然后在分析前将细胞在6孔板中用完全生长培养基于37℃持续指定时间回收(复苏，recover)。基因编辑的细胞的分析。用guavaeasycyte5ht^tm流式细胞仪(millipore,temecula,ca)测量荧光(egfp)。通过胰蛋白酶消化收获细胞，用pbs洗涤一次，并重悬于缓冲液(具有0.5％的bsa、2mm的edta、2mg/ml碘化丙啶(pi)的pbs)中。碘化丙啶用于测量细胞活力本身，活细胞对pi(摄取)的染色阴性。将校正效率作为在各样品中总的活egfp阳性细胞对总的活细胞的百分比来计算。误差条是使用标准误差的计算从三组数据点而产生的。

实施例1

用于a至i转变的具有2'-脱氧尿苷-noc-18缀合物的编辑寡核苷酸(g模拟物，图3a-c)的合成

5'-二甲氧基三苯甲基-(e)-5-(甲酯基乙烯基)-2'-脱氧尿苷-3'-亚磷酰胺如wo2013150902中所述的来制备。含有5-羧基乙烯基-2'-脱氧尿苷残基的寡核苷酸(图3a)通过使用核苷亚磷酰胺构建单元(砌块，buildingblock)的标准自动化寡核苷酸合成来制备。在一个或多个所期望的位置将5'-二甲氧基三苯甲基-(e)-5-(甲酯基乙烯基)-2'-脱氧尿苷-3'-亚磷酰胺掺入寡核苷酸。通过用0.5m的氢氧化钠水溶液在室温下处理1小时然后在50℃下用浓氢氧化铵处理3小时而将寡核苷酸脱保护。通过阴离子交换和反相hplc的组合分离和纯化粗寡核苷酸。通过质谱确认序列和结构。

通过用20μmol的1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(edac)和20μmol的noc-18在0.1m的碳酸氢钠缓冲液(ph9.5-10.0)中孵育1μmol的寡核苷酸来将1-羟基-2-氧代-3,3-双(2-氨基乙基)-1-三氮烯(noc-18)(aldrich；cat#a5581，图1b)与寡核苷酸中的一个或多个5'-二甲氧基三苯甲基-(e)-5-(甲酯基乙烯基)-2'-脱氧尿苷残基缀合。每10分钟加入2μmol份的edac。反应完成后，通过阴离子交换和反相hplc的组合来分离和纯化2'-脱氧尿苷-noc-18缀合物(图3c)。通过质谱确认序列和结构。

实施例2

用于a至i转变(g模拟物)和用于c至u转变的具有3,5-戊酸-noc-18缀合物的寡核苷酸的合成

a.5-(4,4'-二甲氧基三苯甲基)-戊酸乙酯3-亚磷酰胺的合成(图4)

1.3,5-二-o,o-(叔丁基二甲基甲硅烷基)戊酸的制备(图4a)

用在吡啶中的2.2当量的叔丁基二甲基甲硅烷基氯(tbdms-cl)于室温下处理3,5-二羟基戊酸12小时。将混合物在减压下蒸发。残留物不经纯化用于下一步骤。

2.制备3,5-二-o,o-(叔丁基二甲基甲硅烷基)戊酸乙酯(图4b)

将粗的3,5-二-o,o-(叔丁基二甲基甲硅烷基)戊酸溶解在无水吡啶和无水乙醇(9:1)的混合物中。加入五摩尔当量的n,n'-二环己基碳二亚胺，并将混合物在室温下搅拌4小时。将溶液过滤并蒸发滤液。粗产物用于下一步骤。

3.制备3-羟基-5-(4,4'-二甲氧基三苯甲基)-戊酸乙酯(图4c)

将3,5-二-o,o-(叔丁基二甲基甲硅烷基)戊酸乙酯溶于在四氢呋喃中的1m的四丁基氟化铵(tbaf)中，并在室温下搅拌24小时。将混合物蒸发并溶解在无水吡啶中。加入4,4'-二甲氧基三苯甲基氯(dmt-cl，1.2当量)，并将混合物搅拌12小时。产物用二氯甲烷(dcm)/1m氯化钠萃取，并用无水硫酸钠将有机层干燥。通过硅胶层析法在dcm-甲醇(0.1％的吡啶)中纯化3-羟基-5-(4,4'-二甲氧基三苯甲基)-戊酸乙酯。将含有纯产物的部分合并、蒸发并在高真空下干燥。通过nmr和质谱确认该化合物的结构。

4.5-(4,4'-二甲氧基三苯甲基)-戊酸乙酯3-亚磷酰胺的制备(图4d)

将3-羟基-5-(4,4'-二甲氧基三苯甲基)-戊酸乙酯溶于dcm中，并加入1当量的三乙胺和1.1当量的2-氰乙基n,n-二异丙基氯亚磷酰胺。2小时后，将混合物蒸发，并将残留物溶于乙酸乙酯中。通过硅胶层析法在含有0.1％吡啶的己烷-乙酸乙酯中纯化粗1-(4,4-二甲氧基三苯甲基)-2-[2-氟乙酰氨基]乙基-3-亚磷酰胺。将含有纯产物的部分合并、蒸发并在高真空下干燥。通过nmr和质谱确认该化合物的结构。

b.含有附着至内部戊酸残基的羧基的寡核苷酸的合成

通过使用核苷亚磷酰胺构建单元的标准自动化寡核苷酸合成制备含有一种或多种内部戊酸残基的寡核苷酸。5-(4,4'-二甲氧基三苯甲基)-戊酸乙酯3-亚磷酰胺用于掺入寡核苷酸中的一个或多个所需位置。寡核苷酸通过用0.5m的氢氧化钠水溶液在室温下处理1小时然后在50℃下用浓氢氧化铵处理3小时而脱保护。通过阴离子交换和反相hplc的组合来分离和纯化粗寡核苷酸。通过质谱确认序列和结构。

c.noc-18与含有内部戊酸残基的羧基的寡核苷酸的缀合(图5)

通过用20μmol的1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(edac)和20μmol的noc-18在0.1m的碳酸氢钠缓冲液(ph9.5-10.0)中孵育1μmol的含有戊酸残基的寡核苷酸来进行noc-18与寡核苷酸的缀合。每10分钟加入2μmol份的edac。通过阴离子交换和反相hplc的组合来分离和纯化noc-18-寡核苷酸缀合物。通过质谱确认序列和结构。

实施例3

用于c至u转变的具有l-半胱氨酸缀合物的编辑寡核苷酸的合成

a.n²-异丁酰基-7-脱氮-7-氨甲基-2'-脱氧鸟苷的合成

1.9-[3',5',n²-三(叔丁基-二甲基甲硅烷基)-β-d-2'-脱氧呋喃糖基]-7-脱氮-7-脲基-6-氯嘌呤的制备(图6a)

用在甲醇中的7m的氨溶液于室温下处理9-[3',5',n²-三(叔丁基-二甲基甲硅烷基)-β-d-2'-脱氧呋喃糖基]-7-脱氮-7-甲酯基-6-氯嘌呤(美国专利公开号2013/0035237)24小时。将溶液蒸发，并将粗固体不经纯化用于下一步骤。

2.9-β-d-2'-脱氧呋喃糖基-7-脱氮-7-脲基-6-氯嘌呤的制备(图6b)

用在四氢呋喃中的1m的tbaf处理9-[3',5',n²-三(叔丁基-二甲基甲硅烷基)-β-d-2'-脱氧呋喃糖基]-7-脱氮-7-脲基-6-氯嘌呤24小时。将混合物蒸发并将粗核苷通过反相hplc纯化。通过nmr和质谱确认该化合物的结构。

3.7-脱氮-7-脲基-2'-脱氧鸟苷的制备(图6c)

将9-β-d-2'-脱氧呋喃糖基-7-脱氮-7-脲基-6-氯嘌呤溶于含有5摩尔当量的1,4-二氮杂双环[2.2.2]辛烷(dabco)的水中。将溶液回流过夜，并通过反相hplc纯化粗核苷。通过nmr和质谱法确认该化合物的结构。

4.7-脱氮-7-脲基-n²-异丁酰基-2'-脱氧鸟苷的制备(图6d)

7-脱氮-7-脲基-2'-脱氧鸟苷与无水吡啶一起共蒸发3次。将残留物溶于吡啶和异丁酸酐(3:1)的混合物中，并将所得混合物在室温下搅拌24小时。将烧瓶在冰水浴中冷却，并缓慢加入等体积的甲醇。4小时后，将混合物蒸发并将残留物溶于吡啶中，在冰水浴中冷却至0℃，并加入等体积的1m的氢氧化钠。20分钟后，加入过量的吡啶(吡啶盐，pyridinium)形式的dowex树脂。将混合物过滤并用50％的吡啶水溶液洗涤dowex树脂。将溶液蒸发，并将粗7-脱氮-7-脲基-n²-异丁酰基-2'-脱氧鸟苷不经纯化用于下一步骤。

5.7-脱氮-7-氨甲基-n²-异丁酰基-2'-脱氧鸟苷的制备(图6e)

将粗7-脱氮-7-脲基-n²-异丁酰基-2'-脱氧鸟苷溶解在甲醇中并置于厚壁玻璃小瓶中。加入10％的钯碳粉末。将混合物在40psi的氢气压力下搅拌24小时。过滤溶液，并通过反相hplc纯化7-脱氮-7-氨甲基-n²-异丁酰基-2'-脱氧鸟苷。通过nmr和质谱确认该化合物的结构。

b.5'-二甲氧基三苯甲基-n²-异丁酰基-7-脱氮-7-(三氟乙酰胺基)甲基-2'-脱氧鸟苷3'-亚磷酰胺的合成

1.5'-二甲氧基三苯甲基-n²-异丁酰基-7-脱氮-7-(三氟乙酰胺基)甲基-2'-脱氧鸟苷的制备(图7a)

将7-脱氮-7-氨甲基-n²-异丁酰基-2'-脱氧鸟苷溶于无水吡啶中，并加入10摩尔当量的三氟乙酸酐。混合物在室温下搅拌1小时。将烧瓶在冰水浴中冷却至0℃，加入等体积的甲醇，并在30分钟后，在减压下蒸发混合物。将混合物与甲醇一起共蒸发另外三次，以及用无水吡啶一起共蒸发两次。将所得残留物溶于吡啶中。

加入dmt-氯化物(1.2当量)，并将混合物在室温下搅拌6小时。将混合物在减压下蒸发，并将残留物溶于dcm中。通过使用逐步梯度的在dcm中的甲醇的硅胶层析法纯化5'-二甲氧基三苯甲基-n²-异丁酰基-7-脱氮-7-(三氟乙酰胺基)甲基-2'-脱氧鸟苷。将含有纯产物的部分合并、蒸发并在高真空下干燥。通过nmr和质谱法确认该化合物的结构。

2.5'-二甲氧基三苯甲基-n²-异丁酰基-7-脱氮-7-(三氟乙酰胺基)甲基-2'-脱氧鸟苷3'-亚磷酰胺的制备(图7b)

将二甲氧基三苯甲基-n²-异丁酰基-7-脱氮-7-(三氟乙酰胺基)甲基-2'-脱氧鸟苷溶于dcm中，并加入1当量的三乙胺和1.1当量的2-氰乙基n,n-二异丙基氯亚磷酰胺。2小时后，将混合物在旋转蒸发器上蒸发，并将残留物溶于乙酸乙酯中。通过硅胶层析法在含有0.1％的吡啶的己烷-乙酸乙酯中纯化粗5'-二甲氧基三苯甲基-n²-异丁酰基-7-脱氮-7-(三氟乙酰胺基)甲基-2'-脱氧鸟苷3'-亚磷酰胺。将含有纯产物的部分合并、蒸发并在高真空下干燥。通过nmr和质谱法确认该化合物的结构。

c.1-(4,4-二甲氧基三苯甲基)-2-[2-三氟乙酰氨基]乙基-3-亚磷酰胺的合成

1.2,2,2-三氟-n-[4-羟基-3-(羟甲基)丁基]乙酰胺的制备(图8a)

用过量的吡啶中的三氟乙酸酐于室温下处理2-(2-氨基乙基)丙烷-1,3-二醇1小时。加入等体积的甲醇，并在2小时后，将混合物在减压下蒸发并与无水吡啶一起共蒸发两次。残留物不经纯化用于下一步骤。

2.2,2,2-三氟-n-[4-二甲氧基三苯甲基-3-(羟甲基)丁基]乙酰胺的制备(图8b)

将粗2,2,2-三氟-n-[4-羟基-3-(羟甲基)丁基]乙酰胺溶于吡啶中，并向该溶液中加入1.1摩尔当量的4,4-二甲氧基三苯甲基氯。将混合物在室温下搅拌4小时。将溶液蒸发，并通过硅胶层析法在含有0.1％的吡啶的dcm-甲醇中纯化产物。将含有纯产物的部分合并、蒸发并在高真空下干燥。通过nmr和质谱法确认该化合物的结构。

3.1-(4,4-二甲氧基三苯甲基)-2-[2-三氟乙酰氨基]乙基-3-亚磷酰胺的制备(图8c)

将2,2,2-三氟-n-[4-二甲氧基三苯甲基-3-(羟甲基)丁基]乙酰胺溶于dcm中，并加入1当量的三乙胺和1.1当量的2-氰乙基n,n-二异丙基氯亚磷酰胺。2小时后，将混合物蒸发，并将残留物溶于乙酸乙酯。通过硅胶层析法在含有0.1％的吡啶的己烷-乙酸乙酯中纯化粗1-(4,4-二甲氧基三苯甲基)-2-[2-三氟乙酰氨基]乙基-3-亚磷酰胺。将含有纯产物的部分合并、蒸发并在高真空下干燥。通过nmr和质谱法确认该化合物的结构。

d.2,2,2-三氟-n-(2,2,5-三氧代氧硫杂环戊烷-4-基)乙酰胺的合成(图9)

用大量过量的吡啶中的三氟乙酸酐处理l-半胱氨酸(j.massspectrometry,2012,v.47,pp.529-538)数小时。将混合物蒸发，并与吡啶一起共蒸发两次以及与甲苯一起共蒸发两次。粗产物不经纯化而被使用。

e.用于c至u转变的具有内部伯氨基的寡核苷酸的合成

通过使用核苷亚磷酰胺构建单元的标准自动化寡核苷酸合成来制备含有7-脱氮-7-氨甲基-2'-脱氧鸟苷残基或2-(2-氨基乙基)-1,3-丙烯残基的寡核苷酸。5'-二甲氧基三苯甲基-n²-异丁酰基-7-脱氮-7-(三氟乙酰胺基)甲基-2'-脱氧鸟苷3'-亚磷酰胺或1-(4,4-二甲氧基三苯甲基)-2-[2-三氟乙酰氨基]乙基-3-亚磷酰胺用于掺入寡核苷酸中的一个或多个特定位置。通过在50℃下用浓氢氧化铵处理3小时将寡核苷酸去保护。通过阴离子交换和反相hplc的组合来分离和纯化粗寡核苷酸。通过质谱确认结构和序列。

f.2,2,2-三氟-n-(2,2,5-三氧代氧硫杂环戊烷-4-基)乙酰胺至具有伯氨基的寡核苷酸的缀合(图10)

含有伯氨基的寡核苷酸的三乙基铵盐溶于干燥dmf中，并加入10摩尔过量的2,2,2-三氟-n-(2,2,5-三氧代氧硫杂环戊烷-4-基)乙酰胺。将混合物在50℃下搅拌过夜。将混合物用5体积的100mm的teab稀释，并通过阴离子交换和反相色谱的组合来纯化。

实施例4

用于g至o⁶-me-g转变的具有2-脱氧胞苷-亚硝基烷基缀合物的寡核苷酸(a模拟物)的合成

1.5'-二甲氧基三苯甲基-5-(e)-(3-三氟乙酰氨基烯丙基)-n⁴-甲脒-2'-脱氧胞苷的制备(图11a)

将5-(e)-(3-三氟乙酰氨基烯丙基)-n⁴-甲脒-2'-脱氧胞苷(tetrahedronletters,2011,v.52,pp.181–183)溶于无水吡啶，并加入dmt-氯化物(1.2当量)。将混合物在室温下搅拌6小时。将混合物在减压下蒸发，并将残留物溶于dcm中。通过使用逐步梯度的在dcm中的甲醇的硅胶层析法纯化粗5'-二甲氧基三苯甲基-5-(e)-(3-三氟乙酰氨基烯丙基)-n⁴-甲脒-2'-脱氧胞苷。将含有纯产物的部分合并、蒸发并在高真空下干燥。通过nmr和质谱法确认核苷的结构。

2.5'-二甲氧基三苯甲基-5-(e)-(3-三氟乙酰氨基烯丙基)-n⁴-甲脒-2'-脱氧胞苷3'-亚磷酰胺的制备(图11b)

将5'-二甲氧基三苯甲基-5-(e)-(3-三氟乙酰氨基烯丙基)-n⁴-甲脒-2'-脱氧胞苷溶于dcm中，并加入1当量的三乙胺和1.1当量的2-氰乙基n,n-二异丙基氯亚磷酰胺。2小时后，将混合物在旋转蒸发器上蒸发，并将残留物溶于乙酸乙酯中。通过硅胶层析法在含有0.1％吡啶的己烷-乙酸乙酯中纯化粗5'-二甲氧基三苯甲基-e-5-(2-乙酯基乙烯基)-n⁴-苯甲酰基-2'-脱氧胞苷3'-亚磷酰胺。将含有纯产物的部分合并、蒸发并在高真空下干燥。通过nmr和质谱法确认核苷的结构。

3.4-[[甲基(亚硝基)氨基]甲氧基]-4-氧代丁酸的合成

将羟甲基甲基亚硝胺(kingstonchemistrycat#kst-14259951)溶于吡啶中，并加入1.1当量的琥珀酸酐。将混合物搅拌4小时。将粗产物用己烷沉淀并用于下一步骤。

4.4-[[甲基(亚硝基)氨基]甲氧基]-4-氧代-丁酸的nhs酯的合成(图12)

将4-[[甲基(亚硝基)氨基]甲氧基]-4-氧代-丁酸溶于吡啶中，并加入1当量的n-羟基琥珀酰亚胺。向该混合物中加入3当量的n,n'-二环己基碳二酰胺。将混合物在室温下搅拌8小时。将混合物过滤并将粗产物用己烷沉淀并用于下一步骤。

5.用于g至o⁶-meg转变的具有内部伯氨基的寡核苷酸的合成

通过使用核苷亚磷酰胺构建单元的标准自动化寡核苷酸合成来制备含有5-氨基烯丙基-2'-脱氧胞苷残基或2-(2-氨乙基)-1,3-丙烯残基的寡核苷酸。5'-二甲氧基三苯甲基-5-(e)-(3-三氟乙酰氨基烯丙基)-n⁴-甲脒-2'-脱氧胞苷3'-亚磷酰胺或1-(4,4-二甲氧基三苯甲基)-2-[2-三氟乙酰氨基]乙基-3-亚磷酰胺用于掺入寡核苷酸中的一个或多个特定位置。通过在50℃下用浓氢氧化铵处理3小时将寡核苷酸去保护。通过阴离子交换和反相hplc的组合来分离和纯化粗寡核苷酸。通过质谱确认结构和序列。

6.4-{[甲基(亚硝基)氨基]甲氧基}-4-氧代-丁酸的nhs酯至具有伯氨基的寡核苷酸的缀合(图13)

将含有伯氨基的修饰的寡核苷酸溶于dmf-0.1m碳酸氢钠(1:3)混合物中，并加入10摩尔过量的4-[[甲基(亚硝基)氨基]甲氧基]-4-氧代-丁酸的nhs酯。混合物在室温下搅拌2小时。将混合物用5体积的100mm的teab稀释，并通过阴离子交换和反相色谱的组合来纯化寡核苷酸-4-[[甲基(亚硝基)氨基]甲氧基]-4-氧代-丁酸缀合物。具有非核苷单元的寡核苷酸可用于g至0⁶-meg转变腺苷模拟物)或u至0⁴-meu转变(胞苷模拟物)。

实施例5

用于u至o⁴-me-u转变的具有2'-脱氧腺苷-亚硝基-n-甲基缀合物的编辑寡核苷酸(胞苷模拟物)的合成

a.7-脱氮-7-氨甲基-n-苯甲酰基-5'-dmt-da-亚磷酰胺的合成

1.7-脱氮-7-甲酰氨基-n⁶-苯甲酰基-2'-脱氧腺苷的制备(图14a)

将2'-去氧桑吉瓦霉素(2’-deoxysangivamycin)(maruyama等人j.med.cmem.1983,vol.26pp.25-29)与无水吡啶一起共蒸发3次。然后将残留物溶于吡啶和苯甲酰氯(9:1)的混合物中，并将所得混合物在室温下搅拌24小时。将烧瓶在冰水浴中冷却，并缓慢加入等体积的甲醇。一旦加入甲醇，将混合物静置1小时。将溶液蒸发，并使用逐步梯度的在dcm中的甲醇通过硅胶层析法或者可替换地通过以100mm的三乙基碳酸氢铵中的乙腈梯度的反相hplc来纯化粗7-脱氮-7-甲酰氨基-n⁶-苯甲酰基-2'-脱氧腺苷。将含有纯产物的部分合并、蒸发并在高真空下干燥。通过nmr和质谱确认该核苷的结构。

2.7-脱氮-7-氨甲基-n⁶-苯甲酰基-2'-脱氧腺苷的制备(图14b)

将7-脱氮-7-甲酰氨基-n⁶-苯甲酰基-2'-脱氧腺苷在室温下用thf中的氢化二异丁基铝(3摩尔当量)的1m溶液处理12小时。将混合物倒入剧烈搅拌的罗谢尔盐(1.2m的酒石酸钾钠水溶液)溶液中。将溶液剧烈搅拌2小时，并用dcm萃取混合物。有机层用硫酸钠干燥并蒸发。通过以100mm的三乙基碳酸氢铵中的乙腈梯度的反相hplc来纯化粗7-脱氮-7-氨甲基-n⁶-苯甲酰基-2'-脱氧腺苷。将含有纯7-脱氮-7-氨甲基-n⁶-苯甲酰基-2'-脱氧腺苷的部分合并、蒸发并与甲醇一起共蒸发以及与无水吡啶一起共蒸发二次。

3.5'-二甲氧基三苯甲基-n⁶-苯甲酰基-7-脱氮-7-(三氟乙酰氨基)甲基-2'-脱氧腺苷的制备(图14c)

将7-脱氮-7-氨甲基-n⁶-苯甲酰基-2'-脱氧腺苷溶于无水吡啶中，并加入10摩尔当量的三氟乙酸酐。将混合物在室温下搅拌1小时。将烧瓶在冰水浴中冷却至0℃，加入等体积的甲醇，并在30分钟后，将混合物在减压下蒸发。将混合物与甲醇一起共蒸发三次，以及用无水吡啶一起共蒸发两次。将残留物溶解于吡啶中。

加入dmt-氯化物(1.2当量)，并将混合物在室温下搅拌6小时。然后将混合物在减压下蒸发，并将残留物溶于dcm中。使用逐步梯度的在dcm中的甲醇通过硅胶层析法纯化5'-二甲氧基三苯甲基-n⁶-苯甲酰基-7-脱氮-7-(三氟乙酰氨基)甲基-2'-脱氧腺苷。将含有纯产物的部分合并、蒸发并在高真空下干燥。通过nmr和质谱确认该核苷的结构。

4.5'-二甲氧基三苯甲基-n⁶-苯甲酰基-7-脱氮-7-(三氟乙酰氨基)甲基-2'-脱氧腺苷3'-亚磷酰胺的制备(图14d)

将5'-二甲氧基三苯甲基-n⁶-苯甲酰基-7-脱氮-7-(三氟乙酰氨基)甲基-2'-脱氧腺苷溶于dcm中，并加入1当量的三乙胺和1.1当量的2-氰乙基n,n-二异丙基氯亚磷酰胺。2小时后，将混合物在旋转蒸发器上蒸发，并将残留物溶于乙酸乙酯中。在含有0.1％的吡啶的己烷-乙酸乙酯中通过硅胶层析法纯化粗5'-二甲氧基三苯甲基-n⁶-苯甲酰基-7-脱氮-7-(三氟乙酰氨基)甲基-2'-脱氧腺苷3'-亚磷酰胺。将含有纯产物的部分合并、蒸发并在高真空下干燥。通过nmr和质谱确认该核苷的结构。

b.用于u至o⁴-me-u转变的具有内部伯氨基的寡核苷酸的合成

通过使用核苷亚磷酰胺构建单元的标准自动化寡核苷酸合成来制备含有7-脱氮-7-氨甲基-2'-脱氧腺苷残基或2-(2-氨基乙基)-1,3-丙烯残基的寡核苷酸。将5'-二甲氧基三苯甲基-n⁶-苯甲酰基-7-脱氮-7-(三氟乙酰氨基)甲基-2'-脱氧腺苷3'-亚磷酰胺或1-(4,4-二甲氧基三苯甲基)-2-[2-三氟乙酰氨基]乙基-3-亚磷酰胺用于掺入寡核苷酸中的一个或多个特定位置。通过在50℃下用浓氢氧化铵处理3小时将寡核苷酸去保护。通过阴离子交换和反相hplc的组合来分离和纯化粗寡核苷酸。通过质谱确认结构和序列。

c.4-[[甲基(亚硝基)氨基]甲氧基]-4-氧代-丁酸的nhs酯至具有伯氨基的寡核苷酸的缀合(图15)

将含有伯氨基的修饰的寡核苷酸溶解于dmf-0.1m的碳酸氢钠(1:3)混合物中，并加入10摩尔过量的4-[[甲基(亚硝基)氨基]甲氧基]-4-氧代-丁酸的酯。将混合物在室温下搅拌2小时。然后将混合物用5体积的100mm的三乙基碳酸氢铵稀释，并通过阴离子交换和反相色谱的组合来纯化寡核苷酸-4-[[甲基(亚硝基)氨基]甲氧基]-4-氧代-丁酸缀合物。

实施例6

使用含有亚硝胺甲基化基团的编辑寡核苷酸的在mrna中u至o⁴-me-u转变的方案(图16)

图16中示出了一种示意性合成方法的实施例。

实施例7

使用含有亚硝胺甲基化基团的编辑寡核苷酸的在mrna中g至o⁶-me-g转变的方案(图17)

图17中示出了一种示意性合成方法的实施例。

实施例8

使用含有亚硫酸氢盐生成基团的编辑寡核苷酸在mrna中c至u转变的方案(图18)

图18中示出了一种示意性合成方法的实施例。

实施例9

用于优化编辑寡核苷酸的长度和定位的过程

尽管定位编辑寡核苷酸(其中编辑寡核苷酸在编辑位点上大致居中(编辑位点在中间))通常会引起一定程度的编辑效率，但这不一定是最佳的。当靶向突变校正或其他靶序列改变(例如产生特定保护等位基因)时，总靶位点是由所期望的序列改变的位置确定。在这种情况下，编辑寡核苷酸沿着靶位点的长度和5'-3'定位的可选的优化有些受限制，并且可以如下进行。在dna靶的情况下，可以设计编辑寡核苷酸以靶向被靶向的dna的正义链或反义链。在rna靶的情况下，编辑寡核苷酸只能设计成与被靶向的rna互补。在靶向dna或靶向rna的两种情况下，优化可以从大约以被靶向突变为中心的母体编辑寡核苷酸开始。编辑寡核苷酸可以具有本文所述的化学修饰模式之一。优选地，用于筛选位点的初始编辑寡核苷酸具有简单的端基封闭的修饰模式，其可以简单地在长度以及5'和3'定位上变化。在通过被靶向的核碱基的化学修饰起作用的编辑寡核苷酸的情况下，碱基修饰活性将必须保持位于被靶向的核碱基附近。

在靶向基因以完全或部分失活的情况下，沿着基因的靶位点选择受到的限制少得多，并且可以沿着该基因选择一个或许多个靶位点用于使用和筛选。例如，大多数基因将通过在沿着编码序列的多个序列之一产生预成熟终止密码子而被完全或部分失活。编辑寡核苷酸可以针对这些靶位点中一个或多个产生，并可在细胞或生物体中对于相关编辑效率和可能的特异性进行测试。基于该初始筛选具有最理想特性的许多编辑寡核苷酸可以进行如下所述的位置和长度优化。

关于dna靶，优选从具有约40个至约72个核苷酸长度的编辑寡核苷酸开始。当靶向rna时，优选从18-25个核苷酸的编辑寡核苷酸开始。然后编辑寡核苷酸可以以1个到大约10个核苷酸增量向5'和3'方向移位。可以测试每个产生的序列在细胞或生物体中的活性，以确定编辑效率以及还确定潜在的编辑特异性。基于这些结果，可以确定最佳的一个或多个位置。从第一轮优化具有所期望的编辑效率范围的编辑寡核苷酸序列开始，可以通过以1个至约20个核苷酸的增量在5'末端、3'末端或者5'和3'末端二者上添加或去除与靶互补的碱基来修饰编辑寡核苷酸序列的长度。细胞或生物体中针对功效和潜在的特异性的额外测试将产生一个引导或多个引导编辑寡核苷酸序列(leadeditingoligonucleotidesequence)。可替换地，可以首先从母体序列开始优化长度，并然后可以通过将编辑寡核苷酸向5'和/或3'方向移动来进一步优化所得到的一个或多个引导物。

一旦已经确定了优化的长度、链(反义或正义)和5'-3'定位(或者在不进行该过程的情况下，非优化的寡核苷酸序列可以用作起始点)，则具有期望功效的任何编辑寡核苷酸序列可以相对于化学修饰模式而变化，并在细胞或生物体内进行测试。当在优化期间增加或减少母体编辑寡核苷酸的长度时，优选地，5'编辑片段、编辑位点和3'编辑片段将保持相对于编辑位点相同或基本上相同的长度和定位，而5'近端片段和3'近端段的长度将增加或减小。可替换地，5'末端片段、5'近端片段、3'近端片段和3'末端片段将保持相对于编辑寡核苷酸的末端相同或基本相同的长度和位置，并且5'编辑片段和3'编辑片段的长度将增加或减少。