本发明涉及药物化学领域，具体而言涉及一种双哌嗪类化合物及其应用。
背景技术：
流行性感冒(流感)是一种由流感病毒引起的急性呼吸道传染疾病，一直以来都严重影响人类的生命健康，并带来巨大的经济和社会负担。根据世界卫生组织的数据，季节性流感的流行每年都会造成300-500万例严重病例，并导致25-50万人死亡，流感世界范围的大流行更是会带来灾难性的后果。此外，禽流感是由禽流感病毒引起的一种鸟类病毒性传染病，一般情况下被感染的宿主没有明显的症状，禽流感病毒也可以感染家禽、人和一些哺乳动物。
目前，流感疫苗是预防和控制流感传播的最有效手段，接种疫苗主要是通过诱导产生血凝素抗体来起到保护作用。虽然灭活疫苗和减毒活疫苗都能有效的预防流感和其相关并发症，但其保护作用取决于疫苗病毒株和流行的病毒株之间的抗原匹配程度，以及接种者的年龄和身体健康状况。在现有条件下，要准确预测即将流行的流感病毒株是非常困难的。
由于病毒的抗原漂移，流感疫苗的成分每年都要根据世界卫生组织和美国疾病防治中心的流感监测数据进行调整，这给疫苗的生产带来很大的困难。而临床目前用于治疗流感病毒感染的药物主要为m2离子通道抑制剂和神经氨酸酶抑制剂这两类。临床上应用的m2离子通道抑制剂包括两种药物：金刚烷胺和金刚乙烷。该类药物很早就用来预防和治疗流感，m2离子通道抑制剂只对a型流感病毒有效，对b型流感病毒无效。目前，该类药物的耐药性问题已经非常严重，该类药物已不再作为流感防治的一线药物使用。神经氨酸酶抑制剂是根据流感病毒神经氨酸酶的晶体结构信息，通过合理药物设计开发出抗流感病毒药物，与m2离子通道抑制剂只对a型流感有效不同，神经氨酸酶对a型流感病毒和b型流感病毒感染都有效，但是随着流感病毒的变异以及药物滥用，使得神经氨酸酶的耐药性问题日益严重。
针对流感病毒日益严重的耐药性威胁以及目前仅有少数几种治疗药物的状况，开发新型抗流感病毒药物变得十分迫切和必要。
技术实现要素：
本发明通过测定双哌嗪类化合物对流感病毒的细胞水平抑制活性及细胞毒性表明，该类化合物对流感病毒具有一定的抑制作用，其可以用于制备抗流感病毒药物。
本发明提供了一种双哌嗪类化合物，具有如下通式(i)结构：
其中，x选自c1-5的烷基、c1-5的酰基、c1-5的炔基、c1-5的烯基或氧原子；
u选自c1-5的烷基、氧原子、硫原子、c3-6的环烷基、c5-6的杂环或芳环；
y选自c1-3的烷基、氢原子、氧原子、氨基、c1-3的烷氨基、c1-3的酰胺基、羟基、c1-3的烷氧基或芳环；
z选自c1-5的烷基、氧原子、c1-5的酰基、c1-5的炔基或c1-5的烯基；以及
r1和r2选自c1-5的烷基、c1-5的酰基、c1-5的炔基、c1-5的烯基、含卤素取代的苯基、含炔基取代的苯基或含各种吸电子基/供电子基取代的苯基。
在上述双哌嗪类化合物中，
x选自c1-5的烷基、c1-5的酰基或c1-5的炔基；
u选自c1-5的烷基或c1-5的酰基；
y选自氢原子、氧原子、氨基、c1-3的烷氨基、羟基或c1-3的烷氧基；
z选自c1-5的烷基或c1-5的酰基；以及
r1和r2选自含卤素取代的苯基、含炔基取代的苯基或含各种吸电子基/供电子基取代的苯基。
在上述双哌嗪类化合物中，r1和/或r2与哌嗪直接相连。
在上述双哌嗪类化合物中，双哌嗪类化合物为：
在上述双哌嗪类化合物中，双哌嗪类化合物为：
本发明还提供了双哌嗪类化合物及其盐在制备抗流感病毒药物中的应用。
在上述应用中，其中，所述双哌嗪类化合物的盐为可药用盐。
在上述应用中，其中，所述可药用盐为有机盐。
在上述应用中，其中，所述可药用盐为无机盐。
在上述应用中，其中，所述有机盐为甲磺酸盐、甲酸盐、乙酸盐、三氟乙酸盐、马来酸盐、酒石酸盐、琥珀酸盐、富马酸盐、柠檬酸盐、苯磺酸盐、对甲基苯磺酸盐、萘磺酸盐、乳酸盐和苯甲酸盐。
在上述应用中，其中，所述无机盐为盐酸盐、氢溴酸盐、硫酸盐和磷酸盐。该类化合物对流感病毒活性存在较好的抑制作用，在制备抗流感病毒药物中有着很好的应用前景。
附图说明
图1是测定的化合物26的ec50图。
图2是测定的化合物26的cc50图。
图3是化合物26的质谱图。
图4是化合物26的氢谱图。
图5是化合物26的碳谱图。
具体实施方式
本发明提供了一种双哌嗪类化合物，具有如下通式(i)结构：
其中，x选自c1-5的烷基、c1-5的酰基、c1-5的炔基、c1-5的烯基或氧原子；u选自c1-5的烷基、氧原子、硫原子、c3-6的环烷基、c5-6的杂环或芳环；y选自c1-3的烷基、氢原子、氧原子、氨基、c1-3的烷氨基、c1-3的酰胺基、羟基、c1-3的烷氧基或芳环；z选自c1-5的烷基、氧原子、c1-5的酰基、c1-5的炔基或c1-5的烯基；以及r1和r2选自c1-5的烷基、c1-5的酰基、c1-5的炔基、c1-5的烯基、含卤素取代的苯基、含炔基取代的苯基或含各种吸电子基/供电子基取代的苯基。其中，r1和r2也可以与哌嗪直接相连。特别地，本发明的双哌嗪类化合物优选以下化合物：
下列实施例选择化合物26用于举例说明本发明，但不以任何方式限制本发明。
化合物26的合成过程如下所示：
具体合成过程为：
(1)将原料草酰氯b(0.29ml，0.0034mol)溶于4ml二恶烷中配成a溶液，将原料苄基哌嗪a(1.48ml，0.0085mol)溶于6ml二恶烷中配成b溶液。将a溶液缓慢滴加到b溶液中，过程中有白烟放出，加料完成后体系呈乳白色悬浊状，搅拌过程中，体系会变得更加粘稠，有大量固体析出。tlc(薄层色谱(点板))监测反应完全后，在体系中加入乙酸乙酯进行萃取，保留乙酸乙酯相，再用饱和氯化钠水溶液(10ml)水洗有机相两遍，用无水硫酸钠(5.6g)干燥有机相。减压旋干乙酸乙酯得黄色油状物c。
(2)将中间体c(0.3g，0.74mmol)溶于10ml干燥的四氢呋喃(thf)中，缓慢加入氢化铝锂(0.14g，3.7mmol)，反应剧烈，有气泡冒出。要确保体系处于无水的状态。加料完成后，将体系在油浴锅中加热至70℃回流反应6h。tlc监测反应完成后，将其体系降至室温，缓慢加入稀盐酸溶液(质量分数为15％，10ml)淬灭反应。加入饱和氯化钠溶液(5ml)，用乙酸乙酯萃取两遍，无水硫酸钠(5.6g)干燥有机相。减压浓缩后，硅胶柱纯化后得化合物26。
采用brukerav-400型核磁共振仪测定的化合物结果如下：
化合物26：ms-esi(+)：c24h34n4计算值378.56，实测值378.44；
1hnmr(400mhz,chloroform-d)δ7.33(d,j＝4.4hz,8h),7.24–7.28(m,2h),3.53(s,4h),2.54(d,j＝19.0hz,20h)；
13cnmr(151mhz,cdcl3)δ129.29,129.22,128.29,127.24,62.78,53.27,52.38,29.71.
此外，测得的其他化合物的参数如下：
化合物1：1hnmr(400mhz,chloroform-d)δ7.247.36(m,10h),3.53(s,4h),2.332.63(m,20h),1.661.76(m,2h).
化合物2：1hnmr(400mhz,chloroform-d)δ7.257.35(m,9h),3.89(s,2h),3.55(d,j＝5.8hz,4h),3.45(d,j＝2.4hz,2h),2.432.74(m,16h),2.27(d,j＝2.5hz,1h),1.78(q,j＝7.6hz,2h),1.28(s,3h),0.840.93(m,2h).
化合物3：1hnmr(400mhz,chloroform-d)δ7.207.34(m,10h),2.792.87(m,4h),2.452.76(m,20h),2.372.44(m,4h),1.701.78(m,2h).
化合物6：1hnmr(600mhz,dmso-d6)δ8.24(d,j＝2.7hz,2h),8.17(d,j＝2.7hz,1h),8.16(d,j＝2.7hz,1h),7.30(d,j＝9.0hz,2h),3.21(t,j＝4.9hz,8h),2.542.61(m,8h),2.41(t,j＝7.3hz,4h),1.67(p,j＝7.5hz,2h).
化合物16：1hnmr(400mhz,chloroform-d)δ8.17(d,j＝8.7hz,4h),7.51(d,j＝8.3hz,4h),3.60(s,4h),2.342.65(m,20h),1.72(p,j＝7.6hz,2h).
化合物17：1hnmr(600mhz,chloroform-d)δ7.23(d,j＝8.6hz,4h),6.86(d,j＝8.6hz,4h),3.81(s,6h),3.47(s,4h),2.272.72(m,20h),1.701.76(m,2h).
化合物18：1hnmr(400mhz,chloroform-d)δ7.17(d,j＝7.7hz,4h),7.11(d,j＝7.7hz,4h),3.63(s,4h),2.562.93(m,20h),2.30(s,6h),1.83(t,j＝7.4hz,2h).
化合物19：1hnmr(400mhz,chloroform-d)δ7.56(d,j＝8.0hz,4h),7.43(d,j＝7.9hz,4h),3.57(s,4h),2.512.83(m,20h),1.86(t,j＝7.5hz,2h).
化合物20：1hnmr(600mhz,chloroform-d)δ7.267.31(m,4h),7.02(t,j＝8.6hz,4h),3.58(s,4h),2.612.88(m,20h),1.91(t,j＝7.4hz,2h).
化合物21：1hnmr(600mhz,chloroform-d)δ7.30(d,j＝8.4hz,4h),7.25(d,j＝8.4hz,4h),3.54(s,4h),2.492.96(m,20h),1.91(t,j＝7.6hz,2h).
化合物24：1hnmr(400mhz,chloroform-d)δ7.257.36(m,10h),3.53(s,4h),2.192.62(m,20h),1.411.58(m,4h).
化合物25：1hnmr(600mhz,chloroform-d)δ7.257.32(m,2h),7.057.10(m,4h),6.946.99(m,2h),3.54(s,4h),2.67(d,j＝60.7hz,20h),1.87(t,j＝7.8hz,2h).
化合物27：1hnmr(600mhz,chloroform-d)δ7.58(d,j＝8.0hz,3h),7.407.48(m,5h),3.56(s,4h),2.53(d,j＝30.6hz,20h).
抗流感病毒化合物细胞水平抑制活性以及细胞毒性测定：
(1)抗流感化合物细胞水平的抗流感病毒活性检测
a)mdck细胞的复苏
将在液氮中冻存的mdck细胞在37℃水浴锅中解冻后，加入到盛有12ml培养基的培养皿中，培养基成分为dmem+10％胎牛血清+1％青霉素和链霉素，37℃，5％co2培养。
b)influenza(h1n1)-gluc病毒的扩增
购买发育良好的9-11日龄鸡胚，于尿囊腔接种，33℃-35℃孵卵箱中培养，孵育24h后检视，弃去死胎，48h后收获。收获前，将鸡胚置于4℃冰箱中过夜。收获的病毒放置于-80℃冰箱中。
c)病毒滴度测定
mdck细胞按照3x105个/ml接种于96孔板中，37℃，5％co2培养18h后，第一列3孔加入10倍稀释的病毒100ul，第二列3孔加入20倍稀释的病毒100ul，直到第九列3孔，第十列作为空白对照，培养24小时后取上清，加入腔肠素进行数据测定，gluciferase读值在100000-200000之间最为合适。
d)化合物的配制
将抗流感化合物26溶解在95％二甲基亚砜中，配制10mm储液，用培养基dmem+10％fbs(胎牛血清)+1％ps(青霉素链霉素)将上述化合物配制成100um，40um，4um进行初步筛选。
e)将mdck细胞按照3x105个/ml接种于96孔板中，为防止培养基蒸发引起的边缘效应，96孔板外围加入200ulpbs缓冲液，37℃，5％co2培养18h后，每板可以测定6种化合物，将100ul细胞中的培养基吸走，在96孔板的第2列bcd行3孔细胞中加入50ul100um的第一种化合物，第三列bcd行3孔中加入50ul40um的化合物，第四列bcd行3个孔加入50ul4um的化合物，第五列bcd行3孔加入50ul100um第二种化合物，以此类推加到96孔板的第9列的3个孔，efg3行9列加入另3种化合物，第11列6个孔设为病毒对照和细胞对照。
f)抑制剂处理2h后，用培养基将influenza(h1n1)-gluc病毒稀释30倍，然后每孔加入50ul病毒，总体积变为100ul，因此，抑制剂的浓度变为配制浓度的1/2，37℃，5％co2培养24小时。
g)细胞培养24h后，取细胞上清30微升于白色酶标板中，加入30ul腔肠素，于微孔板检测仪中读取数值。
g)对20um条件下抑制率50％以上的抑制剂进行确切的ec50测定，其方法如下：
将100ulmdck细胞按3x105个/ml接种于96孔板中，外围用200ulpbs封闭，防止边缘效应，37℃，5％co2培养箱中培养24h。
将筛选出的化合物10mm储液用培养基2倍梯度稀释成200um-0.78um9个浓度。
将96孔板中的细胞上清吸走后，加入50ul上述浓度的抑制剂，同时设置病毒对照和细胞对照。
加入抑制剂2h后，将influenza-(h1n1)-gluc病毒稀释30倍，加入50ul于96孔板中，37℃，5％co2培养24h。
取细胞上清30ul于白色酶标板中，加入30ul腔肠素，立刻于微孔板检测仪中读取数值，并用graphpadprism中作图计算ec50值。化合物26的ec50值见图1。
(2)抗流感化合物细胞水平的抗流感病毒毒性检测
a)将抗流感化合物溶解在95％二甲基亚砜中，配制10mm储液，用培养基dmem+10％fbs+1％ps将上述化合物配制成100um进行cc50细胞毒性测定。
b)将mdck细胞按照3x105个/ml接种于96孔板中，为防止培养基蒸发引起的边缘效应，96孔板外围加入200ulpbs缓冲液，37℃，5％co2培养18h后，每板可以测定两种化合物。将第一列100ul细胞中的培养基吸走，在96孔板的第2列bcd行3孔细胞中加入50ul100um的第一种化合物，第三列bcd行3孔中同样加入50ul100um的化合物，第四列bcd行3个孔同样加入50ul100um的化合物，以此类推加到96孔板的第9列的3个孔，efg3行9列加入另一种化合物，第11列6个孔设为细胞对照。
c)细胞培养24h后，将孔内的培养液和药倒出，用pbs清洗2遍。每孔加入mtt溶液100ul。37℃，5％co2中孵育4h。加入100uldmso(100％)溶解结晶。10min后，结晶药物充分溶解，用酶联免疫检测仪(jk-mr-5033a，上海精学科学仪器有限公司)在492nm处测量各孔吸光值。并用graphpadprism作图计算cc50值。化合物26的cc50值见图2。
由上可知，双哌嗪类化合物对流感病毒活性有较好的抑制作用，能显著降低抗流感病毒的毒性，从而可以将这类化合物用于制备抗流感病毒药物。
为了清楚和易于理解的目的，通过举例说明和实施例详细地描述了上述发明。可以在附随的权利要求的范围内进行改变和修改，这对本领域的技术人员来说是很明显的。因此，可以理解，上面的说明书旨在用于说明而不是用于限制。因此，本发明的范围不应参考上述说明书来确定，而应当参照下面所附权利要求以及这些权利要求所享有的等同原则所确定的全部范围确定。