本发明属中药领域，涉及大别山五针松的树皮提取物及其制备方法和在制药中的用途，本发明从大别山五针松（pinusdabeshanensis）的树皮中提取分离得到异海松烷型和松香烷型二萜化合物，经生物活性测试表明该类化合物可显著抑制蛋白酪氨酸磷酸酶1b（ptp1b），可用于制备预防或治疗ptp1b介导的疾病，特别是ii型糖尿病、肥胖症及其并发症的药物或该类药物的先导化合物。本发明还涉及该类化合物的制备方法。
背景技术：
：现有技术公开了蛋白酪氨酸磷酸酶（proteintyrosinephosphatase,ptp）是调节细胞内蛋白酪氨酸残基磷酸化水平的酶家族，与细胞增殖和胞内多种信号转导过程密切相关（fischeretal,science1991,253:401-406）。蛋白酪氨酸磷酸酶1b（proteintyrosinephosphatase1b,ptp1b）广泛分布于多种人体组织中，全长约50kda，是最早被纯化和确定生物学特征的ptp家族成员之一（charbonneauetal,proc.natl.acad.sci.usa.1989,86:5252–5256）。ptp1b表达的改变与人类糖尿病、肥胖症和癌症等疾病相关。糖尿病（diabetesmellitus）和肥胖症（obesity）是严重威胁人类身体健康的内分泌紊乱性代谢类疾病，常伴随着外周组织细胞对胰岛素敏感性的降低（即胰岛素抵抗），引起肌肉、肝脏及脂肪组织中的糖脂代谢平衡失调。根据糖尿病的发病机制，目前一般将糖尿病分为i型糖尿病（胰岛素依赖型，iddm）与ii型糖尿病（非胰岛素依赖型，niddm）。其中ii型糖尿病占90%以上，胰岛素抵抗是ii型糖尿病发生、发展过程中的关键因素。研究表明，ptp1b可使激活的胰岛素受体和胰岛素受体底物去磷酸化，在胰岛素和瘦素的信号传导过程中起着重要的负调控作用（kenndyetal,science1999,283:1544–1548）。ptp1b的过度表达将会导致胰岛素和瘦素信号的变化，从而导致糖尿病和肥胖症的发生。因此，ptp1b可视为治疗糖尿病和肥胖症等相关疾病的重要的药物靶点（johnsonetal.,nat.rev.drug.discov.2002,1:696–709）。寻找ptp1b的特异性抑制剂，通过抑制ptp1b的活性来提高外周组织对胰岛素的敏感性，对糖尿病和肥胖症治疗有着重要的应用前景。另有研究发现ptp1b在包括慢性髓细胞性白血病、乳腺癌、卵巢癌和前列腺癌在内的若干癌细胞中都有过量表达和水平提高现象（liuetal.,j.biol.chem.1996,271,31290–31295;kennethetal.,mol.cell.biol.1998,18,2965–2975;weinerteal.,j.natl.cancerinst.1996,86,372–378），说明ptp1b在这些癌症细胞中起着调控激酶活性的作用。因此，ptp1b的抑制剂可用于治疗或预防癌症或在癌症发展时用于减缓其进展。还有研究表明ptp1b抑制剂可用于治疗或预防神经退行性疾病。ptp1b作为新的药用靶点已成为近年来生物学及创新药物研究的一个热点。随着高通量筛选技术的广泛运用，目前已经发现较多种类的ptp1b抑制剂。然而迄今为止，尚未有任何ptp1b抑制剂得以成功上市成为药物，限制其成药的首要原因是ptp1b与ptp家族中其他的酶具有相同的催化中心，在抑制ptp1b活性的同时提高其针对ptp1b的选择性极其重要。另外，目前发现的活性比较高的抑制剂多带有磷酸、羧酸、磺酸等极性基团，具有较高的负电荷，不利于透过细胞膜，导致生物利用度差。因此寻找高效、高选择性，同时兼具良好药代动力学性质的小分子ptp1b抑制剂具有重要意义，对于糖尿病和肥胖症等疾病的治疗有着广阔的应用前景。天然产物具有结构复杂性和结构多样性的特点，是新药发现的重要来源。天然产物及其衍生物独特的化学结构，使其具有高药效和对特定靶点高选择性的优点以及潜在的独特的作用机制等优点（newman,etal.,nat.prod.rep.2000,17:215–34;newmanetal.,j.nat.prod.2012,75:311–335）。因此从天然活性成分中寻找开发新型、高效的ptp1b抑制剂具有重要的研究价值。统计表明，濒危植物次生代谢产物的成药性较高，是发现具有新颖结构和独特作用机制的新药物的重要来源，在国际上正引起高度重视（ibrahimetal.,proc.natl.acad.sci.usa.2013:110,16832–16837;zhuetal.,proc.natl.acad.sci.usa.2011,108:12943–12948）。大别山五针松（pinusdabeshanensis）隶属松科（pinaceae）松属（pinus）植物，是一种常绿乔木，成年后高达30余米，直径可达50cm，是我国特有的面临濒危灭绝的珍稀树种之一，于1992年10月被列为国家珍稀树种第一批二级保护树种（fuetal.,chinaplantreddatabook,sciencepress:beijing;newyork,1992）；其天然分布于大别山地区海拔800-1350米的山脊悬岩陡坡和沟谷两侧。分布范围狭窄，结实母株罕见，授粉率极低，球果种子十粒九空，种子败育率极高，发芽率极低，而且常因球果种子遭松鼠危害，故林下幼树极少，自然更新十分困难，其化学成分尚未有任何报道。本申请的发明人基于保护性地采集少许大别山五针松植物样品，积极促进利用这一濒危珍稀资源为人类服务的宗旨，拟提供大别山五针松的树皮提取物及其制备方法和在制药中的用途。技术实现要素：本发明目的是提供大别山五针松的树皮提取物及其制备方法和在制药中的用途，本发明从大别山五针松（pinusdabeshanensis）的树皮中提取分离得到异海松烷型和松香烷型二萜化合物，经生物活性测试表明该类化合物可显著抑制蛋白酪氨酸磷酸酶1b（ptp1b），可用于制备预防或治疗ptp1b介导的疾病，特别是ii型糖尿病、肥胖症及其并发症的药物或该类药物的先导化合物。本发明的所述的二萜类化合物具有如下化学结构式：其中化合物1和2为异海松烷型二萜，化合物3–5为松香烷型二萜，本发明中，所述的二萜类化合物，其中c-18位均氧化成羧基，同时异海松烷型二萜1和2的侧链具有三元氧环；所述的松香烷型二萜化合物3–5结构中c环芳化。本发明的另一目的是提供所述的化合物的制备方法。本发明所述的化合物由大别山五针松树皮经由本领域所涉常规的提取分离方法制备而得，其包括步骤：晾干粉碎的大别山五针松树皮用甲醇室温浸泡提取，提取液减压回收溶剂，合并后得浸膏。浸膏用水分散后依次用石油醚和乙酸乙酯萃取，得石油醚部分、乙酸乙酯部分和水溶性部分，乙酸乙酯部分经硅胶、sephadexlh-20及半制备hplc分离，得化合物1–5。本发明所述的化合物可通过从植物中分离纯化得到；也可经本领域技术人员熟知的化学方法合成获得。本发明对所制得的二萜类化合物进行了蛋白酪氨酸磷酸酶1b（ptp1b）抑制活性实验，结果表明该类化合物均具有显著的抑制活性，进一步，所述的化合物可作为蛋白酪氨酸磷酸酶ptp1b抑制剂，用于制成预防、延缓或治疗由ptp1b介导的疾病，特别是ii型糖尿病和肥胖症的药物或是作为该类药物的先导化合物。本发明所述的化合物可单独应用或者合用，亦可与药学上可接受的载体或赋形剂结合，按照常规方法制成口服或者非口服剂型。本发明具有如下优点：所述目标化合物1为新的异海松烷型二萜化合物，而化合物2为首次从自然界中分离得到；首次发现所述二萜类化合物具有显著的ptp1b酶抑制活性，对现代人群中高发的糖尿病、肥胖症等具有应用前景。下面结合实施例对本发明作进一步阐述，但这些实施例绝非对本发明有任何限制。本领域技术人员在本说明书的启示下对本发明实施中所作的任何变动都将落在权利要求书的范围内。具体实施方式下述制备例中，，比旋光测试通过jascop-1020旋光仪完成；紫外和红外光谱数据分别通过shimadzuuv-2550紫外光谱仪和nicoletavatar360型红外光谱仪获得；nmr用brukeravanceii400型仪测定；lr-ms由agilent1100serieslc/msdg1946d型仪测定,hr-ms由absciextripletof5600型仪测定；所使用的硅胶和薄层板为烟台康比诺公司生产，sephadexlh-20凝胶为瑞士gehealthcarebio-sciences公司生产；半制备hplc为waterse2695，配备2998pda和2424蒸发光散射双检测器以及sunfireods(5μm,250×10mm)半制备柱，日本岛津lc-2010ahtshimadzunormal-phasechiralitycolumn(5μm,250×4.6mm,chiralpak,ad-h)；所有试剂均为上海国药集团化学试剂有限公司生产。实施例1：二萜类化合物的制备取大别山五针松树皮180g，粉碎后用90%甲醇室温冷浸提取5次，合并提取液，减压浓缩，得浸膏50g。浸膏用水分散后依次用石油醚与乙酸乙酯萃取，得乙酸乙酯部分40.0g。乙酸乙酯部分经100-200目硅胶柱层析，以石油醚：乙酸乙酯30:1-0:1及乙酸乙酯：甲醇15:1-0:1梯度洗脱，得到8个组分（fr.a-fr.h），组分fr.b（1.9g）又经200-300目硅胶柱层析（洗脱剂为石油醚：乙酸乙酯10:1-2:1）得到3个亚组分（fr.b1-3），其中亚组分fr.b1(30.6mg)采用半制备型hplc进一步分离，以73%乙腈等度洗脱（流速：3ml/min），得到化合物3（8.0mg,tr=21.3min），组分fr.c（1.9g）经200-300目硅胶柱层析（洗脱剂为石油醚：乙酸乙酯7:1-3:1）得到2个亚组分（fr.c1-2），其中亚组分fr.c1经过凝胶sephadexlh-20柱层析（洗脱剂为甲醇）得到化合物4（28.0mg），亚组分fr.c2经过半制备型hplc进一步分离，以90%甲醇等度洗脱（流速：3ml/min），分别得到化合物1和2的混合物，该混合物又经过手性柱（正己烷：异丙醇94:6，流速：1ml/min）进一步分离得到化合物1（2.2mg,tr=9.5min）和2（2.5mg,tr=12.5min），组分fr.f（0.5g）经sephadexlh-20以纯甲醇洗脱，得到化合物5（120.0mg）。化合物1–5的核磁及理化数据如下：化合物1(15(r*),16-epoxy-13-epi-pimara-7-en-18-oicacid):无色油状,[α]d20+5.0°(c0.1,chcl3);uv(chcl3)λmax(logε)217(0.97)nm;ir(kbr)νmax2922,2857,1698,1452,1442,1386,1366,1024,786cm−1;1hnmr(400mhz,cdcl3):δ0.75(3h,s,me-17),0.90(3h,s,me-20),1.13(1h,m,h-1a),1.28(3h,s,h-19),1.36(1h,m,h-11a),1.39(1h,m,h-12a),1.45(1h,m,h-12b),1.56(2h,m,h-2),1.58(1h,m,h-11b),1.68(1h,m,h-3a),1.71(1h,m,h-6),1.76(1h,m,h-5),1.77(1h,m,h-3b),1.85(1h,d,j=13.6hz,h-14a),1.86(1h,m,h-1b),1.94(1h,d,j=13.6hz,h-14b),1.96(1h,m,h-9),1.99(1h,m,h-6b),2.64(2h,brd,j=3.6hz,h-16),2.72(1h,dd,j=3.6,3.2hz,h-15),5.34(1h,brd,j=5.2hz,h-7).13cnmr(100mhz,cdcl3):δ38.8(c-1),17.9(c-2),36.9(c-3),46.3(c-4),52.0(c-5),25.2(c-6),121.3(c-7),134.7(c-8),44.9(c-9),35.0(c-10),19.4(c-11),33.3(c-12),33.9(c-13),42.0(c-14),60.6(c-15),43.4(c-16),18.1(c-17),184.7(c-18),17.1(c-19),15.3(c-20);(+)esimsm/z319[m+h]+,341[m+na]+;hresimsm/z341.2095[m+na]+(calcdforc20h30o3na,calcd341.2093,δ=－2.7ppm).化合物2(15(s*),16-epoxy-13-epi-pimara-7-en-18-oicacid):无色油状,[α]d20+8.0°(c0.1,chcl3);uv(chcl3)λmax(logε)217(0.83)nm;ir(kbr)νmax2922,2857,1698,1452,1442,1386,1366,1024,786cm−1;1hnmr(400mhz,cdcl3):δ0.78(3h,s,me-17),0.90(3h,s,me-20),1.13(1h,m,h-1a),1.28(3h,s,h-19),1.36(1h,m,h-11a),1.37(1h,m,h-12a),1.45(1h,m,h-12b),1.56(2h,m,h2-2),1.58(1h,m,h-11b),1.68(1h,m,h-3a),1.71(1h,m,h-6),1.76(1h,m,h-5),1.77(1h,m,h-3b),1.85(1h,d,j=13.6hz,h-14a),1.86(1h,m,h-1b),1.94(1h,d,j=13.6hz,h-14b),1.96(1h,m,h-9),1.99(1h,m,h-6b),2.64(1h,dd,j=4.8,4.0hz,h-16),2.68(1h,dd,j=4.8,3.2hz,h-16),2.72(1h,dd,j=4.0,3.2hz,h-15),5.34(1h,brd,j=5.2hz,h-7).13cnmr(100mhz,cdcl3):δ38.8(c-1),17.9(c-2),36.9(c-3),46.3(c-4),52.0(c-5),25.2(c-6),121.3(c-7),134.7(c-8),44.9(c-9),35.0(c-10),19.4(c-11),32.0(c-12),33.9(c-13),42.9(c-14),60.7(c-15),43.5(c-16),18.5(c-17),184.7(c-18),17.1(c-19),15.3(c-20);(+)esimsm/z319[m+h]+,341[m+na]+;hresimsm/z341.2095[m+na]+(calcdforc20h30o3na,calcd341.2093,δ=－2.5ppm).化合物3(abieta-8,11,13,15-tetraen-18-oicacid):白色无定形粉末,[α]d20+55.0(c0.1,meoh).1hnmr(400mhz,cdcl3):δ1.25(3h,s,me-20),1.29(3h,s,me-19),1.50(1h,m,overlapped,h-6a),1.50(1h,dd,overlapped,h-1a),1.72(1h,m,h-3a),1.75(2h,m,h2-2),1.80(1h,m,h-3b),1.84(1h,m,h-6b),2.14(3h,brs,h-17),2.25(1h,dd,j=12.4,2.1hz,h-5),2.33(1h,brd,j=13.5hz,h-1b),2.94(2h,m,h2-7),5.04(1h,brs,h-16a),5.34(1h,brs,h-16b),7.16(1h,d,j=2.0hz,h-14),7.20(1h,d,j=8.0hz,h-11),7.26(1h,dd,j=8.0,2.0hz,h-12);(+)esimsm/z299[m+h]+,321[m+na]+.化合物4(12-hydroxydehydroabieticacid):淡黄色油状,[α]d20+35.0°(c0.1,cdcl3).1hnmr(400mhz,cdcl3):δ1.22(3h,s,me-20),1.25(3h,d,j=7.2hz,me-16),1.27(3h,d,j=7.2hz,me-17),1.29(3h,s,h-19),1.52(1h,m,overlapped,h-6a),1.52(1h,dd,overlapped,h-1a),1.70(1h,m,h-3a),1.74(2h,m,h2-2),1.79(1h,m,h-3b),1.82(1h,m,h-6b),2.22(1h,dd,j=12.5,2.2hz,h-5),2.25(1h,brd,j=13.5hz,h-1b),2.83(2h,m,h2-7),3.12(1h,sept.,j=7.2hz,h-15),6.64(1h,s,h-11),6.85(1h,s,h-14),13cnmr(100mhz,cdcl3):δ37.9(c-1),18.5(c-2),36.7(c-3),47.4(c-4),44.5(c-5),21.9(c-6),29.2(c-7),127.0(c-8),147.8(c-9),36.8(c-10),110.8(c-11),150.7(c-12),131.8(c-13),126.7(c-14),26.8(c-15),22.7(c-16),22.5(c-17),184.5(c-18),16.2(c-19),25.0(c-20);(+)esimsm/z317[m+h]+,339[m+na]+.化合物5(15-hydroxy-7-oxo-8,11,13-abietatrien-18-oicacid):淡黄色粉末,[α]d20+16.5(c0.1,meoh).1hnmr(400mhz,cdcl3):δ1.27(3h,s,me-20),1.29(3h,s,me-19),1.58(6h,s,me-16,17),1.68(1h,m,h-1a),1.80(5h,m,h-1b,h2-2,h2-3),2.42(1h,dd,j=17.0,3.2hz,h-6a),2.68(1h,dd,j=13.5,3.2hz,h-5),2.86(1h,dd,j=17.0,13.5hz,h-6b),7.38(1h,d,j=8.4hz,h-11),7.76(1h,d,j=8.4,2.1hz,h-12),8.06(1h,d,j=2.1hz,h-12),13cnmr(100mhz,cdcl3):δ37.7(c-1),18.1(c-2),37.0(c-3),46.3(c-4),43.5(c-5),36.4(c-6),198.8(c-7),130.4(c-8),153.8(c-9),37.3(c-10),123.6(c-11),130.7(c-12),147.3(c-13),123.3(c-14),72.4(c-15),31.7(c-16),31.5(c-17),182.5(c-18),16.1(c-19),23.6(c-20);(+)esimsm/z331[m+h]+,353[m+na]+.。实施例2：蛋白酪氨酸磷酸酶1b抑制活性测定实验方法：采用分子生物学的方法，构建基因重组的hgst-ptp1b-bl21e.coli人类ptp1b工程菌，经纯化后的hgst-ptp1b重组蛋白能水解底物para-nitrophenylphosphate(pnpp)的磷脂键，得到的脱磷酸产物pnp在波长405nm处有很强的光吸收，因此可通过直接检测405nm处光吸收的变化以观察酶活性变化以及化合物对酶活性的抑制情况；初筛选择所述化合物浓度为20µg/ml时对ptp1b酶活性的百分抑制率进行考察，试验结果表明化合物4和5抑制率高于95%，化合物1-3抑制率高于60%。进一步测定ic50值：样品临用前溶于dmso配成合适浓度，3倍稀释，7个稀释度，三复孔，取2μl样品溶液加入到标准的测活体系（30nmgst-hptp1b,2mmpnpp,50mm3-吗啉丙磺酸(mops)，ph6.5,2mmdtt,1mmedta,2%dmso）。反应温度为30oc，在versamax上动态测量405nm处的光吸收，时间为3min，其动力学曲线一级反应的斜率作为酶的活性指标。以相对活性对化合物浓度作图，经公式v/v0＝100/(1+b*[i]/ic50)拟合得到ic50值。实验重复三次，结果取三次的平均值，阳性对照齐墩果酸（oleanolicacid）ic50值为1.45µg/ml；表1.测试化合物抑制ptp1b活性数据化合物ic50(µg/ml)113.04±1.21211.17±3.09316.10±1.4441.61±0.2653.42±0.28化合物1–5抑制ptp1b的ic50值如表1所示，测试结果表明，所述5个化合物均表现出显著的抑制活性，尤其化合物4和5的作用强度与阳性对照齐墩果酸基本相当，表明本发明所述化合物可用于制备治疗糖尿病、肥胖症及其并发症的药物或是作为该类药物的先导化合物。当前第1页12