具有聚酯降解活性的新多肽及其用途的制作方法
本发明涉及一种具有聚酯降解活性的新多肽及其用于降解含聚酯材料如塑料产品的用途。本发明还涉及产生所述多肽的小单孢菌属的一种新型分离细菌菌株以及产生所述多肽的方法。本发明还涉及含有所述多肽和至少一种聚酯的塑料复合物。
背景技术：
聚酯特别是以塑料材料的形式被用于大量的技术领域中，从食品包装到医疗领域，经由服装和汽车工业等。例如，某些聚酯(例如，聚对苯二甲酸乙二醇酯-pet、聚乳酸-pla等)被用在衣服、地毯的制造中，但还以热固性树脂的形式用于包装或汽车塑料或其他部件的制造。
因此，历经过去数十年，含聚酯塑料的产量已显著增加。这些塑料中超过50％被用于一次性可丢弃应用如包装、农用膜、可丢弃消费品或用于在制造后一年内被丢弃的短期产品。遗憾的是，视局部环境因素如紫外光暴露水平、温度、适合微生物的存在等而定，塑料可存留数十年。因此，在世界范围内，大量塑料堆积在填埋场所中和天然栖息地中，从而产生递增的环境问题。
用以减少与塑料的积聚相关的环境和经济影响的一种解决方案是再循环，其中以机械方式再加工塑料材料以制造新产品。然而，实际的再循环方法使用大量电力，特别是在挤出步骤期间，并且所用设备也是昂贵的，从而导致相较于原始塑料可能不具竞争性的高昂价格。
用于再循环塑料的另一潜在方法由允许回收聚合物的化学组分的化学再循环组成。所得单体可接着用于再制造塑料或制备其他合成化学品。然而，迄今为止，这样的再循环方法仅已对纯化的聚合物执行，而对由结晶和非晶聚合物及添加剂的混合物构成的原有塑料产品并不高效。此外，这样的再循环方法是昂贵的，从而导致单体相较于原始单体不具竞争性。
在另一方面，酶促降解被视为一种理想的废物处理方法，因为酶可加速塑料的水解并可被并入有机材料的自然循环中。此外，水解产物(即，单体和低聚物)可作为聚合物的材料再循环。因此，通过酶来使塑料产品中含有的聚合物解聚作为现有的且不令人满意的方法的替代方案而受到极大关注。
然而，此酶法迄今为止未导致降解含聚酯材料的有效以及工业酶促方法的实施。
实际上，已知许多细菌具有降解聚酯的能力。例如，关于聚乳酸，存在对源于放线菌(actinomycetes)如拟无枝菌酸菌属种(amycolatopsissp.)(菌株k104-1)以及源于溶淀粉类芽孢杆菌(paenibacillusamylolyticus)(菌株tb-13)的降解酶的报道。然而，迄今为止，所鉴定的多肽具有不良降解能力，并且仅允许降解呈乳液形式的聚合物。关于能够降解呈膜或丸粒形式的含聚酯材料的微生物的报道数量有限，并且对它们的酶知之甚少。此外，大多数所鉴定的多肽仅在升高的温度下有效。因此，它们的使用将增加热降解过程的成本。
鉴于先前所述，对适于降解聚酯、更特别是适于降解塑料产品中含有的聚酯的新型酶存在需要。
技术实现要素：
本申请人进行的工作已导致鉴定出具有聚酯降解活性的新型多肽。这种新的多肽最先从小单孢菌属细菌的菌株中分离出来。此多肽在本领域中从未见报道或分离。发明人还已证实，所述多肽的出人意料且显著的聚酯降解活性可被有效地用于降解含聚酯材料如塑料产品。发明人还已鉴定出一种本身不展现任何降解活性、但令人惊奇地显示出降低相关降解酶呈现活性的温度这一能力的辅助多肽。所述辅助多肽也可与降解酶一起使用来增加低温下的聚酯降解。
然后，本发明尤其是来源于对这些具有降解聚酯的显著性质和/或优化聚酯降解的新的多肽的鉴定。基于这些出人意料的性质，本发明的多肽可被成功地用于甚至在工业规模上获得塑料产品中含有的聚酯的降解。
因此，本发明的一个目的是提供一种具有聚酯降解活性并且包含与seqidn°l中示出的全长氨基酸序列至少75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％的同一性、优选至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性的多肽。
本发明的又一个目的是提供一种多肽，其具有聚酯降解活性并且在c-末端或n-末端处包含具有与seqidn°3中示出的全长氨基酸序列至少75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％的同一性的氨基酸序列。
本发明的另一个目的是提供一种表达和任选地分泌如上定义的多肽的小单孢菌属的分离细菌菌株。
本发明的另一个目的是一种编码如上定义的多肽的核酸。本发明还涉及一种包含如上定义的核酸的表达盒并涉及一种包含如上定义的核酸或表达盒的载体。
本发明还涉及一种含有至少一种如上定义的核酸或表达盒或载体的重组细胞或宿主细胞、优选重组微生物，并还涉及优选展现酶活性的其提取物。
本发明还涉及一种产生本发明的多肽的方法，所述方法包括(i)培养如上定义的重组细胞或小单孢菌，(ii)回收培养上清液，和任选地(iii)分离或纯化多肽。
本发明还提供了一种包含如上定义的多肽、重组细胞、小单孢菌菌株或其提取物的降解组合物。
本发明还涉及所述多肽、降解组合物、重组细胞、小单孢菌菌株或其提取物用于降解含聚酯材料的用途。
本发明的又一个目的是提供一种用于降解含聚酯材料的方法，其中使含聚酯材料与如上定义的多肽、重组细胞或小单孢菌菌株或其提取物、或降解组合物接触。
本发明还涉及一种从含聚酯材料产生单体和/或低聚物的方法，其包括将含聚酯材料暴露于如上定义的多肽、降解组合物、重组细胞或小单孢菌菌株或其提取物和任选地回收单体和/或低聚物。
本发明还涉及一种含有如上定义的多肽、重组细胞、小单孢菌菌株或其提取物和至少一种聚酯的塑料复合物。
附图说明
图1示出了本发明的聚酯降解多肽的plla降解活性。已从本发明的“s0002”液体培养上清液的小单孢菌菌株成功地回收了活性plla降解酶。plla降解活性可通过使用酶谱凝胶在从基本培养基、r2培养基和rs培养基回收的酶中检测。
图2示出了与对照物相比，在1天和6天后表达本发明的聚酯降解多肽(培养上清液)的变铅青链霉菌宿主系统的pla降解活性。
图3为蛋白酶k(protk)这一在日本专利jp2013000099中公开的日本酶和如seqidn°7中示出的多肽(也称多肽m2)的序列比对。根据蛋白质序列比对，多肽m2与蛋白酶k共享27％的同一性，与jp2013000099酶共享41％的同一性。由辅助肽组成的多肽m2的序列含在框中。
图4示出了用于回收/浓缩分泌酶的切向过滤系统。来自每一个实验步骤的样品的plla降解活性测定(如图所示)。
图5示意了ph对本发明的聚酯降解多肽的活性的影响。已在各种ph下进行plla降解活性试验。将酶样品加载到用各种ph的缓冲液制成的乳化的plla琼脂糖平板上并于37℃下孵育48小时。
图6示出了温度对本发明的聚酯降解多肽的活性的影响。已分别于37℃(图6a)和60℃(图6b)下进行plla降解活性浊度试验。乳化的plla的降解导致浊度的减小。
图7示出了工业固体材料(高分子量半结晶pla膜)的降解和相应的乳酸回收。示出了膜重量损失百分数。(a)由本发明的小单孢菌菌株s0002的分泌酶在37℃下降解48小时的膜和对照物的照片。(b)由小单孢菌菌株s0002培养物在37℃下降解30天的膜和对照物的照片。(c)图示出了总膜重量损失和在(b)的培养上清液中产生和检测到的乳酸。
图8示意了各种酶在各种温度(28℃、37℃和45℃，ph10)下、在培养上清液中的pla降解活性(pla向乳酸的转化)：(a)jp20130099酶，(b)含有jp2013000099酶和如seqidn°3中示出的辅助肽的嵌合体酶，和(c)小单孢菌菌株s0002的酶。
图9示出小单孢菌菌株s0002在r2琼脂平板上降解聚l-乳酸(r2-plla)、聚d-乳酸(r2-pdla)、聚丁二酸丁二醇酯(r2-pbs)和聚羟基链烷酸酯(r2-pha)。
图10示出了使用来自小单孢菌菌株s0002的粗制上清液，在37℃和ph10下，pla向乳酸的转化，这些菌株在不同的条件下初步生长，即：在rs培养基(rs)中20天后，在补充有(k1-2d和k2-2d)或未补充(m)10g.l-1(k1-2d)或20g.l-1(k2-2d)明胶的mmk培养基中2天，和在补充有20g.l-1明胶的mmk培养基中4天(k2-4d)。
图11示意了多肽m2对各种含有pla的市售物品的降解(pla随时间转化为乳酸的百分数)。
具体实施方式
以下是本发明的描述，包括一般性地给出的其优选实施方案。本发明将在下文的标题“实施例”下给出的公开内容中进一步示例，“实施例”提供了支持本发明的实验数据和实施本发明的措施。
定义
参考以下定义将最好地理解本公开内容。
与材料有关的术语“分离的”和“纯化的”可互换使用并指所述材料(例如，肽、核酸、细胞)从其原始或天然环境移出。例如，分离的多肽通常没有其通常缔合于或其通常与之混合或与之在溶液中的至少一些多肽或其他细胞组分。分离的多肽包括以纯化或部分纯化形式的所述天然产生的多肽、重组多肽、由宿主细胞表达或分泌的多肽以及宿主细胞或其培养物或提取物中的多肽。关于核酸，术语“分离的”表示例如该核酸不处于其天然基因组情形下(例如，在载体、表达盒中，连接到启动子，或人工引入于异源宿主细胞中)。分离的菌株指已从其天然或原始环境提取出的微生物细胞。
如本文所用，术语“菌株”指具有共同特征的特定物种的微生物。
如本文所用，术语“序列同一性”或“同一性”指由比对两个多肽序列获得的在各位置中的匹配物(同一氨基酸残基)的数目(％)。序列同一性通过在对准以使重叠和同一性最大、同时使序列空位数最少时比较序列来确定。特别地，视两个序列的长度而定，序列同一性可使用许多数学整体或局部比对算法中的任一种来确定。长度类似的序列优选使用历经整个长度来将序列最优比对的整体比对算法(例如，needleman和wunsch算法；needlemanandwunsch,1970)来比对，而长度显著不同的序列优选使用局部比对算法(例如，smith和waterman算法(smithandwaterman,1981)或altschul算法(altschuletal.,1997；altschuletal.,2005))来比对。出于确定氨基酸序列同一性百分数的目的的比对可以以属于本领域中的技能的各种方式实现，例如，使用可在互联网网站如http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/或http://www.ebi.ac.uk/tools/emboss/上获得的可公开获得的计算机软件。本领域技术人员可确定适用于测量比对的参数，包括为历经所比较序列的全长实现最大对准所需的任何算法。出于本文的目的，氨基酸序列同一性％数值指使用成对序列比对程序embossneedle产生的数值，所述程序使用needleman-wunsch算法产生两个序列的最优整体比对，其中所有搜索参数都设置为缺省值，即评分矩阵＝blosum62，空位开放＝10，空位延伸＝0.5，末端空位罚分＝false，末端空位开放＝10，末端空位延伸＝0.5。
如本文所用，术语“表达”指多肽的产生中涉及的任何步骤，包括但不限于转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰和分泌。
在本文中，术语“肽”、“多肽”、“蛋白质”和“酶”可互换使用，并指由肽键连接的氨基酸的链，而与形成所述链的氨基酸的数目无关。氨基酸在本文中由它们的根据以下命名法的单字母或三字母代码表示：a：丙氨酸(ala)；c：半胱氨酸(cys)；d：天冬氨酸(asp)；e：谷氨酸(glu)；f：苯丙氨酸(phe)；g：甘氨酸(gly)；h：组氨酸(his)；i：异亮氨酸(ile)；k：赖氨酸(lys)；l：亮氨酸(leu)；m：甲硫氨酸(met)；n：天冬酰胺(asn)；p：脯氨酸(pro)；q：谷氨酰胺(gln)；r：精氨酸(arg)；s：丝氨酸(ser)；t：苏氨酸(thr)；v：缬氨酸(val)；w：色氨酸(trp)和y：酪氨酸(tyr)。
在本发明的上下文中，“含聚酯材料”也称“含聚酯塑料产品”，指包含至少一种呈结晶、半结晶或完全非晶形式的聚酯的产品，如塑料产品或塑料制品。在一个特别的实施方案中，含聚酯材料指由至少一种塑料材料制得的任何物品，如塑料薄片、管子、棒条、型材、模型、膜、大块等，所述物品含有至少一种聚酯以及可能其他物质或添加剂如增塑剂、无机或有机填料。在一个特别的实施方案中，含聚酯材料含有聚酯和至少一种附加的聚合物如聚烯烃，其相对于彼此以它们不能被易于分开的方式安置。优选地，含聚酯材料由结晶和非晶聚酯、和/或半结晶聚酯以及添加剂的混合物构成。更优选地，含聚酯材料是制造的产品，如包装、农用膜、可丢弃物品等。
在本描述中，“聚酯”涵盖但不限于聚对苯二甲酸乙二醇酯(pet)、聚对苯二甲酸丙二醇酯(ptt)、聚对苯二甲酸丁二醇酯(pbt)、聚对苯二甲酸乙二醇酯共对苯二甲酸异山梨醇酯(peit)、聚乳酸(pla)、聚(l-乳酸)(plla)、聚(d-乳酸)(pdla)、聚(d,l-乳酸)(pdlla)、pla立体复合物(scpla)、聚羟基链烷酸酯(pha)、聚(3-羟基丁酸酯)(p(3hb)/phb)、聚(3-羟基戊酸酯)(p(3hv)/phv)、聚(3-羟基己酸酯)(p(3hhx))、聚(3-羟基辛酸酯)(p(3ho))、聚(3-羟基癸酸酯)(p(3hd))、聚(3-羟基丁酸酯-共-3-羟基戊酸酯)(p(3hb-共-3hv)/phbv)、聚(3-羟基丁酸酯-共-3-羟基己酸酯)(p(3hb-共-3hhx)/(phbhhx))、聚(3-羟基丁酸-共-4-羟基丁酸)(p(3hb-共-4hb))、聚(3-羟基丁酸酯-共-5-羟基戊酸酯)(phb5hv)、聚(3-羟基丁酸酯-共-3-羟基丙酸酯)(phb3hp)、聚羟基丁酸酯-共-羟基辛酸酯(phbo)、聚羟基丁酸酯-共-羟基十八酸酯(phbod)、聚(3-羟基丁酸酯-共-3-羟基戊酸酯-共-4-羟基丁酸酯)(p(3hb-共-3hv-共-4hb))、聚丁二酸丁二醇酯(pbs)、聚丁二酸丁二醇酯共己二酸丁二醇酯(pbsa)、聚己二酸丁二醇酯共对苯二甲酸丁二醇酯(pbat)、聚呋喃酸乙二醇酯(pef)、聚己内酯(pcl)、聚(己二酸乙二醇酯)(pea)以及这些聚合物的共混物/混合物。
“聚合物”指结构由多个由共价化学键连接的重复单元构成的高分子。在本发明的上下文中，术语聚合物涵盖由单一类型的单体构成的天然和合成聚合物(即，均聚物)或由两种或更多种不同类型的单体构成的天然和合成聚合物(即，共聚物)。
根据本发明，“低聚物”指含有2至约20个单体单元的分子。
根据本发明，关于多肽、组合物或细胞的表述“具有聚酯降解活性”指从聚酯产生单体和/或低聚物和/或减轻含聚酯材料的重量的能力。
在本发明的上下文中，酶的“最适温度”指所述酶的反应速率最高的温度，即酶最优地起作用的温度。一般来说，温度的升高将使反应速率提高直至所述最适温度。超过所述最适温度，酶将失去其活性并变性。每一种酶具有其自身的最适温度，该最适温度可通过本领域本身已知的技术而容易地确定。酶的活性范围因此由活性开始的温度和蛋白质开始变性的温度决定。
新的多肽
本发明涉及一种具有降解其分子结构中具有酯键的塑料的能力的新的多肽。更特别地，本发明公开了一种展现聚酯酶活性的新鉴定和分离的多肽。所述多肽最先从天然的小单孢菌菌株中分离出来。有趣的是，本发明的多肽能够水解天然和人造聚酯中的酯键。本发明还涉及一种本身不具有降解活性的辅助多肽，其可与酶一起使用以降低其最适温度和/或一般性地提高所述酶在活性范围内的反应速率。
因此，本发明的一个目的是提供一种具有聚酯降解活性并且包含与seqidn°l中示出的全长氨基酸序列至少75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％的同一性、优选至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性的多肽。
在本发明的上下文中，表述“具有聚酯降解活性的多肽”、“具有聚酯酶活性的多肽”或“聚酯酶”可互换使用，以指代能够水解酯键的同一酶。
根据本发明，所述多肽具有降解聚酯直至成为单体和低聚物的能力。有趣的是，本发明的多肽能够降解非晶、结晶或半结晶的聚酯。此外，与现有技术的聚酯酶相比，所述多肽在低温下(即，在约30-40℃下)显示出出人意料的降解活性。
在一个特别的实施方案中，多肽包含seqidn°l中示出的氨基酸序列的全部或生物活性部分。多肽的“生物活性部分”更具体地指定该多肽的赋予或展现整个多肽的聚酯酶活性的部分。活性部分可例如赋予底物特异性或亲和力，它可含有催化位点。多肽的活性部分也指定多肽的成熟形式(即，在多肽的n-末端处不含有信号肽)。在一个实施方案中，生物活性部分包含seqidn°l的氨基酸125至376，其含有多肽的催化位点和钙结合位点。在另一个特别的实施方案中，生物活性部分包含seqidn°l的氨基酸150-190、245-275和335-345，其含有多肽的催化三联体和活性位点。
本发明的又一个实施方案是提供一种包含seqidn°1中示出的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成的多肽。
在一个特别的实施方案中，聚酯降解多肽还包含与seqidn°3中示出的全长氨基酸序列至少75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％的同一性。
优选地，seqidn°3的部分或全长氨基酸序列位于seqidn°1的部分或全长氨基酸序列的c-末端或n-末端处。此另外的氨基酸序列形成允许降低本发明的聚酯降解多肽的最适温度的辅助多肽。辅助多肽也可增大聚酯降解多肽的活性范围。在一个优选的实施方案中，辅助多肽稠合到聚酯降解多肽。然而，所述辅助多肽也可与聚酯降解多肽混合使用。在一个特别的实施方案中，辅助多肽至少包含seqidn°3的氨基酸149至226。
因此，本发明的另一个目的是提供一种包含与seqidn°3中示出的全长氨基酸序列至少75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％的同一性的辅助肽。所述辅助肽可稠合到酶，如解聚酶，并优选稠合到该酶的c-或n-末端。或者，辅助多肽可与酶混合使用。
本发明的酶在约20℃至约70℃、优选地30℃至55℃、更优选地30℃至40℃的温度范围内、甚至更优选地在37℃下特别有活性。通过使用本发明的辅助多肽，酶的最适温度可降低直至40℃、39℃、38℃、37℃、36℃、35℃或更低。类似地，通过使用辅助多肽，本发明的酶的活性范围可从约20℃增至约70℃。
本发明的聚酯降解多肽在5至11的ph范围内、优选地在8至11的ph范围内、更优选地在ph10下特别有活性。
本发明的聚酯降解多肽有利地具有至少0.02g.mg-1.h-1、0.05g.mg-1.h-1、0.1g.mg-1.h-1、0.15g.mg-1.h-1、0.2g.mg-1.h-1、0.5g.mg-1.h-1、1g.mg-1.h-1、1.5g.mg-1.h-1或2g.mg-1.h-1的生产率。“生产率”指的是在9和11之间的ph下和在37℃+/-5℃的温度下每单位多肽和每单位时间形成的降解产物(即，单体)的量。
本发明的多肽对于降解聚乳酸(pla)、更特别是聚(l-乳酸)(plla)或聚(d-乳酸)(pdla)特别有用。本发明的多肽还对于降解聚丁二酸丁二醇酯(pbs)和聚羟基链烷酸酯(pha)特别有用。
本发明还涉及一种包含辅助肽的解聚酶，其中所述辅助肽具有与seqidn°3中示出的全长氨基酸序列至少75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％的同一性。在一个特别的实施方案中，辅助肽位于解聚酶的n-或c-末端处。有利地，所述解聚酶为聚酯酶。
一般来说，辅助多肽与解聚酶的一起使用允许降低所述解聚酶的最适温度。辅助肽与解聚酶的使用还允许增大所述解聚酶的活性范围。
在一个特别的实施方案中，本发明的多肽固定化于固体载体上。所述多肽可通过现有技术中描述的任何适宜的方法固定化，例如，共价结合、吸附、包埋或膜限制。可使用各种各样的载体来固定化本发明的多肽。待选择的载体取决于它所致力的用途。方便的载体涵盖但不限于塑料、金属、无机载体如玻璃、二氧化硅、氧化铝、膨润土、羟基磷灰石、镍/氧化镍、钛、氧化锆、聚合物载体等。载体可呈表面、粉末、微米或纳米珠粒、凝胶、溶剂溶胀或水溶胀凝胶或基质、网状基质或凝胶、膜、纤维状载体、多孔载体等的形式。固定化多肽的方法是本领域技术人员熟知的(参见例如tischerandwedekind,topicsincurrentchemistry,1999,200,95-126和alloueetal,biotechnolagronsocenviron2008,12,57-68；它们的公开内容以引用方式并入本文)。
一旦制备，本发明的载体可被直接用于反应介质中。换句话说，本发明的载体可仅添加在反应介质中。当载体是溶剂溶胀的时，可选择反应的溶剂以便提供适宜的载体溶胀来致使所固定多肽可及而不损害多肽的催化活性。作为一种替代方案，载体可用于制备反应器，其可为例如酶反应器、膜反应器、连续流反应器如搅拌槽反应器、连续操作的填充床反应器、或连续操作的流化床反应器、或填充床反应器。在一些实施方案中，本发明的载体是可再循环的并可连续使用数次。
核酸
本发明的又一个目的是一种编码如上定义的多肽的核酸。
如本文所用，术语“核酸”、“核酸序列”、“多核苷酸”、“寡核苷酸”和“核苷酸序列”可互换使用，并指脱氧核糖核苷酸和/或核糖核苷酸的序列。核酸可为dna(cdna或gdna)、rna或两者的混合物。它可呈单链形式或呈双链体形式，或是两者的混合物。它可具有重组、人工和/或合成来源，并且它可包含修饰的核苷酸，所述修饰的核苷酸包含例如修饰的键、修饰的嘌呤或嘧啶碱基、或修饰的糖。
本发明的核酸可呈分离或纯化的形式，并通过本领域本身已知的技术制备、分离和/或操作，例如，克隆和表达cdna文库、扩增、酶促合成或重组技术。核酸也可通过如在例如belousov(1997)nucleicacidsres.25:3440-3444中所述的公知化学合成技术来在体外合成。
本发明还涵盖这样的核酸，其在严格条件下与编码如上定义的多肽的核酸杂交。优选地，这样的严格条件包括在2xssc/0.1％sds中在约42℃下孵育杂交滤膜约2.5小时，随后在1xssc/0.1％sds中在65℃下洗涤滤膜四次，每次15分钟。所用方案见述于如sambrook等人(molecularcloning:alaboratorymanual,coldspringharborpress,coldspringharborn.y.(1988))和ausubel(currentprotocolsinmolecularbiology(1989))的参考文献中。
本发明还涵盖编码本发明的多肽的核酸，其中所述核酸的序列或至少所述序列的一部分已使用优化密码子用法进行工程改造。
本发明的一个特定的实施方案在于一种编码具有聚酯酶活性的多肽的分离的核酸，其包含seqidn°2中示出的序列。
本发明的又一个实施方案在于一种编码具有聚酯酶活性的多肽并还包含seqidn°4中示出的序列的分离的核酸。
本发明的一个特定的实施方案在于一种编码具有聚酯酶活性的多肽的分离的核酸，其包含seqidn°6中示出的序列。
本发明的另一个特定的实施方案在于一种编码聚酯降解酶并还包含seqidn°4中示出的序列的分离的核酸。
或者，根据本发明的核酸可由根据本发明的多肽的序列推导并可根据核酸将在其中转录的宿主细胞调适密码子用法。这些步骤可根据本领域技术人员熟知的方法进行，所述方法中的一些见述于参考手册sambrook等人(sambrooketal.,2001)中。
本发明的核酸可还包含可用来导致或调控多肽在选定宿主细胞或系统中的表达的附加的核苷酸序列，如调控区，即启动子、增强子、沉默子、终止子、信号肽等。
本发明还涉及一种表达盒，其包含根据本发明的核酸，该核酸可操作地连接于一种或多种指导所述核酸在合适宿主细胞中的表达的控制序列。通常，表达盒包含根据本发明的核酸或由本发明的核酸组成，该核酸可操作地连接于转录启动子和转录终止子。
本发明还涉及一种包含如上定义的核酸或表达盒的载体。
术语“载体”指用作将重组遗传物质转移至宿主细胞内的运载体的dna分子。载体的主要类型有质粒、噬菌体、病毒、粘粒和人工染色体。载体自身通常是由插入物(异源性核酸序列、转基因)和充当载体的“骨架”的较大序列组成的dna序列。将遗传信息转移至宿主的载体的目的通常是在靶细胞中分离、繁殖或表达插入物。称为表达载体(表达构建体)的载体具体来说适合于在靶细胞中表达异源性序列，并通常具有驱动编码多肽的异源性序列的表达的启动子序列。通常，存在于表达载体中的调控元件包括转录启动子、核糖体结合位点、终止子和任选地存在的操纵子。优选地，表达载体还含有用于在宿主细胞中自主复制的复制起点、可选择标记、有限数目的可用限制性酶切位点以及高拷贝数潜力。表达载体的实例有克隆载体、修饰的克隆载体、专门设计的质粒和病毒。在不同宿主中提供合适的多肽表达水平的表达载体在本领域中是公知的。本领域中公知的细菌表达载体包括pet11a(novagen)、λgt11(invitrogen)。
本发明还涉及根据本发明的核酸、表达盒或载体用于转化、转染或转导宿主细胞的用途。载体的选择通常将取决于载体与将向其中引入载体的宿主细胞的相容性。
术语“重组体”指通过遗传工程改造产生的核酸构建体、载体、多肽或细胞。
本发明还涉及一种包含根据本发明的核酸、盒或载体的宿主细胞或重组细胞。宿主细胞可以以短暂或稳定的方式加以转化、转染或转导。将本发明的表达盒或载体引入宿主细胞内以使盒或载体作为染色体组成部分或作为自我复制性染色体外载体加以维持。可使用标准技术将表达盒或载体引入宿主细胞内。此类技术的实例包括转化、转染、脂质体转染、原生质体融合和电穿孔。
宿主细胞可为可被遗传修饰并优选被培养的任何细胞。细胞可以是真核的或原核的，如哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞、微生物如酵母菌、真菌或细菌细胞等。在一个特别的实施方案中，宿主细胞选自芽孢杆菌(bacillus)、乳酸菌、链霉菌(streptomyces)、木霉(trichoderma)、曲霉(aspergillus)、毕赤酵母(pichia)、耶罗威亚酵母(yarrowia)或小单孢菌(micromonospora)。应理解，本发明不限于任何特定的细胞类型，并可遵循公知常识应用于所有种类的细胞。术语“宿主细胞”也涵盖亲本宿主细胞的由于在复制期间发生的突变而不与所述亲本宿主细胞相同的任何子代。
在一个特别的实施方案中，本发明提供了一种被工程改造以表达seqidn°2中示出的核酸或其表达盒的宿主细胞。在又一个特别的实施方案中，本发明提供了一种被工程改造以表达还包含seqidn°4中示出的序列的核酸或其表达盒的宿主细胞。
在另一个特别的实施方案中，本发明提供了一种被工程改造以表达seqidn°6中示出的核酸或其表达盒的宿主细胞。
在又一个实施方案中，本发明提供了一种包含和表达编码多肽的核苷酸序列的宿主细胞，所述多肽包含与seqidn°1中示出的全长氨基酸序列至少75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％的同一性，优选地至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性，并具有聚酯降解活性。在又一个实施方案中，宿主细胞包含和表达编码辅助多肽的核苷酸序列，所述辅助多肽包含与seqidn°3中示出的全长氨基酸序列至少75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％的同一性。
在一个优选的实施方案中，这样的宿主细胞表达重组多肽，所述重组多肽既含与seqidn°1中示出的全长氨基酸序列至少75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％的同一性，优选地至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性，又含与seqidn°3中示出的全长氨基酸序列至少75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％的同一性。在一个特别的实施方案中，辅助多肽序列位于重组多肽的c-或n-末端处。或者，宿主细胞可彼此独立地表达聚酯酶和辅助多肽。
在一个特别的实施方案中，本发明提供了具有聚酯降解活性、更优选地pla降解活性、或pbs降解活性或pha降解活性的此类宿主细胞。
在一个特别的实施方案中，宿主细胞为重组微生物，如真菌、酵母菌或细菌。优选地，重组微生物选自原本具有聚酯降解活性的微生物。
分离的小单孢菌菌株
本发明的又一个目的在于提供一种表达和任选地分泌如上定义的多肽的小单孢菌属的分离细菌菌株。
在一个特别的实施方案中，分离的小单孢菌表达具有聚酯降解活性并包含与seqidn°1中示出的全长氨基酸序列至少75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％的同一性、优选地至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性的多肽。在又一个实施方案中，分离的小单孢菌菌株表达还包含与seqidn°3中示出的全长氨基酸序列至少75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％的同一性、优选地位于聚酯降解多肽的c-末端处或n-末端处的此类多肽。
本发明还涉及一种筛选细菌以选择表达具有聚酯降解活性的多肽的小单孢菌的方法，其包括：
(a)收集并在pla载体上生长细菌；
(b)分离pla载体上展现降解晕(degradationhalo)的细菌；和
(c)从步骤(b)的分离的细菌中选择其16srrna基因序列包含与seqidn°7中示出的全长氨基酸序列至少75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％的同一性的小单孢菌菌株。
在一个特别的实施方案中，所述方法还包括从步骤c)的分离的小单孢菌中选择表达多肽的小单孢菌的步骤，所述多肽包含与seqidn°1中示出的全长氨基酸序列至少75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％的同一性，优选地至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性。
本发明还涉及一种分离的小单孢菌菌株，其16srrna基因序列包含与seqidn°7中示出的全长氨基酸序列至少75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％的同一性。
在一个优选的实施方案中，分离的小单孢菌菌株在20℃至70℃、优选地30℃至55℃、更优选地30℃至40℃的温度范围内、甚至更优选地在37℃下是活性的。
有利地，分离的小单孢菌菌株在5至11的ph范围内、优选地在8至11的ph范围内、更优选地在ph10下是活性的。
在一个优选的实施方案中，分离的小单孢菌菌株具有聚乳酸(pla)降解活性，更特别是聚(l-乳酸)(plla)或聚(d-乳酸)(pdla)降解活性。在另一个优选的实施方案中，分离的小单孢菌菌株具有聚丁二酸丁二醇酯(pbs)降解活性和/或聚羟基链烷酸酯(pha)降解活性。
产生聚酯降解多肽的方法
本发明的又一个目的在于提供一种产生如上定义的聚酯降解多肽的方法，其包括(i)培养如上定义的重组细胞或小单孢菌，(ii)回收培养上清液，和任选地(iii)分离或纯化多肽。本发明还涉及通过该生产方法获得的此类多肽。
本发明的多肽可通过重组技术产生，或者其可从天然源、更特别是从小单孢菌菌株分离或纯化，或者其可人工产生。在本发明的上下文中，关于多肽的术语“源自微生物”指所述多肽已从此类微生物分离，或者所述多肽包含从此类微生物分离或表征的多肽的全部氨基酸序列或氨基酸序列的生物活性部分。或者，本发明的多肽可通过无细胞方法(kimetal.jbiosci.bioeng.july2009；spirinetal.(2007)frontmatterincell-freeproteinsynthesis:methodsandprotocols)产生或可化学合成。
本发明的多肽可通过本领域本身已知的技术来纯化，如色谱法(例如，离子交换、亲和、体积排阻、反相等)和沉淀法(例如，盐析、等电点、有机溶剂、非离子亲水聚合物等)，并以常规技术贮存。所述多肽可经进一步修饰以改善其稳定性或活性。其可原样使用、以纯化形式使用、单独地或与附加的酶组合地使用，以催化含聚酯材料的降解和/或再循环中涉及的酶促反应。所述多肽可呈可溶形式，或是在固相上。特别地，其可结合到细胞膜或脂质囊泡，或结合到合成载体如玻璃、塑料、聚合物、过滤器、膜，例如以珠粒、柱、板等的形式。
聚酯降解组合物
本发明的又一个目的在于提供一种包含如上定义的具有降解活性的多肽、一种或多种重组细胞、分离的小单孢菌菌株或其提取物、和任选地添加剂、赋形剂和/或反应物等的组合物。适宜的赋形剂涵盖生物化学中常用的缓冲剂；用于调节ph的试剂；防腐剂如苯甲酸钠、山梨酸钠或抗坏血酸钠；保存剂；保护或稳定剂如淀粉、糊精、阿拉伯树胶、盐、糖如山梨糖醇、海藻糖或乳糖、甘油、聚乙二醇、聚乙烯二醇、聚丙二醇、丙二醇；螯合剂如edta、氨基酸；载体如溶剂或水溶液；等。
在本发明的上下文中，术语“组合物”涵盖所有种类的包含本发明的多肽的组合物。组合物可呈固态或液态，如溶液、悬浮液、膏体、凝胶、冻干物、粉末或冷冻制剂。在一个优选的实施方案中，组合物为冻干物。
本发明的组合物可通过混合多肽与一种或若干种赋形剂来获得。本发明的组合物可包含0.1重量％至90重量％、优选地0.1重量％至50重量％、更优选地0.1重量％至30重量％、甚至更优选地0.1重量％至5重量％的本发明的多肽和10重量％至99.9重量％、优选地50重量％至99.9重量％、更优选地30重量％至99.9重量％、甚至更优选地95重量％至99.9重量％的一种或多种赋形剂。优选的组合物包含0.1重量％至5重量％之间的本发明的多肽。
在一个特别的实施方案中，组合物包含至少具有与seqidn°1中示出的全长氨基酸序列至少75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性、优选地至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的聚酯酶。有利地，组合物还包含具有与seqidn°3中示出的全长氨基酸序列至少75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性的辅助肽。优选地，辅助肽稠合到聚酯酶的c-或n-末端。或者，聚酯酶和辅助肽混合在组合物中。
本发明还提供了一种包含解聚酶、优选地聚酯酶的组合物，所述解聚酶在c-或n-末端处包含具有与seqidn°3中示出的全长氨基酸序列至少75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性的辅助肽。
根据本发明，组合物可还包含展现酶活性的附加的一种或多种多肽。本发明的多肽的量将易于由本领域技术人员视例如待降解的含聚酯材料的性质和/或组合物中含有的附加的酶/多肽来改变。
在一个特别的实施方案中，将本发明的多肽与一种或若干种赋形剂、尤其是能够稳定或保护多肽免遭降解的赋形剂一起溶解于水性介质中。然后可干燥、冻干或雾化所得混合物以获得粉末。
在又一个特别的实施方案中，本发明的组合物包含至少一种表达本发明的多肽的重组细胞或其提取物。“细胞的提取物”指定从细胞获得的基本上不含活细胞的任何部分，如细胞上清液、细胞碎片、细胞壁、dna提取物、酶或酶制剂或通过化学、物理和/或酶促处理而从细胞获得的任何制剂。优选的提取物为酶活性提取物。本发明的组合物可包含一种或若干种本发明的重组细胞或其提取物，以及任选地一种或若干种附加的细胞。或者或另外，组合物可包含野生型的如上定义的表达本发明的多肽的小单孢菌或其提取物。优选的提取物为酶活性提取物。
在一个特别的实施方案中，组合物由表达和分泌本发明的多肽的重组微生物的冻干培养基和/或本发明的小单孢菌组成或包含所述冻干培养基和/或小单孢菌。在一个特别的实施方案中，粉末包含本发明的多肽和稳定量/增溶量的山梨糖醇或糊精如麦芽糖糊精和/或环糊精。
在又一个实施方案中，本发明的多肽固定化于固体载体上。所述多肽可通过现有技术中描述的任何适宜的方法固定化，例如，共价结合、吸附、包埋或膜限制。可使用各种各样的载体来固定化本发明的多肽。待选择的载体取决于它所致力的用途。待选择的载体取决于它所致力的用途。方便的载体涵盖但不限于塑料、金属、无机载体如玻璃、二氧化硅、氧化铝、膨润土、羟基磷灰石、镍/氧化镍、钛、氧化锆、聚合物载体等。载体可呈表面、粉末、微米或纳米珠粒、凝胶、溶剂溶胀或水溶胀凝胶或基质、网状基质或凝胶、膜、纤维状载体、多孔载体等的形式。固定化多肽的方法是本领域技术人员熟知的(参见例如tischerandwedekind,topicsincurrentchemistry,1999,200,95-126和alloueetal,biotechnolagronsocenviron2008,12,57-68；它们的公开内容以引用方式并入本文)。
一旦制备，本发明的载体可被直接用于反应介质中。换句话说，本发明的载体可仅添加在反应介质中。当载体是溶剂溶胀的时，可选择反应的溶剂以便提供适宜的载体溶胀来致使所固定的多肽可及而不损害多肽的催化活性。作为一种替代方案，载体可用于制备反应器，其可为例如酶反应器、膜反应器、连续流反应器如搅拌槽反应器、连续操作的填充床反应器、或连续操作的流化床反应器、或填充床反应器。在一些实施方案中，本发明的载体是可再循环的并可连续使用数次。
降解含聚酯材料的方法
本发明提供了使用本发明的一种或多种多肽来降解和/或再循环含聚酯材料(如用聚酯制成或含聚酯的塑料产品)的方法。事实上，由于本发明的多肽高的聚酯解聚效率，故其相较于其他已知的化学或微生物聚酯降解措施远更有利。本发明的多肽对于以感兴趣的速率降解含pla、pbs和/或pha的材料可特别有用。
因此，本发明的一个目的是使用本发明的聚酯降解多肽、或相应的重组细胞或其提取物、或分离的小单孢菌菌株、或组合物来酶促降解含聚酯材料。在一个特别的实施方案中，多肽、或相应的重组细胞、其提取物、或分离的小单孢菌菌株、或组合物被用于含pla的材料的酶促降解，更优选地用于含plla或pdla的材料的酶促降解。在另一个特别的实施方案中，多肽、或相应的重组细胞、其提取物、或分离的小单孢菌菌株、或组合物被用于含pbs的材料或含pha的材料的酶促降解。
本发明的又一个目的在于与解聚酶一起使用如上定义的辅助肽来降解含pla、pbs和/或pha的材料。有利地，辅助肽稠合到解聚酶，优选地稠合到解聚酶的c-或n-末端。
本发明的另一个目的在于提供一种降解含聚酯材料的方法，其中使含聚酯材料与本发明的多肽、或相应的重组细胞或分离的小单孢菌菌株、或其提取物、或组合物接触。
有利地，含聚酯材料中的一种或多种聚酯被解聚直至成为单体和/或低聚物。在一个特别的实施方案中，所有目标聚酯都被解聚直至成为形成材料的原始聚酯的单体。
在降解方法的一个实施方案中，至少一种聚酯被降解以产生可再聚合的单体和/或低聚物，其有利地被回收以再次使用。
在另一个实施方案中，含聚酯材料中的一种或多种聚酯被完全降解。
在一个特别的实施方案中，含聚酯材料包含pla，更优选地plla和/或pdla，并且至少乳酸单体和/或低聚物被回收。
在一个特别的实施方案中，含聚酯材料包含pbs，并且至少丁二醇单体和/或低聚物和/或丁二酸单体和/或低聚物被回收。
在一个特别的实施方案中，含聚酯材料包含pha，更优选地(p(3hb-共-4-hb))，并且至少羟基酸或羟基丁酸单体和/或低聚物被回收。
在又一个实施方案中，含聚酯材料包含pla和至少一种优选选自以下的附加的聚酯：聚对苯二甲酸丙二醇酯(ptt)、聚对苯二甲酸丁二醇酯(pbt)、聚对苯二甲酸乙二醇酯(pet)、聚己二酸丁二醇酯共对苯二甲酸丁二醇酯(pbat)、聚羟基链烷酸酯(pha)、聚丁二酸丁二醇酯(pbs)、聚丁二酸丁二醇酯共己二酸丁二醇酯(pbsa)、聚己内酯(pcl)、聚(己二酸乙二醇酯)(pea)以及这些聚酯的共混物/混合物。
在一个特别的实施方案中，含聚酯材料包含pbs和至少一种优选选自以下的附加的聚酯：聚乳酸(pla)、聚对苯二甲酸丙二醇酯(ptt)、聚对苯二甲酸丁二醇酯(pbt)、聚对苯二甲酸乙二醇酯(pet)、聚己二酸丁二醇酯共对苯二甲酸丁二醇酯(pbat)、聚丁二酸丁二醇酯共己二酸丁二醇酯(pbsa)、聚羟基链烷酸酯(pha)、聚己内酯(pcl)、聚(己二酸乙二醇酯)(pea)以及这些聚酯的共混物/混合物。
在一个特别的实施方案中，含聚酯材料包含pha和至少一种优选选自以下的附加的聚酯：聚乳酸(pla)、聚对苯二甲酸丙二醇酯(ptt)、聚对苯二甲酸丁二醇酯(pbt)、聚对苯二甲酸乙二醇酯(pet)、聚己二酸丁二醇酯共对苯二甲酸丁二醇酯(pbat)、聚丁二酸丁二醇酯(pbs)、聚丁二酸丁二醇酯共己二酸丁二醇酯(pbsa)、聚己内酯(pcl)、聚(己二酸乙二醇酯)(pea)以及这些聚酯的共混物/混合物。
或者或另外，含聚酯材料也可含有至少一种聚酰胺(也称尼龙)和/或至少一种优选选自聚乙烯(pe)、聚丙烯(pp)以及这些聚酯的共混物/混合物的聚烯烃、和/或至少一种由乙烯基单体即含有碳-碳双键的小分子制得的乙烯基聚合物。
根据本发明，含聚酯材料也可含有金属化合物、无机化合物、玻璃化合物、天然或合成纤维、纸、木材、木材化合物如木质素、纤维素或半纤维素、淀粉以及它们的衍生物。
本发明还涉及一种从含聚酯材料产生单体和/或低聚物的方法，其包括将含聚酯材料暴露于本发明的多肽、或相应的重组细胞或分离的小单孢菌菌株或其提取物、或组合物和任选地回收单体和/或低聚物。本发明的方法对于产生乳酸单体或丁二醇单体或丁二酸单体或羟基酸单体特别有用。
当使用重组微生物时，这样的微生物将有利地展现修饰的代谢以防止从降解的聚酯获得的单体和/或低聚物被消耗。举例来说，在微生物中，降解所述单体和/或低聚物的酶已被移除或剔除。或者，可在含有至少一种可由重组微生物使用的碳源的培养基中执行本发明的方法，以使所述微生物优先消耗该碳源而非单体和/或低聚物。有利地，使含聚酯材料与含有重组微生物、作为碳源的葡萄糖等、以及可用氮源的培养基接触，所述氮源包括有机氮源(例如，蛋白胨、肉类提取物、酵母提取物、玉米浆)或无机氮源(例如，硫酸铵、氯化铵)。必要时，培养基可还含有无机盐(例如，钠离子、钾离子、钙离子、镁离子、硫酸根离子、氯离子、磷酸根离子)。此外，培养基也可补充以痕量组分如维生素、少量元素和氨基酸。
在一个特别的实施方案中，含聚酯材料可在与本发明的聚酯酶接触之前预处理，以物理地改变它的结构，以便增大聚酯与聚酯酶之间的接触表面。例如，可使含聚酯材料转变为乳液或粉末，其被添加到含有本发明的多肽和/或重组微生物或其提取物的液体介质中。或者，可在添加至含有重组微生物、其提取物和/或多肽的液体介质中之前，通过切割、冲击、压碎、研磨、分级、低温研磨等来将含聚酯材料机械研磨、粒化、丸粒化等，以减小材料的形状和尺寸。机械预处理也可为声波处理、离心、剪切、碰撞、采用高压均质器、用转鼓进行浸泡或液化、采用螺旋压机、圆盘筛粉碎机或活塞压机。或者或另外，可应用热预处理。这可用微波实现。这样的热预处理可提供消毒、巴氏杀菌或灭菌。在另一个实施方案中，含聚酯材料被化学预处理以改变它的结构并增大聚酯与本发明的多肽之间的接触表面。可使用碱、酸、溶剂或离子液体。也可实施臭氧化。也可使用激光处理。在一个特别的实施方案中，也可在降解之前分选、洗涤、消毒、灭菌和/或生物清洁含聚酯材料。根据本发明，可组合若干预处理。
降解含聚酯材料所需的时间可随含聚酯材料自身(即，塑料产品的性质和来源、它的组成、形状等)、所用多肽的类型和数量、以及各种工艺参数(即，温度、ph、附加的试剂等)而异。本领域技术人员可容易地使工艺参数适于含聚酯材料。
有利地，在包括在20℃与70℃之间、优选地30℃与55℃之间、更优选地30℃与40℃之间、甚至更优选地在约37℃的温度下实施方法。更通常地，使温度保持在失活温度以下，所述失活温度对应于多肽经受失活和/或重组微生物不再合成多肽的温度。
更通常地，使温度保持在本发明的多肽的最适温度下。更特别地，当本发明的多肽还包含本发明的辅助多肽的部分或全长序列时，该最适温度较低。
介质的ph可在5-11的ph范围内，优选在8-11的ph范围内，更优选在ph10下。有利地，根据目标聚酯以及目标单体/低聚物的溶解性调节ph以改进工艺效率。优选地，调节ph以保持在多肽的最优ph下。实际上，聚酯的解聚产生诱导ph降低的酸性单体和低聚物。可使用稀释碱的添加来抵消此酸化并将ph保持为最优ph。
有利地，多肽的添加量在含聚酯材料的0.001重量％至5重量％的范围内，优选在0.001％至1％的范围内，更优选在0.001％至0.1％的范围内，甚至更优选在0.001％至0.05％的范围内。
在一个特别的实施方案中，在优选包括在30rpm与2000rpm之间的搅拌下执行方法，以有利于多肽与含聚酯材料之间的接触。
在一个特别的实施方案中，向介质中添加至少亲脂性试剂和/或亲水性试剂以改进解聚步骤。可向包含重组微生物的介质中添加诱导剂如聚酯或其衍生物的低聚物以改进多肽产生。可向介质中添加表面活性剂如吐温以改变聚酯与多肽或重组微生物之间的界面能并改进降解效率。可使用有机物质或离子液体来溶胀聚酯并增加微生物或多肽对它的可及性。
将含聚酯材料的至少一种聚酯解聚直至成为单体/低聚物的反应时间有利地包括5小时与110小时之间、更优选地24小时与72小时之间。更优选地，在24小时之后，至少50％的聚酯被解聚直至成为单体/低聚物，甚至更优选地，在24小时之后，至少80％的聚酯被解聚。这样的反应时间可允许解聚充分进展，并且将不是经济上不利的。对于生物降解，反应时间可更长。
任选地，可按顺序或连续回收由解聚产生的单体和/或低聚物。随起始含聚酯材料而异，可回收单一类型的单体和/或低聚物或若干不同类型的单体和/或低聚物。
可使用所有合适的纯化方法进一步纯化回收的单体和/或低聚物并且调节成可再聚合的形式。纯化方法的实例包括汽提方法、通过水溶液来分离、蒸汽选择性冷凝、在生物过程之后过滤和浓缩介质、分离、蒸馏、真空蒸发、提取、电渗析、吸附、离子交换、沉淀、结晶、浓缩以及酸添加脱水和沉淀、纳滤、酸催化剂处理、半连续方式蒸馏或连续方式蒸馏、溶剂提取、蒸发浓缩、蒸发结晶、液体/液体萃取、氢化、共沸蒸馏方法、吸附、柱色谱法、简单真空蒸馏和微滤，所述纯化方法可组合或不组合。
可再聚合的单体和/或低聚物可然后再使用以合成聚酯。有利地，再聚合具有相同性质的聚酯。然而，可以将回收的单体和/或低聚物与其他单体和/或低聚物混合，以合成新的共聚物。
在一个特别的实施方案中，在允许聚合反应的适宜条件下使用水解酶进行再聚合。可向单体/低聚物溶液中添加引发剂以有利于聚合反应。本领域技术人员可容易地使工艺参数适于单体/低聚物以及待合成的聚合物。
在一个特别的实施方案中，本发明的方法在反应器中执行。“反应器”指适于保持和转化塑料制品的任何设备或装备或设施。反应器可包含进口和出口设备以供给/收集介质、营养物、气体等。反应器可以是闭合的或开放的，如槽罐。
塑料复合物
本发明的又一个目的在于提供一种塑料复合物，其含有本发明的多肽和/或重组微生物和/或表达和分泌所述多肽的分离的小单孢菌或其提取物；和至少一种聚酯。在一个特别的实施方案中，聚酯优选为聚(l-乳酸)(plla)或聚(d-乳酸)(pdla)、聚丁二酸丁二醇酯(pbs)降解活性或聚羟基链烷酸酯(pha)。在一些实施方案中，塑料复合物可含有优选选自以下的一种或多种附加的聚合物：聚酯，如pbat、pcl、pet；聚烯烃，如聚乙烯、聚丙烯；或天然聚合物，如淀粉、纤维素或面粉；以及它们的共混物/混合物。在一个特别的实施方案中，除多肽所主要针对的聚酯外，塑料复合物还含有至少一种选自pbat、面粉和淀粉的附加的聚合物。
在一个特别的实施方案中，用于制备塑料复合物的多肽包含具有与seqidn°1中示出的全长氨基酸序列至少75％、80％、85％、90％、92％、95％、99％或100％同一性、优选地至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。
特别地，本发明涉及一种产生这样的塑料复合物的方法，其包括以下步骤：在聚酯处于部分或完全熔融状态的温度下，将聚酯与降解所述聚酯的本发明的多肽和/或本发明的微生物和/或本发明的重组细胞或其提取物混合，以使所述多肽/微生物整合到含聚酯材料的特定结构中。在一个特别的实施方案中，该方法是挤出方法。在一个特别的实施方案中，将小单孢菌的孢子或重组微生物的孢子引入到塑料复合物中。
在一些实施方案中，在聚酯的玻璃化转变温度与熔点之间的温度下，将本发明的多肽和/或重组微生物与聚酯混合。或者，在对应于所述聚酯的熔点或以上的温度下，混合多肽/微生物和聚酯。在一个特别的实施方案中，在80℃和250℃之间、优选地100℃和200℃之间的温度下，混合多肽/微生物和聚酯。或者，在高于80℃、优选地高于100℃、甚至更优选地高于130℃的温度下，混合多肽/微生物和聚酯。
在一些实施方案中，使用挤出、双螺杆挤出、单螺杆挤出、注射模制、铸造、热成形、旋转模制、压制、压延、压平、涂布、层化、扩展、拉挤成型、挤出吹扫-模制、挤出-膨胀、压制-粒化、水包油包水双重乳液蒸发或本领域技术人员已知的任何技术进行混合步骤。
所得塑料复合物整合包埋在复合物团块中的本发明的多肽/微生物。
有利地，这样的塑料复合物可用于生产将因此包含本发明的多肽的含聚酯材料和/或塑料制品。
在一个特别的实施方案中，塑料复合物和所得塑料制品是生物可降解的。这意味着它们符合本领域技术人员已知的相关标准和/或标签中的至少之一，如标准en13432、标准astmd6400、良好生物降解土壤(okbiodegradationsoil，标签vingotte)、良好生物降解水(okbiodegradationwater，标签vingotte)、良好堆肥(okcompost，标签vingotte)、良好家庭堆肥(okcomposthome，标签vingotte)。
有利地，生物可降解的塑料复合物或生物可降解的塑料制品指在环境条件下至少部分地转化成水、二氧化碳或甲烷和生物质的塑料复合物或塑料制品。本发明的优选塑料复合物或塑料制品是在水中可生物降解的。优选地，约90重量％的塑料复合物或塑料制品在水中于不到90天内、更优选地不到60天内、甚至更优选地不到30天内被生物降解。或者或另外，塑料复合物或塑料制品可在暴露于存在于地貌中的湿润和温度条件时被生物降解。优选地，约90重量％的塑料复合物或塑料制品在环境中于不到3年内、更优选地不到2年内、甚至更优选地不到1年内被生物降解。或者，塑料复合物或塑料制品可在工业堆肥条件下被生物降解，其中温度保持在50℃以上。
本发明的其他方面和益处将在以下实施例中公开，这些实施例应视为说明性的而不限制本申请的范围。
实施例
实施例1：具有聚乳酸降解活性的小单孢菌菌株“s0002”和分泌酶的鉴定
a-s0002小单孢菌菌株分离
从花园堆肥分离具有降解pla的能力的菌株。
将若干pla花盆(soparco，法国condé-sur-huisne)埋在家庭花园堆肥中(距离表面约50cm)。每3个月，从堆肥中取出一只pla盆以进行菌株分离(直至12个月)。将pla盆切割成小块并然后转移到含25ml堆肥提取物的50ml离心管中。剧烈涡旋后，将连续稀释后的悬浮液涂覆到含有1g/l乳化pla的堆肥提取物琼脂平板上。15-30天后，出现了围绕菌落的半透明“清亮区(clear-zone)”，这反映了pla为微生物所降解。选择这些微生物进行进一步确认。
如下制备堆肥提取物(ce)：向800mldh2o中加入100g堆肥并搅拌过夜。然后将该混合物于5000rpm下离心1小时。用2层滤纸过滤上清液，然后用dh2o填充滤液至1升。对于堆肥提取物培养基，将聚合物(1g/l)溶解在有机溶剂(二氯甲烷或氯仿)中，加入到堆肥提取物中，并用分散单元ultra-
在所有分离株中，一种称为s0002的菌株在pla琼脂平板上展现可区分的“清亮区”。基于在genbank数据库(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi)中搜索和比较16srrna序列的基本局部比对搜索工具(blast)的结果，该菌株被鉴定为分类学上属于小单孢菌属。这种小单孢菌菌株s0002具有存在于seqidn°7中的16srrna。
琼脂平板上的“清亮区”现象表明本发明的小单孢菌s0002菌株不仅产生聚合物降解酶，而且在细胞外分泌它们。
回收这些分泌酶并浓缩。
b-酶提取
从液体培养上清液提取分泌的蛋白质如下进行：让菌株s0002在37℃、250rpm振荡下的培养基中生长13天。使用硫酸铵沉淀(80％)从培养上清液收集s0002的分泌蛋白质。将丸粒溶解在50mmtris-hcl中，然后装载到amiconultra-10k过滤器(millipore,billerica,ma,usa)中用于缓冲液更换和体积减小/浓缩。使用3种液体培养基进行提取：基本培养基(具有plla作为唯一碳源)、r2培养基(支持慢生长细菌的低营养培养基)和rs培养基(丰富培养基)。可在从所有3种培养基回收的酶中检测pla降解活性(如图1中的酶谱凝胶上所示)。此结果意味着pla降解酶由菌株s0002组成性地表达，或至少不需要特殊诱导。
酶谱凝胶测定：向12％的聚丙烯酰胺分离凝胶中加入pla(在0.1mtrisph8中乳化)至0.1％的最终浓度。浇铸凝胶并作为常规page凝胶运行。电泳完成后，用milliq水冲洗凝胶四次，然后在50mmtrisph8和2.5mmcacl2中于37℃下孵育直至出现清亮带。
c-产生自本发明的小单孢菌菌株s0002的本发明聚酯酶m2的鉴定
为了鉴定展现pla降解活性的酶，应用基因组学和蛋白质组学方法二者。将活化酶(清亮带)在酶谱凝胶上的位置与考马斯(coomassie)有色凝胶上的上清液蛋白质谱进行比较。从有色凝胶切除对应于酶谱上的活性带的带并进行液相色谱-串联质谱(lc-ms-ms)分析(functionalproteomiccorefacility,institutdephysiologieetdebiologiecellulaires,universitédepoitiers,poitiers,france)。使用mascot软件(matrixscienceinc.,boston,ma,usa)来阐释lc-ms-ms数据并从翻译的s0002基因组鉴定候选蛋白质(在dna测序平台上测序，laboratoireecologieetbiologiedesinteractions,universitédepoitiers,poitiers,france)。
从基因组dna扩增候选基因并通过使用sanger分析校读序列。然后克隆确认的候选基因以在变铅青链霉菌宿主系统中异源表达。根据既定方案进行变铅青链霉菌的转化[nyboseetal.,2010][kiesert,2000]。在这些于变铅青链霉菌中表达的候选物中，一种构建体(contig170-orf5)已在r2-pla平板上显示了pla降解能力(图2)。根据blast搜索结果，contig170-orf5是可能的肽酶s8/枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶的同源基因。因此，从该结果，鉴定出了s0002中可降解pla的contig170-orf5。相应的酶已被称为多肽m2(或聚酯酶m2)。
聚酯酶m2的dna序列为1866bp(seqidn°6)，其可翻译成621-氨基酸序列(seqidn°5)。根据保守结构域注释(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/structure/cdd/wrpsb.cgi)的结果，氨基酸残基1-26含有推定的信号肽，残基27-116含有推定的肽酶抑制剂结构域，残基117-376含有推定的肽酶结构域，残基377-621含有推定的p-前蛋白和fild_n结构域。已在残基150-190、残基245-275和残基335-345内预测了聚酯酶m2的活性位点(催化三联体)。已在残基125-135和残基290-315内预测了钙结合位点。
根据蛋白质序列比对，聚酯酶m2与蛋白酶k共享27％的同一性并与文件jp2013000099中公开的pla降解酶共享41％的同一性。聚酯酶m2比其他两种酶在c-端长约220个氨基酸，并且这226个氨基酸序列(seqidno°3)的同源性(blast)搜索保守结构域揭示了“前蛋白转化酶p结构域”的表达标记并被称为本发明的辅助多肽。不考虑辅助多肽，聚酯酶m2与蛋白酶k共享40％的同一性并与jp2013000099酶共享63％的同一性(图3)。
d-分泌酶的大小估计
生长较大体积的s0002培养物(500ml)并用切向流过滤系统(sartoriusag,goettingen,germany)进行测试。该切向流过滤系统在工业中广泛用于大规模回收和浓缩分泌的生物产物。s0002培养物首先流过0.2μm膜以排除细菌细胞。无细胞的培养物液体然后横流过含截止尺寸为30kda的膜的过滤器单元，并且浓缩样品的最终体积为14ml。在整个过程中，在每个实验步骤中保留样品用于plla降解活性测定。如酶谱凝胶(图4)中所示，于0.2μm膜过滤前、0.2μm膜过滤后和30kda截止膜浓缩级分后，在s0002培养物中检测pla降解活性。只有<30kda的滤液级分没有活性。这表明活性酶的大小大于30kda。
实施例2：来自小单孢菌菌株s0002的pla解聚酶(包括聚酯酶m2)的表征
研究并表征s0002分泌酶的pla降解活性。通过乳化plla琼脂糖平板测定，来测试回收的酶在不同ph(ph5、ph7、ph8.5和ph10)下的活性。由于来自白色念球菌的蛋白酶k已经报道具有有效降解pla的能力[williamsd,1981]，故蛋白酶k被包括在所有实验中作为阳性对照。如图5中所示，在ph5下，无论是s0002分泌酶还是蛋白酶k都不显示出pla降解活性。s0002分泌酶在ph7下开始出现轻微的清亮区，其在ph8.5下更为明显，最佳清亮区出现在ph10下。至于蛋白酶k，清亮区出现在ph8.5下，最好的是在ph10下。然而，蛋白酶k在ph8.5下的清亮区不如s0002分泌酶的清亮区强。该结果表明，在ph8.5下，s0002的分泌酶可能比蛋白酶k具有更好的活性。
还通过使用乳化pla浊度测定研究了温度对pla降解活性的影响。浊度测定由以下方法组成：通过在h2o或20mmtris-hclph7中乳化0.5％的pla来制备乳化pla。然后用120mmtrisph8将该乳液稀释6倍以达到od580nm下约1的吸光度值和100mm的最终tris浓度。将分泌酶与该稀乳液一起孵育并在od580nm下监测浊度随时间的降低。
在37℃和60℃下测量pla降解活性。如图6中所示，s0002分泌酶和蛋白酶k均可忍耐60℃的温度并显示出相似的pla降解活性。有趣的是，在37℃下，s0002分泌酶看起来具有比蛋白酶k更好的活性。需要注意的一点是，pla的玻璃化转变温度在55-60℃左右。因此，在60℃下，存在更多的无定形pla分子，并且它们可能更易于酶降解。在较低温度下活化的酶(如s0002酶)在实际应用中具有明显的益处。
实施例3：聚乳酸半结晶固体材料的降解
在高分子量半结晶pla膜(98％plla，2％pdla，mw129500，goodfellowsarl,lille,france)上测试小单孢菌菌株s0002的降解活性和小单孢菌菌株分泌酶的降解活性。
将goodfellowpla膜切割成3cm的正方形并称重，在乙醇中灭菌过夜，在层流罩中干燥，然后加到s0002的培养物中或s0002分泌酶反应中。孵育后，将膜用1％sds和milliq水反复洗涤，于37℃下干燥，然后测量重量损失。测试膜由s0002分泌酶和直接由菌株小单孢菌s0002二者的降解。
对于s0002分泌酶降解，在37℃下孵育48小时后，膜被破坏并具有17％的重量损失。至于阴性对照，膜外观和重量损失均没有明显变化(图7a)。
对于由菌株的直接降解，在37℃下与s0002一起培养30天后，膜不仅变薄和破坏，而且具有80.6％的重量损失(图7b)。
该结果证实，s0002的分泌酶和s0002小单孢菌菌株自身可降解高分子量半结晶pla膜。
实施例4：乳酸回收
本发明的多肽可用在pla的回收过程中，在其中，乳酸(pla的单体)的回收是重要的步骤。因此，有必要测试乳酸是否产生。
评估降解步骤过程中乳酸的产生。收集来自实施例3的培养上清液(与高分子量半结晶pla膜一起培养的小单孢菌s0002菌株)并通过使用乳酸检测试剂盒(megazyme,wicklow,ireland)测定乳酸含量。结果，培养上清液中的总乳酸含量表示为膜重量损失的95.4％(图7c)。该结果表明，本发明的小单孢菌s0002菌株可将高分子量半结晶pla膜降解为乳酸，但不消耗乳酸。因此，本发明的小单孢菌菌株s0002可用于pla再循环以回收乳酸。
实施例5：辅助多肽对聚酯酶最适温度的益处
已合成jp2013000099酶的基因，其氨基酸序列在专利申请jp2013000099中有述。然后已构建具有辅助多肽的jp2013000099酶的嵌合体以研究聚酯酶m2的辅助多肽的作用。pla降解测定如下进行：将100mgpla粉末和750μl粗制或浓缩的培养上清液置于透析袋(d9777,sigma-aldrich,st.louis,mo,usa)内。然后在搅拌下于适宜的ph和温度下将该袋对50ml0.1mtris缓冲液进行透析。在不同的时间点从透析缓冲液中取出样品，并按照制造商的方案测量乳酸含量(乳酸测定试剂盒，megazyme)。结果表明，辅助多肽对jp2013000099酶活性的ph曲线没有显著影响。然而有趣的是，辅助多肽确实改变了jp2013000099酶活性的温度曲线。根据结果，原始的jp2013000099酶只能在45℃下达到其最大活性(图8a)，而嵌合体jp2013000099酶/辅助多肽可在37℃下就已达到相同水平的最大活性(图8b)，这类似于s0002(图8c)。
辅助多肽通过降低活性的最适温度成功地改善了jp2013000099酶。辅助肽增大了jp2013000099酶的活性范围。这表明辅助多肽可能是改善其他酶的潜在选择。
实施例6：聚酯的降解
已通过使用“清亮区”方法测试了本发明的菌株小单孢菌s0002降解若干种聚酯的能力。
用于该研究的培养基为：r2培养基([reasonerd&geldreiche,1985]。一升培养基含有：0.5g酵母提取物、0.5g眎蛋白胨、0.5g酪蛋白氨基酸、0.5g葡萄糖、0.5g可溶性淀粉、0.3g丙酮酸钠、0.3gk2hpo4、0.05gmgso4·7h2o。当适用时，可如实施例1中所述加入琼脂和/或聚合物)；对于放线菌的基本培养基，选择的聚合物充当唯一碳源。一升培养基含有：2gkh2po4、2.4gna2hpo4、2gnh4cl、0.2gmgcl2、1ml痕量元素溶液m333和200μl维生素溶液v7(最终ph6.8-7.4)。对于一升m333溶液：50gna2-edta、11gznso4·7h2o、7.34gcacl2·2h2o、2.5gmncl2·4h2o、0.5gcocl2·6h2o、0.5g(nh4)6mo7o24·4h2o、5gfeso4·7h2o、0.2gcuso4·5h2o和11gnaoh。对于一升v7溶液：2mg生物素、50mg吡哆胺、10mg盐酸硫胺素、20mg烟酸、5mg泛酸钙、20mg维生素b12和10mg对-氨基苯甲酸。
测试不同的底物。用清亮区方法测试这些聚合物：将聚合物溶解在二氯甲烷中并然后在琼脂培养基中乳化。
-plla粉末(>99.5％l-pla,<0.5％d-pla,natureplast,ifs,france)
-pdla粉末(>99.5％d-pla,<0.5％l-pla,natureplast,ifs,france)
-pbs粉末(pbe003,natureplast,ifs,france)
-pha粉末(p(3hb-co-4hb),metabolix,cambridge,ma,usa)
在8-24天后，出现琼脂平板上围绕菌落的半透明“清亮区”，这反映了塑料通过菌株小单孢菌s0002降解，如图9中所示。s0002已对聚l-乳酸(plla)、聚d-乳酸(pdla)、聚丁二酸丁二醇酯(pbs)和聚羟基链烷酸酯(pha)显示出降解活性。
实施例7：从培养上清液产生聚酯酶的优化
为了提高s0002培养上清液中聚酯酶m2生产的产率，对不同组成的培养基进行了测定和比较，其中rs培养基(rajasimmanm&subathras,2009)和mmk培养基(el-bondkly&el-gendy,2010)补充或不补充10g·l-1或20g·l-1明胶，这给出最有希望的结果。一升rs培养基含有0.3g肉提取物、5g酵母提取物、4gcaco3、24g可溶性淀粉和1g葡萄糖。mmk培养基含有0.5g/lk2hpo4、0.5g/lkh2po4、1g/lmgso4·7h2o、0.1g/lcacl2、0.015g/lfeso4·7h2o、0.005g/lznso4·7h2o、0.3g/lnacl(ph8)。
使用来自s0002的粗制上清液在37℃和ph10下进行pla向乳酸的转化，其中s0002在不同的条件下初步生长，即：在rs培养基(rs)中20天后，在补充有(k1-2d和k2-2d)或未补充(m)10g.l-1(k1-2d)或20g.l-1(k2-2d)明胶的mmk培养基中2天和在补充有20g.l-1明胶的mmk培养基中4天(k2-4d)。在这段时间后，如实施例5中已描述，从粗制上清液测定pla降解。使用来自pllanatureplast(500μm)的粉末作为底物。
如图10中所示，截至目前，鉴定出的对于聚酯酶m2生产的最佳培养基对应于补充有明胶的mmk培养基：在用来自在mmk+2％明胶中培养4天的粗制上清液孵育24小时后，获得了pla向乳酸高达80％的转化。
实施例8：从市售含pla材料生产乳酸
聚酯酶m2可有利地用于含pla材料(市售物品)向乳酸(la)的再循环。为了评价聚酯酶m2在这样的过程中的效力，使用实施例5中描述的方法在37℃和ph10下使用来自s0002的粗制上清液评估来自市售物品的pla向la的转化，其中s0002在补充有20g.l-1明胶的mmk培养基中初步生长4天。为此，从以下中的任一者制备pla粉末(500μm)：
-基于pla的刀具
-基于pla的收缩包装托盘
-基于pla的收缩包装
-基于pla的烧杯
-plla粉末(>99.5％l-pla,<0.5％d-pla,natureplast,ifs,france)
如所示，已从本研究中测试的所有市售物品的粉末获得la，尽管产率和速率不同(图11)。这些数据清楚地证实，s0002上清液可用于含有pla的市售物品的高效再循环。
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