本发明属于生物技术和医药领域，具体为一种急性早幼粒细胞白血病ctl表位肽；此外，本发明还涉及该ctl表位肽的应用。
背景技术：
急性早幼粒细胞白血病(acutepromyelocyticleukemia，apl)是急性髓细胞白血病(aml)的一种特殊类型，被fab协作组定为急性髓细胞白血病m3型。apl是急性白血病中病情十分凶险的一种类型，其出血症状是十分常见的，发生率达72％～94％，明显高于其他急性白血病，往往是弥散性血管内血(dic)的表现，尤其是在化疗过程中dic可以加重，常致患者早期死亡。apl具有两个显著特点，其一为95％apl患者具有t(15；17)染色体异常，其形成的pml-rarα融合基因是其分子标志；其二为对全反式维甲酸(atra)和三氧化二砷疗效良好。apl具有特异性的染色体易位t(15；17)，易位使17号染色体上的rarα基因与15号染色体上的pml基因融合，产生融合基因pml-rarα。由于pml基因的断裂点不同，而rarα断裂点恒定，导致可以产生相应的3种不同pml-rarα融合基因的异构体，即pml第3外显子与rarα第3外显子结合形成的p3r3(s型，短型)，pml第6外显子与rarα第3外显子结合形成的p6r3(l型，长型)，极少数患者为l变异型(v型,5％)，其中以长型(55％)和短型(40％)异构体为主。
pml-rarα融合基因表达的融合蛋白干扰了正常rarα在核内的分布和对细胞分化的调控，使大量细胞阻滞在早幼细胞阶段，在apl发病机制中起重要作用。其不同的基因异构体分型的预后有明显不同，s型患者缓解前的死亡率及缓解后的复发率均高于l型。因此，将不同类型的apl特异性肿瘤抗原(pml-rarα融合蛋白)加载dc细胞，用于apl的免疫治疗，具有广阔的应用前景。
技术实现要素：
本发明要解决的技术问题之一是提供一种急性早幼粒细胞白血病ctl表位肽。
本发明要解决的技术问题之二是上述ctl表位肽的应用。
ctl表位的筛选和鉴定是apl特异性免疫治疗以及治疗性多肽疫苗研制的重要前提。本发明主要采用理论和实验相结合的方法，预测、合成并初步鉴定出具有强结合力的pml-rarα来源的候选ctl表位肽。
本发明解决上述技术问题采用的技术方案为：
在本发明的一方面，提供一种急性早幼粒细胞白血病ctl表位肽，为九肽，其序列为glapppgsc，如seqidno.1所示；该ctl表位肽为pml-rarα来源的ctl表位肽。
作为本发明优选的技术方案，所述ctl表位肽位于pml-rarα的第771-779位。
作为本发明优选的技术方案，所述ctl表位肽是经syfpeithi、mhcpep及bimas综合预测分析得到，采用标准fmoc方案合成。
所述“pml-rarα来源”是指根据apl特异性抗原pml-rarα的氨基酸序列，用生物信息学方法(syfpeithi、mhcpep及bimas等)进行预测分析，综合分析结果得到肽段序列，也就是说上述九肽的序列是来自于pml-rarα的序列。
所述“syfpeithi”是基于抗原蛋白氨基酸序列信息预测t细胞表位的在线数据库，其数据来源于已发表的数据，网址为：http://www.syfpeithi.de。
所述“mhcpep”是mhc(主要组织相容性复合体)连接肽数据库，预测肽段的亲和力，网址为：http://wehih.wehi.edu.au/mhcpep。
所述“bimas”也是t细胞表位预测数据库，网址为：http://www-bimas.cit.nih.gov/。
“syfpeithi、mhcpep及bimas”均为常用的ctl表位预测数据库。
所述“标准fmoc方案”是指以fmoc(9-芴甲氧羰基)为α-氨基保护基的一种固相合成法，是多肽合成中应用最普遍的合成方法。
在本发明的另一方面，提供所述ctl表位肽在制备治疗apl疫苗中的应用。
本发明的有益效果在于：本发明公开了来源于apl特异性肿瘤抗原pml-rarα的天然ctl表位肽，上述表位肽经t2细胞结合力试验及肽/mhc复合物稳定性分析试验，显示出了高结合力和稳定性，可应用于apl治疗性多肽疫苗、长肽疫苗、多表位疫苗等的研制，在apl免疫治疗领域具有很好的应用前景。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的描述。
实施例一、pml-rarα来源的ctl表位肽的预测
本发明所述的pml-rarα来源的ctl表位肽，是根据抗原的一级结构，采用免疫信息学手段，运用在线生物学软件syfpeithi、mhcpep及bimas对pml-rarα抗原结构的hla-a*0201限制性进行预测分析，综合分析结果筛选得到glapppgsc，如seqidno.1所示(以下简称为“p771”)作为候选ctl表位肽。
实施例二、候选ctl表位肽的合成
候选ctl表位肽委托吉尔生化(上海)有限公司采用标准fmoc方案进行合成，采用反向高效液相色谱法进行纯化和纯度分析，质谱法进行鉴定和分子量测定，结果显示，候选ctl表位肽的纯度高于95％，分子量与理论值相符。
实施例三、上述制备的ctl表位肽可用于apl免疫治疗，其应用实验如下：
1候选ctl表位肽t2细胞结合力试验
1.1收集t2细胞(atcccrl-1992tm，为本实验室保存的atcc标准株)，用无血清rpmi1640培养基洗3次，调整细胞浓度至2×105/ml，铺于24孔板中，1ml/孔。每孔加入2.5μg/ml的β2微球蛋白，50μm的候选肽，于37℃，5％co2培养箱中共孵育18h。
1.2收集孵育后的细胞，用冰pba洗3次，加入100μl1:100稀释的一抗bb7.2，4℃避光孵育30min。
1.3冷pba洗3次，加入50μl1:50稀释的fitc-羊抗鼠igg溶液，4℃避光孵育30min。冷pba洗涤1次，1mlpba重悬，上流式细胞仪检测。以已被鉴定的cox-2321-320(iligeyiki)作为结合力试验的阳性肽，pbs作为阴性对照，未加肽刺激的t2细胞作为背景。
检测结果用荧光系数(fi)表示：荧光系数(fi)＝(候选肽平均荧光强度-背景平均荧光强度)/背景平均荧光强度。
结果判定：若fi＞1.5，候选肽与hla分子具有强结合力；若1.5＜fi小于1.0，候选肽具有中等结合力；若fi＜0.5，候选肽具有弱结合力。
结果：p771的fi值为1.50，具有高亲和力。
2.肽/mhc复合物稳定性分析
2.1收集t2细胞，用无血清rpmi1640培养基洗3次，调整细胞浓度至2×105/ml，铺于24孔板中，1ml/孔。每孔加入2.5μg/ml的β2微球蛋白，50μm的候选肽，于37℃，5％co2培养箱中共孵育18h。
2.2收集孵育后的细胞，用冰pba洗涤3次以洗净未结合的肽，加入10μg/mlbrefeldina孵育1h。
2.3分别以0h，2h，4h，6h为时间点收集细胞。
2.4用冷pba洗涤2次，加入100μl1:100稀释的一抗bb7.2，4℃避光孵育30min。
2.5用冷pba洗涤2次，加50μl1:50稀释的fitc-羊抗鼠igg，4℃避光孵育30min。
2.6冷pba洗涤1次，1mlpba重悬，上流式细胞仪检测。结果以dc50表示。
结果：p771的复合物半衰期大于6小时。
以上实验结果可说明本发明pml-rarα来源的ctl表位肽p771具有高亲和力和稳定性，在apl特异性免疫治疗领域有着巨大的开发应用潜力。