一种靶向人肿瘤干细胞的单克隆抗体及其应用的制作方法

本发明涉及生物医药领域。具体而言，本发明涉及一种针对人肿瘤干细胞的小鼠单克隆抗体或其抗原结合片段，以及产生所述抗体的杂交瘤细胞。本发明还涉及所述抗体在肿瘤治疗和诊断中的用途。

背景技术：

恶性肿瘤(癌症)已成为威胁全世界人民生命与健康的“头号杀手”。全世界每年肿瘤的发病人数超过1400万，仅在我国每年新增的肿瘤患者超过300万。

导致癌症高死亡率的根本原因是癌细胞的扩散、转移和治疗后多数患者易复发和耐药。临床上现有的治疗手段，手术、放疗、化疗对癌细胞转移、复发、耐药疗效甚微，或只有近期疗效，并不能改变患者长期的存活情况。目前，手术切除对大约10-20％的早期患者效果好，但对已发生扩散转移的患者几乎无效。放疗只能治疗局部病灶，常作为术前、术后的辅助治疗和少数种类癌症的根治性治疗。化疗可用于已发生扩散转移的患者，但因毒副作用大，容易产生近期或远期的耐药，因而只能对大约20-30％的患者有明显的近期疗效。即使采用手术、放疗和化疗联合应用的综合治疗措施，其生存5年的远期疗效多年一直徘徊在20-30％，约70-80％的患者在治疗后因转移、复发和耐药在5年内死亡。即便是就诊时无转移的早期癌症患者，也还是有一部分在治疗后发生转移复发而死亡。近年发展起来的肿瘤的新型靶向药物，包括多肽、小分子、蛋白因子、基因治疗及抗体药物，与化疗药联合应用通常也只能相对现有治疗手段延长患者生存期3～9个月，对远期患者的5年生存率没有显著的提高。最近两年新兴起的肿瘤免疫治疗手段，例如针对免疫检查点的pd-1单抗药物以及car-t细胞疗法，虽然已经表现出可取得一些令人鼓舞的远期疗效的迹象，但总体对癌症患者的有效率仅能达到20-30％左右，仍然有大量的癌症患者得不到真正有效的药物的救治。因此提高肿瘤患者远期疗效、延长生存期的关键是开发抑制肿瘤转移、复发、耐药的新型药物。

发明概述

在第一方面，本发明提供了一种单克隆抗体或其抗原结合片段，所述单克隆抗体由于2016年3月16日以保藏号cgmccno.12251保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的小鼠杂交瘤细胞产生。

在第二方面，本发明提供了一种杂交瘤细胞，其以保藏号cgmccno.12251于2016年3月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。

在第三方面，本发明提供了一种药物组合物，其包含本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段以及药学上可接受的载体。

在一些实施方案中，所述单克隆抗体或其抗原结合片段与选自细胞毒素、放射性同位素或生物活性蛋白质的治疗性部分缀合。

在第四方面，本发明提供了一种在患者中治疗恶性肿瘤、预防和/或治疗恶性肿瘤转移或复发的方法，所述方法包括给所述患者施用有效量的本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段或本发明的药物组合物。

在一些实施方案中，所述恶性肿瘤选自乳腺癌、大肠癌、胰腺癌、前列腺癌、肝癌、肺癌和胃癌。

在一些实施方案中，所述方法还包括给所述患者施用其它抗肿瘤治疗手段，例如施用化疗剂、靶向其它肿瘤特异性抗原的抗体或放疗。

在第五方面，本发明提供了本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段或本发明的药物组合物在制备用于治疗恶性肿瘤、预防和/或治疗恶性肿瘤转移或复发的药物中的用途。

在一些实施方案中，所述恶性肿瘤选自乳腺癌、大肠癌、胰腺癌、前列腺癌、肝癌、肺癌和胃癌。

在第六方面，本发明提供了一种检测生物学样品中肿瘤干细胞存在的方法，包括：

a)使所述生物学样品与本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段接触；

b)检测本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段与所述生物学样品中的靶抗原的结合，其中检出所述结合代表所述生物学样品中存在肿瘤干细胞。

在第七方面，本发明还提供一种用于分离肿瘤干细胞的方法，所述方法包括：

(a)提供疑似包含肿瘤干细胞的细胞群；

(b)鉴定所述细胞的亚群，其结合本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段；和

(c)分离所述亚群。

在第六和第七方面的一些实施方案中，所述肿瘤干细胞选自乳腺癌干细胞、大肠癌干细胞、胰腺癌干细胞、前列腺癌干细胞、肝癌干细胞、肺癌干细胞和胃癌干细胞。

在第八方面，本发明还提供了一种检测患者中恶性肿瘤的存在的方法，包括：

a)使获得自所述患者的生物学样品与本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段接触；

b)检测本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段与所述生物学样品中的靶抗原的结合，其中检出代表所述患者中存在恶性肿瘤。

在第九方面，本发明还提供一种用于预后患者中恶性肿瘤复发或进展的方法，所述方法包括：

(a)从所述患者中分离包含循环细胞的生物学样品；

(b)使所述包含循环细胞的生物学样品与本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段接触；和

(c)鉴定结合本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段的循环细胞的存在，

从而预后所述患者中恶性肿瘤的复发或进展。

在一些实施方案中，所述恶性肿瘤的进展包含所述恶性肿瘤在患者中的转移。

在第八和第九方面的一些实施方案中，所述生物学样品包括血液样品、淋巴样品或其组分。在一些实施方案中，所述恶性肿瘤选自乳腺癌、大肠癌、胰腺癌、前列腺癌、肝癌、肺癌和胃癌。

附图说明

图1.活细胞免疫荧光技术检测单抗hetumomab靶抗原在多种肿瘤细胞活细胞表面的表达(部分典型阳性结果)。

图2.免疫组化检测单抗hetumomab靶抗原在人肝癌、肺癌、胃癌组织中特异高表达(部分典型阳性结果)。

图3.免疫流式荧光检测单抗hetumomab识别的癌细胞在人多种肿瘤细胞系的sphere培养细胞中均显著富集(部分典型的流式荧光图谱)。

图4.cck8法检测单抗hetumomab识别的多种人肿瘤细胞(如肝癌、肺癌、胃癌)的hetumomab+细胞的耐药能力(ic50)。

图5.单抗hetumomab显著抑制多种肿瘤(如肝癌、肺癌、胃癌)的肿瘤干细胞的自我更新能力(成球)。

图6.单抗hetumomab显著抑制多种肿瘤(如肝癌、肺癌、胃癌)的肿瘤干细胞的侵袭能力。

图7.单抗hetumomab显著抑制多种肿瘤的肿瘤干细胞的侵袭能力。

图8.单抗hetumomab及联合化疗药物治疗人肝癌移植瘤bel7402-v13的体内肿瘤生长曲线。

图9.单抗hetumomab及联合化疗药物治疗人肝癌移植瘤bel7402-v13的体内肿瘤体积抑制率(停药时)。

图10.单抗hetumomab及联合化疗药物治疗人肝癌移植瘤bel7402-v13的体内肿瘤体积抑制率(停药一个月后)。

图11.单抗hetumomab及联合化疗药物治疗人肝癌移植瘤bel7402-v13的小鼠的生存曲线。

图12.单抗hetumomab治疗人肺癌移植瘤spca-1的体内肿瘤生长曲线。

图13.单抗hetumomab及联合化疗药物治疗人胃癌移植瘤snu-5的体内肿瘤生长曲线。

发明详述

一、定义

在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的蛋白质和核酸化学、分子生物学、细胞和组织培养、微生物学、免疫学相关术语和实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的术语和常规步骤。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。

如本文所用，“抗体”指免疫球蛋白和免疫球蛋白片段，无论天然的或者部分或全部合成(例如重组)产生的，包括其至少包含免疫球蛋白分子的部分可变区的保留全长免疫球蛋白的结合特异性能力的任何片段。因此，抗体包括具有与免疫球蛋白抗原结合结构域(抗体结合位点)同源或基本上同源的结合结构域的任何蛋白。抗体包括抗体片段，例如抗肿瘤干细胞抗体片段。如本文所用，因此术语抗体包括合成抗体、重组产生的抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)、人抗体、非人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、胞内抗体以及抗体片段，例如但不限于fab片段、fab'片段、f(ab’)2片段、fv片段、二硫键连接的fv(dsfv)、fd片段、fd’片段、单链fv(scfv)、单链fab(scfab)、双抗体、抗独特型(抗id)抗体、或者上述任何抗体的抗原结合片段。本文所提供的抗体包括任何免疫球蛋白类型(例如，igg、igm、igd、ige、iga和igy)、任何类别(例如igg1、igg2、igg3、igg4、iga1和iga2)或亚类(例如，igg2a和igg2b)的成员。

如本文所用，抗体的“抗体片段”或“抗原结合片段”指全长抗体的任何部分，其少于全长，但是至少包含结合抗原的所述抗体的部分可变区(例如一个或多个cdr和/或一个或多个抗体结合位点)，并且因此保留结合特异性以及所述全长抗体的至少部分特异性结合能力。因此，抗原结合片段指包含与衍生抗体片段的抗体结合相同抗原的抗原结合部分的抗体片段。抗体片段包括通过酶促处理全长抗体所产生的抗体衍生物，以及合成产生的衍生物，例如重组产生的衍生物。抗体包括抗体片段。抗体片段的实例包括但不限于fab、fab'、f(ab’)2、单链fv(scfv)、fv、dsfv、双抗体、fd和fd’片段以及其他片段，包括修饰的片段(参见，例如，methodsinmolecularbiology,vol207:recombinantantibodiesforcancertherapymethodsandprotocols(2003)；chapter1；p3-25,kipriyanov)。所述片段可以包括连接在一起的多条链，例如通过二硫键和/或通过肽接头。抗体片段一般包含至少或约50个氨基酸，并且典型至少或约200个氨基酸。抗原结合片段包括任何抗体片段，其在被插入抗体框架(例如通过置换相应区域)时获得免疫特异性地结合(即表现出至少或至少约10⁷-10⁸m^-1的ka)抗原的抗体。

如本文所用，“单克隆抗体”指相同抗体的群体，表示单克隆抗体群体中的每个单独的抗体分子与其他抗体分子相同。这种特性与抗体的多克隆群体的特性相反，所述抗体的多克隆群体包含具有多种不同序列的抗体。单克隆抗体可以通过许多公知的方法来制备(smithetal.(2004)j.clin.pathol.57,912-917；和nelsonetal.,jclinpathol(2000),53,111-117)。例如，单克隆抗体可以通过永生化b细胞来制备，例如通过与骨髓瘤细胞融合以产生杂交瘤细胞系或者通过用诸如ebv的病毒感染b细胞。重组技术还可以用来在体外通过用携带编码抗体的核苷酸的人工序列的质粒转化宿主细胞来从宿主细胞的克隆群体制备抗体。

如本文中所用，术语“杂交瘤”或“杂交瘤细胞”指由融合产抗体的淋巴细胞和不产抗体的癌细胞而产生的细胞或细胞系(通常为骨髓瘤或淋巴瘤细胞)。如本领域普通技术人员所知的，杂交瘤可增殖并持续供应产生特定单克隆抗体。用于产生杂交瘤的方法为本领域已知的(见例如，harlow&lane，1988)。当提及术语“杂交瘤”或“杂交瘤细胞”时，其还包括杂交瘤的亚克隆和后代细胞。

如本文所用，术语“表位”指抗体的互补位结合的抗原上的任何抗原决定簇。表位决定簇通常包含分子的化学活性表面分型，例如氨基酸或糖侧链，并且通常具有特定的三维结构特征以及特定的电荷特征。

如本文所用，关于抗体或其抗原结合片段的“特异性结合”或“免疫特异性地结合”在本文中可交换使用，并且指抗体或抗原结合片段通过抗体和抗原的抗体结合位点之间的非共价相互作用与同种抗原形成一个或多个非共价键的能力。所述抗原可以是分离的抗原或存在于肿瘤细胞。通常，免疫特异性地结合(或特异性结合)抗原的抗体是以约或1×10⁷m^-1或1x10⁸m^-1或更大的亲和常数ka(或者1x10^-7m或1×10^-8m或更低的解离常数(kd))结合所述抗原。亲和常数可以通过抗体反应的标准动力学方法来测定，例如，免疫测定、表面等离子共振(spr)(richandmyszka(2000)curr.opin.biotechnol11:54；englebienne(1998)analyst.123:1599)、等温滴定量热法(itc)或本领域已知的其他动力学相互作用测定(参见，例如，paul,ed.,fundamentalimmunology,2nded.,ravenpress,newyork,pages332-336(1989)；还参见描述用于计算抗体的结合亲和力的示例性spr和itc方法的美国专利第7,229,619号)。用于实时检测和监测结合速率的仪器和方法是已知的，并且可商购(参见，biacore2000,biacoreab,upsala,swedenandgehealthcarelifesciences；malmqvist(2000)biochem.soc.trans.27:335)。

如本文所用，关于抗体的术语“竞争”是指第一抗体或其抗原结合片段以与第二抗体或其抗原结合片段足够相似的方式结合一个表位，由此第一抗体与其关联表位的结合结果在存在第二抗体的条件下与不存在第二抗体的条件下相比可检测地降低。或者，在第二抗体与其表位的结合在存在第一抗体条件下也可检测地降低的情况中，可以但不必需是这种情况。也就是说，第一抗体可以抑制第二抗体与其表位的结合，而不用第二抗体抑制第一抗体与其各自表位的结合。然而，在每个抗体均可检测地抑制另一抗体与其关联表位或配体的结合的情况中，无论是相同、更高或更低程度，所述抗体被称为彼此“交叉竞争”结合其各自的表位。竞争及交叉竞争抗体均涵盖在本发明中。无论这种竞争或交叉竞争发生的机制如何(例如位阻、构象改变或者结合共同表位或其片段)，本领域技术人员基于本发明提供的教导将意识到这种竞争和/或交叉竞争抗体涵盖在本发明中且可用于本发明揭示的方法中。

如本文所用，“多肽”指共价连接的两个或更多个氨基酸。术语“多肽”和“蛋白质”在本文中可交换使用。

"分离的蛋白质"、"分离的多肽"或"分离的抗体"指所述蛋白质、多肽或抗体(1)不与在其天然状态下伴随其天然相关成分关联，(2)不含来自相同物种的其它蛋白质，(3)由来自不同物种的细胞表达，或(4)不在天然中发生。因此，经化学合成的多肽或在不同于多肽的天然来源细胞的细胞系统中合成的多肽将会与其天然相关成分"分离"。还可通过分离以使蛋白质实质上不含天然相关成分，即使用本领域众所周知的蛋白质纯化技术。

如本文所用，“治疗”患有疾病或疾病状况的个体表示所述个体的症状部分或全部缓解，或者在治疗后保持不变。因此，治疗包括预防、治疗和/或治愈。预防指防止潜在疾病和/或防止症状恶化或疾病发展。治疗还包括所提供的任何抗体或其抗原结合片段以及本文所提供的组合物的任何药学用途。

如本文所用，“疗效”表示由个体的治疗所导致的效果，其改变、通常改良或改善疾病或疾病状况的症状，或者治愈疾病或疾病状况。

如本文所用，“治疗有效量”或“治疗有效剂量”指施用于对象之后至少足以产生疗效的物质、化合物、材料或包含化合物的组合物的量。因此，其为防止、治愈、改善、阻滞或部分阻滞疾病或病症的症状所必需的量。

如本文所用，“预防有效量”或“预防有效剂量”指在施用于对象时会具有预期的预防效果的物质、化合物、材料或包含化合物的组合物的量，例如，防止或延迟疾病或症状的发生或复发，减少疾病或症状发生或复发的可能性。完全预防有效剂量不必通过施用一个剂量发生，并且可以仅在施用一系列剂量之后发生。因此，预防有效量可以在一次或多次施用中施用。

如本文中所使用的，术语“患者”是指哺乳动物，例如人。

“肿瘤干细胞”是指存在于肿瘤组织中的一小部分具有干性特征的癌细胞，其与普通癌细胞相比具有自我更新能力、强侵袭能力、耐受化疗药物能力和强致瘤能力。

二、针对肿瘤干细胞的单克隆抗体

在本发明中，采用人肿瘤多能干细胞系作为免疫原免疫小鼠，通过经典的杂交瘤融合技术获得了单克隆抗体hetumomab。产生单克隆抗体hetumomab的小鼠杂交瘤细胞株hetumomab于2016年3月16日以保藏号cgmccno.12251保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。(实施例1)

本发明人发现，本发明的单克隆抗体hetumomab的靶抗原表达于多种人肿瘤细胞的活细胞表面，并且在多种肿瘤组织中特异性高表达(阳性率79％-94％)。本发明的hetumomab单抗能够在多种肿瘤细胞的sphere培养细胞中富集且能够识别esa、cd90等肿瘤干细胞标志物的肿瘤细胞，提示hetumomab单抗是特异性针对肿瘤干细胞的单克隆抗体(实施例2)。

进一步的基于hetumomab靶抗原阳性肿瘤细胞的研究显示，相对于亲本肿瘤细胞和hetumomab靶抗原阴性肿瘤细胞，hetumomab靶抗原阳性肿瘤细胞具有更强的自我更新、侵袭、耐药和体内致瘤能力，进一步证明hetumomab单抗特异性靶向肿瘤干细胞(实施例3)。

本发明的hetumomab单抗特异性靶向的肿瘤干细胞包括但不限于乳腺癌干细胞、大肠癌干细胞、胰腺癌干细胞、前列腺癌干细胞、肝癌干细胞、肺癌干细胞和胃癌干细胞。

因此，本发明提供了一种单克隆抗体或其抗原结合片段，所述单克隆抗体由于2016年3月16日以保藏号cgmccno.12251保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的小鼠杂交瘤细胞产生。

本发明还涵盖分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其与hetumomab竞争结合肿瘤干细胞。

本发明还涵盖分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其与hetumomab结合肿瘤干细胞上的相同表位。

三、疾病治疗

肿瘤干细胞是存在于肿瘤组织中的一小部分具有干性特征的癌细胞，具有以下生物学特征：能够自我更新、复制，不定向分化，高致瘤性，高侵袭扩散转移能力，对放化疗均不敏感。由于存在肿瘤干细胞，使得肿瘤不断快速生长、扩散、转移、复发。更为严重的是肿瘤干细胞对几乎所有的传统化疗药物、放疗及近年上市的靶向药物(包括抗体靶向药物)均耐药。肿瘤干细胞均处于细胞周期的g0期不生长、不增殖状态。放化疗只对处于高度快速生长增殖的癌细胞有作用，而不能杀灭处于g0期的肿瘤干细胞。而且当放化疗将大量快速生长的癌细胞杀灭后，抵抗放化疗的肿瘤干细胞反而被筛选富集，比例大大提高。由于肿瘤干细胞具有极强的自我复制能力和扩散转移能力，这些肿瘤干细胞会快速分化增殖，生长并扩散，转移至全身各器官形成新的转移病灶，而这种转移病灶的癌细胞均抵抗放化疗，在乳腺癌、大肠癌、胰腺癌、前列腺癌、肝癌、肺癌、胃癌等多种恶性肿瘤中已经证明了肿瘤干细胞的存在。恶性程度越高的癌症，肿瘤干细胞越多，而肿瘤干细胞比例越高的癌症患者转移、复发越多，生存期越短。

本发明人发现，本发明的特异性识别肿瘤干细胞的hetumomab单抗能够在体外显著抑制多种肿瘤干细胞的自我更新、侵袭和耐药能力(实施例4)。进一步的实验表明，hetumomab单抗能够在动物模型中抑制多种肿瘤移植瘤的生长、转移和耐药(实施例5)。因此，本发明的hetumomab单抗能够通过靶向肿瘤干细胞而用于治疗恶性肿瘤、预防或/或治疗恶性肿瘤转移或复发。

由此，本发明提供了一种在患者中治疗恶性肿瘤、预防或/或治疗恶性肿瘤转移或复发的方法，所述方法包括给所述患者施用有效量的本发明的针对肿瘤干细胞的抗体或其抗原结合片段。可以通过本发明的方法治疗的恶性肿瘤包括但不限于乳腺癌、大肠癌、胰腺癌、前列腺癌、肝癌、肺癌和胃癌。

四、药物组合物

本发明还提供了一种药物组合物，其包含本发明的针对肿瘤干细胞的抗体或其抗原结合片段以及药学上可接受的载体。所述药物组合物用于在患者中治疗恶性肿瘤、预防或/或治疗恶性肿瘤转移或复发。

本文使用的“药学上可接受的载体”包括生理学相容的任何和所有的溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。优选地，该载体适合于静脉内、肌内、皮下、肠胃外、脊柱或表皮施用(如通过注射或输注)。根据施用途径，可将活性化合物即抗体分子、免疫缀合物包裹于一种材料中，以保护该化合物免受可使该化合物失活的酸和其他天然条件的作用。

本发明的药物组合物也可含有药学上可接受的抗氧化剂。药学上可接受的抗氧化剂的例子包括：(1)水溶性抗氧化剂，如抗坏血酸、盐酸半胱氨酸、硫酸氢钠、焦亚硫酸钠，亚硫酸钠等；(2)油溶性抗氧化剂，如棕榈酸抗坏血酸酯、丁羟茴醚(bha)、丁羟甲苯(bht)、卵磷脂、没食子酸丙酯、α-生育酚等；和(3)金属螯合剂，如柠檬酸、乙二胺四乙酸(edta)、山梨糖醇、酒石酸、磷酸等。

这些组合物还可含有佐剂，如防腐剂、润湿剂、乳化剂和分散剂。

可以通过灭菌程序或通过包含诸如对羟基苯甲酸酯、氯代丁醇、苯酚山梨酸等各种抗细菌剂和抗真菌剂确保防止存在微生物。在很多情况下，组合物中优选包含等渗剂，例如，糖、多元醇例如甘露糖醇、山梨糖醇或氧化钠。通过在组合物中加入延迟吸收剂，例如单硬脂酸盐和明胶，可实现注射型药物延长的吸收。

药学上可接受的载体包括无菌水溶液或分散液和用于临时制备无菌注射液或分散液的粉末剂。这些用于药学活性物质的介质和试剂的使用是本领域公知的。常规介质或试剂，除了任何与活性化合物不相容的范围外，都可能在本发明的药物组合物中。还可以向组合物中掺入补充的活性化合物。

治疗性组合物一般必须是无菌的并且在制备和贮存条件下稳定的。可以将组合物配制成溶液、微乳状液、脂质体或其他适合高药物浓度的有序结构。载体可以是含有例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液态聚乙二醇等)及其合适的混合物的溶剂或分散剂。例如，通过使用包衣，例如卵磷脂，在分散液的情况下通过保持所需的颗粒大小，以及通过使用表面活性剂，可以保持适当的流动性。

通过将活性化合物以需要的量混入合适的溶剂中，并且根据需要加入以上列举的成分中的一种或其组合，接着无菌微过滤，可制备无菌注射液。通常，通过将活性化合物掺入到含有基本分散介质和上面所列其他所需成分的无菌载体中制备分散剂。对于用于制备无菌注射液的无菌粉末剂，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥(冻干)，由其预先无菌过滤的溶液得到活性成分加任何额外所需成分的粉末。

可以与载体材料组合制备单一剂量形式的活性成分的量根据所治疗的对象和特定给药方式而不同。可以与载体材料组合制备单一剂量形式的活性成分的量一般是产生治疗效果的组合物的量。通常，以100％计，这个量的范围是大约0.01％至大约99％的活性成分，优选大约0.1％至大约70％，最优选大约1％至大约30％的活性成分，与药学上可接受的载体相组合。

可以调节剂量方案以提供最佳的期望的反应(例如，治疗反应)。例如，可以施用单一推注，可以随时间施用几次分开的剂量，或者根据治疗状况的紧急情况所需，可以按比例减小或增加剂量。特别有利的是将肠胃外组合物配制成容易给药并且剂量均匀的剂量单位形式。此处使用的剂量单位形式是指适合作为单位剂量用于所治疗的对象的物理不连续单位；每个单位含有预定量的活性化合物，经计算该预定量的活性化合物与需要的药物载体组合产生所需的治疗效果。对本发明剂量单位形式的具体说明限定于且直接依赖于(a)活性化合物的独特特性和要达到的特定治疗效果，和(b)本领域中固有的对于配制这种用于治疗个体敏感性的活性化合物的限制。

对于抗体分子的给药而言，剂量范围为约0.0001至100mg/kg，更通常为0.01至20mg/kg受者体重。例如，剂量可以是0.3mg/kg体重、1mg/kg体重、3mg/kg体重、5mg/kg体重，10mg/kg体重或20mg/kg体重，或在1-20mg/kg范围内。示例性的治疗方案需要每周给药一次、每两周一次、每三周一次、每四周一次、每月一次、每3个月一次、每3-6个月一次、或起始给药间隔略短(如每周一次至每三周一次)后期给药间隔加长(如每月一次至每3-6个月一次)。

或者，针对肿瘤干细胞的抗体分子也可以作为持续释放制剂来给药，在此情况中需要频率较低的给药。剂量和频率根据抗体分子在患者中的半衰期而不同。通常，人抗体表现出最长的半衰期，之后是人源化抗体、嵌合抗体和非人类抗体。给药剂量和频率根据处理是预防性的还是治疗性的而不同。在预防性应用中，在长时间内以较不频繁的间隔给予相对较低的剂量。有些患者在余生中持续接受处理。在治疗性应用中，有时需要以较短的间隔给予较高的剂量，直到疾病的进展减轻或停止，优选直到患者表现为疾病症状部分或完全改善。之后，可以以预防性方案给患者给药。

本发明药物组合物中活性成分的实际剂量水平可能改变，以获得可有效实现对特定患者、组合物和给药方式的所需治疗反应，而对患者无毒性的活性成分的量。选择的剂量水平取决于多种药物代谢动力学因素，包括应用的本发明特定组合物的活性，给药途径，给药时间，应用的特定化合物的排泄速率，治疗的持续时间，与应用的特定组合物联合应用的其他药物、化合物和/或材料，接受治疗的患者的年龄、性别、体重、状况、总体健康情况和病史，以及医学领域中公知的类似因素。

“有效量”的本发明的抗体或其抗原结合片段优选地导致疾病症状的严重性降低，疾病无症状期的频率和持续时间增加，或者防止因疾病痛苦而引起的损伤或失能。例如，对于肿瘤的治疗，相对于未接受治疗的对象，“有效量”的本发明的抗体或其抗原结合片段优选地将细胞生长或肿瘤生长抑制至少约10％，优选至少约20％，更优选至少约30％，更优选至少约40％，更优选至少约50％，更优选至少约60％，更优选至少约70％，更优选至少约80％。抑制肿瘤生长的能力可以在预测对人类肿瘤的疗效的动物模型系统中评价。或者，也可以通过检查抑制细胞生长的能力来评价，这种抑制可以通过本领域技术人员公知的试验在体外测定。有效量的本发明的抗体或其抗原结合片段能够减小肿瘤大小，或者以其他方式缓解对象的症状如预防和/或治疗转移或复发。本领域技术人员可以根据如下因素确定这种量，如对象的大小、对象症状的严重性和选择的特定组合物或给药途径。

本发明的抗体或其抗原结合片段或本发明的药物组合物可以利用本领域公知的一种或多种方法通过一种或多种给药途径给药。本领域技术人员应当理解，给药途径和/或方式根据期望的结果而不同。本发明的抗体优选给药途径包括静脉内、肌肉内、皮内、腹膜内、皮下、脊柱或其他肠胃外给药途径，例如注射或输注。本文使用的短语“肠胃外给药”是指除肠和局部给药以外的给药模式，通常是注射，包括但不限于静脉内、肌内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、心内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内、硬膜外和胸骨内注射和输注。

或者，本发明的针对肿瘤干细胞的抗体或其抗原结合片段或本发明的药物组合物也可以通过非肠胃外途径给药，如局部、表皮或粘膜途径给药，例如，鼻内、经口、阴道、直肠、舌下或局部。

活性化合物可以与保护化合物不被快速释放的载体一起制备，例如控释制剂，包括植入物、透皮贴剂和微胶囊递送系统。可以使用生物可降解的、生物相容的聚合物，例如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐类、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸。制备这样的制剂的很多方法受专利保护或者通常为本领域技术人员所公知。参见，例如，sustainedandcontrolledreleasedrugdeliverysystems，j.r.robinson，ed.，marceldekker，inc.，newyork，1978。

治疗性组合物可应用本领域公知的医疗装置给药。例如，在一个优选实施方案中，本发明的治疗组合物可用无针皮下注射装置给药，如在美国专利no.5,399,163；5,383,851；5,312,335；5,064,413；4,941,880；4,790,824；或4,596,556中公开的装置。可用于本发明的公知的植入物和模块的例子包括：美国专利no.4,487,603，该专利公开了用于以受控速率分散药物的可植入微量输注泵；美国专利no.4,486,194，该专利公开了用于通过皮肤给药的治疗装置；美国专利no.4,447,233，该专利公开了用于以精确的输注速率递送药物的医用输注泵；美国专利no.4,447,224，该专利公开了用于连续递送药物的变流可植入输注装置；美国专利no.4,439,196，该专利公开了具有多腔区室的渗透药物递送系统：和美国专利no.4,475,196，该专利公开了一种渗透药物递送系统。这些专利引入本文作为参考。本领域技术人员公知许多其他这样的植入物、递送系统和模块。

在某些实施方案中，本发明的针对肿瘤干细胞的抗体可配制为确保在体内的正确分布。例如，血-脑屏障(bbb)阻止了许多高度亲水性的化合物。为了确保本发明的治疗性化合物能够跨过bbb(如果需要时)，可将它们配制在如脂质体中。至于制备脂质体的方法，参见，例如，美国专利4,522,811；5,374,548和5,399,331。脂质体包含可被选择性地转运入特定细胞或器官内的一个或多个靶向部分，从而增强靶向药物递送(参见，例如，v.v.ranade(1989)j.clin.pharmacol.29：685)。靶向部分的例子包括叶酸或生物素(参见，例如，low等的美国专利5,416,016)；甘露糖苷(umezawa等(1988)biochem.biophys.res.commun.153：1038)；抗体(p.g.bloeman等(1995)febslett.357:140；m.owais等(1995)antimicrob.agentschemother.39:180)；表面活性剂蛋白a受体(briscoe等(1995)am.j.physiol.1233:134)；p120(schreier等(1994)j.biol.chem.269:9090)；也参见k.keinanen；m.l.laukkanen(1994)febslett.346:123；j.j.killion；i.j.fidler(1994)immunomethods4：273。

所述药物组合物中本发明的针对肿瘤干细胞的抗体或其抗原结合片段还可以与诸如细胞毒素、放射性同位素或生物活性蛋白质等治疗性部分缀合。

细胞毒素包括对细胞有害(例如杀伤细胞)的任何试剂。实例包括：紫杉醇、细胞松弛素b、短杆菌肽d、溴化乙啶、吐根碱、丝裂霉素、表鬼臼毒吡喃葡糖苷、表鬼臼毒噻吩糖苷、长春新碱、长春碱、秋水仙素、阿霉素、柔红霉素、二羟基炭疽菌素二酮、米托蒽醌、光辉霉素、放线菌素d、1-脱氢睾酮、糖皮质激素、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛尔和嘌呤霉素和它们的类似物或同系物。

可用于缀合的治疗剂还包括，例如：抗代谢物(例如，氨甲喋呤、6-巯基嘌呤、6-硫代鸟嘌呤、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶、氨烯咪胺)，烷化剂(例如，氮芥、苯丁酸氮芥、苯丙氨酸氮芥、卡莫司汀(bsnu)和洛莫司汀(ccnu)、环磷酰胺、白消安、二溴甘露糖醇、链唑霉素、丝裂霉素c和顺-二氯二胺合铂(ii)(ddp)顺铂)，氨茴霉素类(例如，柔红菌素(以前称为道诺霉素)和阿霉素)，抗生素(例如，放线菌素d(以前称为放线菌素)、博来霉素、光辉霉素和安曲霉素(amc))，和抗有丝分裂剂(例如，长春新碱和长春碱)。

能与本发明的针对肿瘤干细胞的抗体缀合的治疗性细胞毒素的其他优选例子包括倍癌霉素、刺孢霉素、美坦生、阿里他汀、和它们的衍生物。

可以利用本领域使用的接头技术将细胞毒素与本发明的针对肿瘤干细胞的抗体缀合。已经用于将细胞毒素与针对肿瘤干细胞的抗体缀合的接头类型的实例包括但不限于腙、硫醚、酯、二硫化物和含肽的接头。可以选择，例如，在溶酶体区室内易被低ph切割或易被蛋白酶切割的接头，该蛋白酶例如是在肿瘤组织中优先表达的蛋白酶，如组织蛋白酶(例如组织蛋白酶b、c、d)。

关于细胞毒素的类型、用于缀合治疗剂与抗体的接头和方法的进一步讨论，参见saito，g.等(2003)adv.drugdeliv.rev.55：199-215；trail，p.a.等(2003)cancer.immunol.immunother.52：328-337；payne，g.(2003)cancercell3：207-212；allen，t.m.(2002)nat.rev.cancer2：750-763；pastan，i.和kreitman，r.j.(2002)curr.opin.investig.drugs3：1089-1091；senter，p.d.和springer，c.j.(2001)adv.drugdeliv.rev.53：247-264。

本发明的针对肿瘤干细胞的抗体也可以与放射性同位素缀合，产生细胞毒性放射性药物，也被称作放射性抗体缀合物。能够与诊断或治疗性使用的抗体缀合的放射性同位素的例子包括但不限于碘131、铟111、钇90和镥177。制备放射性抗体缀合物的方法在本领域中已经建立。

本发明的针对肿瘤干细胞的抗体也可以与具有需要的生物活性的蛋白质缀合，可用于修饰特定的生物学反应。这样的生物活性蛋白质包括，例如：具有酶活性的毒素或其活性片段，如相思豆毒蛋白、蓖麻毒蛋白a、假单胞菌外毒素或白喉毒素；蛋白质，如肿瘤坏死因子或干扰素-γ；或生物学反应调节物，如淋巴因子、白介素-1(“il-1”)、白介素-2(“il-2”)、白介素-6(“il-6”)、白介素-10(“il-10”)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(“gm-csf”)、粒细胞集落刺激因子(“g-csf”)或其他免疫因子如ifn等。

将这种治疗性部分与抗体分子缀合的技术是众所周知的，参见，例如，arnon等，“monoclonalantibodiesforimmunotargetingofdrugsincancertherapy”，monoclonalantibodiesandcancertherapy，reisfeld等(ed.)，pp.243-56(alanr.liss，inc.1985)；hellstrom等，“antibodiesfordrugdelivery”，controlleddrugdelivery(2nded.)，robinson等(ed.)，pp.623-53(marceldekker，inc.1987)；thorpe，“antibodycarriersofcytotoxicagentsincancertherapy：areview”，monoclonalantibodies’84：biologicalandclinicalapplications，pinchera等(ed.)，pp.475-506(1985)；“analysis，results，andfutureprospectiveofthetherapeuticuseofradiolabeledantibodyincancertherapy”，monoclonalantibodiesforcancerdetectionandtherapy，baldwin等(ed.)，pp.303-16(academicpress1985)，和thorpe等，“thepreparationandcytotoxicpropertiesofantibody-toxinconjugates，”immunol.rev.，62：119-58(1982)。

五、联合治疗

本发明的针对肿瘤干细胞的抗体或药物组合物可以与化疗剂或靶向其他肿瘤抗原的抗体联合施用。本申请实施例5证明了本发明的hetumomab单克隆抗体与化疗剂联合施用在肿瘤治疗中具有协同作用。不受任何理论的限制，认为本发明的针对肿瘤干细胞的抗体能够抑制肿瘤耐药功能，从而能够在与化疗剂或靶向其他肿瘤抗原的抗体组合施用时取得协同效果。

可以与本发明的抗体或本发明的药物组合物组合使用的化疗剂或靶向其他肿瘤抗原的抗体没有特别限制。所述化疗剂和靶向其他肿瘤抗原的抗体的实例包括但不限于：异环磷酰胺、环磷酰胺、达卡巴嗪、替莫唑胺、尼莫司汀、白消安、美法仑、依诺他宾、卡培他滨、卡莫氟、克拉屈滨、吉西他滨、阿糖胞苷、替加氟、替加氟-尿嘧啶、ts-1、去氧氟尿苷、奈拉滨、羟基脲、氟尿嘧啶、氟达拉滨、培美曲塞、喷司他丁、巯嘌呤、甲氨蝶呤、伊立替康、依托泊苷、艾立布林、索布佐生、多西他赛、紫杉醇、长春瑞滨、长春新碱、长春地辛、长春碱、放线菌素d、阿柔比星、氨柔比星、伊达比星、表柔比星、净司他丁酯、柔红霉素、多柔比星、吡柔比星、博来霉素、培洛霉素、丝裂霉素c、米托蒽醌、奥沙利铂、卡铂、顺铂、奈达铂、阿那曲唑、依西美坦、炔雌醇、氯地孕酮、戈舍瑞林、他莫昔芬、地塞米松、比卡鲁胺、托瑞米芬、氟他胺、泼尼松龙、磷雌酚、米托坦、甲睾酮、亮丙瑞林、来曲唑、甲基安宫黄体酮、替伊莫单抗、伊马替尼、依维莫司、厄洛替尼、吉非替尼、舒尼替尼、西妥昔单抗、索拉非尼、达沙替尼、他米巴罗汀、曲妥珠单抗、维甲酸、帕木单抗、贝伐单抗、硼替佐米、和拉帕替尼。在一个具体的实施方式中，所述化疗剂是含铂的化疗剂，例如顺铂。

本发明的抗体和所述化疗剂或靶向其他肿瘤抗原的抗体可以全部在一次施用或分开施用。当分开施用时(采用互相不同的施用方案的情况下)，它们可以连续施用而不中断或以预定的间隔施用。

本发明的抗体和所述化疗剂或靶向其他肿瘤抗原的抗体在本发明的药物组合物中的组合剂量没有特别限制。如上所述，本发明的抗体的剂量可以通过参考当所述抗体单独使用时的剂量来确定。所述化疗剂和靶向其他肿瘤抗原的抗体可以根据各自药物标明的剂量使用或可以减少(考虑到和本发明的抗体的组合效果)。

本发明的抗体或本发明的药物组合物还可以与放疗联合，例如包括向患者施用电离辐射，其早于、在其过程中和/或晚于本发明的抗体或药物组合物的施用过程。

六、肿瘤干细胞检测和纯化

如本文所述，本发明的hetumomab单克隆抗体特异性识别肿瘤干细胞。因此，本发明还提供一种检测生物学样品中肿瘤干细胞存在的方法，包括：

a)使所述生物学样品与本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段接触；

b)检测本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段与所述生物学样品中的靶抗原的结合，其中检出代表所述生物学样品中存在肿瘤干细胞。

在一些实施方案中，所述肿瘤干细胞选自乳腺癌干细胞、大肠癌干细胞、胰腺癌干细胞、前列腺癌干细胞、肝癌干细胞、肺癌干细胞和胃癌干细胞。

在本发明上述检测方法的一些实施方案中，本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段还缀合有可用于检测或可被其他试剂检测到的荧光染料、化学物质、多肽、酶、同位素、标签等。

用于检测抗体-抗原结合的方法是本领域已知的，例如elisa等。

本发明还提供一种用于分离肿瘤干细胞的方法，所述方法包括：

(a)提供疑似包含肿瘤干细胞的细胞群；

(b)鉴定所述细胞的亚群，其结合本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段；和

(c)分离所述亚群。

例如，可以通过流式细胞术分离肝癌干细胞。

七、诊断和预后

如本文所述，本发明的单克隆抗体hetumomab的靶抗原表达于多种人肿瘤细胞的活细胞表面，并且在多种肿瘤组织中特异性高表达(阳性率79％-94％)。

因此，本发明还提供了一种检测患者中恶性肿瘤的存在的方法，包括：

a)使获得自所述患者的生物学样品与本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段接触；

b)检测本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段与所述生物学样品中的靶抗原的结合，其中检出代表所述患者中存在恶性肿瘤。

本发明还提供一种用于预后患者中恶性肿瘤复发或进展的方法，所述方法包括：

(a)从所述患者中分离包含循环细胞的生物学样品；

(b)使所述包含循环细胞的生物学样品与本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段接触；和

(c)鉴定结合本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段的循环细胞的存在，

从而预后所述患者中恶性肿瘤的复发或进展。

在一些实施方案中，所述恶性肿瘤的进展包含所述恶性肿瘤在患者中的转移。

鉴定到结合本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段的循环细胞的存在提示所述患者中恶性肿瘤复发或进展的高风险。

在一些实施方案中，所述生物学样品包括血液样品、淋巴样品或其组分。

在一些实施方案中，所述恶性肿瘤选自乳腺癌、大肠癌、胰腺癌、前列腺癌、肝癌、肺癌和胃癌。

在本发明上述方法的一些实施方案中，本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段还缀合有可用于检测或可被其他试剂检测到的荧光染料、化学物质、多肽、酶、同位素、标签等。

用于检测抗体-抗原结合的方法是本领域已知的，例如elisa等。

八、试剂盒

本发明的范围内还包括用于本发明的方法的试剂盒，该试剂盒包括本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段，以及使用说明。该试剂盒可以进一步包括至少一种另外的检测试剂，其用于检测本发明的单克隆抗体的存在。试剂盒一般包括表明试剂盒内容物的预期用途和/或使用方法的标签。术语标签包括在试剂盒上或与试剂盒一起提供的或以其他方式随试剂盒提供的任何书面的或记录的材料。

实施例

通过参考在此给出的一些具体实施例可获得对本发明的进一步的理解，这些实施例仅用于说明本发明，其无意于对本发明的范围做出任何限制。显然，可以对本发明作出多种改动和变化而不脱离本发明的实质，因此，这些改动和变化同样在本申请要求保护的范围内。

实施例1小鼠单克隆抗体hetumomab的制备

一、抗人肿瘤多能干细胞小鼠单克隆抗体库的制备

本实施例采用一种人肿瘤多能干细胞系t3a-a3作为免疫原(liuh,etal.celldeathanddisease.2013,4:e857)。该人肿瘤干细胞系从原发肝癌患者手术切除的肝癌组织中分离获得，能够在体外长期传代培养。。该细胞系已传代超过100次，细胞仍然生长迅速，并保持干细胞性质。该细胞系既表达多种干细胞的标志物、具有干细胞的自我更新能力、具有向不同肿瘤细胞定向分化的潜能；同时也具有肿瘤性质，具有成瘤能力和转移能力。该细胞系在体外长期培养而保持性质不变，并且在免疫缺陷鼠体内成瘤能力和转移能力强。

将扩大培养获得的肝癌干细胞(人肿瘤多能干细胞)系t3a-a3采用多聚甲醛固定，免疫普通balb/c鼠，2-4周一次，每次约1×10⁷细胞。长期免疫，直至采用常规细胞免疫化学方法测定免疫小鼠血清抗人肝癌干细胞(人肿瘤多能干细胞)系t3a-a3的滴度超过1:50000。取小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞sp2/0采用常规的peg介导融合的方法，融合形成分泌小鼠单克隆抗体的杂交瘤。采用常规的甲基纤维素平板法制备杂交瘤单克隆，待各个单克隆生长后将其分别挑取至96孔板继续培养，由此获得含有大量抗人肝癌干细胞(人肿瘤多能干细胞)系t3a-a3的单克隆抗体的杂交瘤克隆的文库。收集96孔板中每个杂交瘤克隆的培养上清，用于下一步的测定和筛选过程。

二、抗人肿瘤多能干细胞小鼠单克隆抗体hetumomab的筛选

无血清悬浮培养基采用含20ng/mlegf、20ng/mlbfgf、按1:50比例添加b27、10ng/mllif、2mmol/ml谷氨酰胺、1μ/mlheparin的dmem/f12(1:1)培养液。使用无血清培养基培养前洗涤1次细胞。将经无血清悬浮培养的人肝癌干细胞(人肿瘤多能干细胞)系t3a-a3球形细胞，轻柔吹散成单细胞，以2000细胞/孔接种96孔板。用无血清培养基培养24h后，用含1％bsa的pbs洗涤细胞，每孔中分别加入一个杂交瘤克隆的培养上清100μl，室温孵育2小时；用含1％bsa的pbs洗涤5次后，加入生物素标记抗鼠二抗室温，反应30分钟；再用含1％bsa的pbs洗涤5次后，加入cy3标记的avidin，室温反应30分钟；含1％bsa的pbs洗涤5次后，在荧光显微镜下进行荧光镜检，判断单抗库中的各个单抗杂交瘤上清与人肝癌干细胞(人肿瘤多能干细胞)系t3a-a3的反应。能观察到部分细胞具有荧光染色即判断为阳性，初步筛选获得能与人肝癌干细胞(人肿瘤多能干细胞)系t3a-a3膜表面抗原结合的鼠单克隆抗体。

进一步，选择无血清悬浮培养的人肝癌细胞系(yanli,zhao-youtang,sheng-longye,yin-kunliu,jiechen,qiongxue,junchen,dong-meigao,wei-huabao.establishmentofcellcloneswithdifferentmetastaticpotentialfromthemetastatichepatocellularcarcinomacelllinemhcc97.世界胃肠病学杂志(英文版).2001,7(05):630-636.)的球形细胞，同样进行以上程序，荧光显微镜镜检判断单抗库中的杂交瘤单抗上清与人肝癌干细胞(mhcc97l球形细胞富含肝癌干细胞)的反应，获得能与肝癌干细胞膜表面抗原结合的鼠单克隆抗体。

从抗人肿瘤多能干细胞小鼠单克隆抗体库筛选出1株小鼠单克隆抗体hetumomab，其不仅与人肿瘤多能干细胞系t3a-a3膜表面抗原结合，也同时与人肝癌mhcc97l细胞系的干细胞(mhcc97l球形细胞)膜表面抗原结合，证明小鼠单克隆抗体hetumomab能够识别不同来源的人肝癌干细胞。选择小鼠单克隆抗体hetumomab进行进一步鉴定和药效研究。

分泌hetumomab单抗的小鼠杂交瘤细胞以保藏号cgmccno.12251于2016年3月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)(北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所)。

将hetumomab杂交瘤细胞进行扩大培养，收集含抗体上清。采用southernbiotech公司的单抗亚类检测试剂盒鉴定单抗的类和亚类以及sigma公司的elisa二抗检测上清的抗体产量。实验结果显示单抗hetumomab为igg1型重链、κ型轻链。

分泌单抗hetumomab的杂交瘤细胞在体外扩大培养，待细胞长至80％，更换无血清培养基，继续培养4-5天后，收集分泌有抗体的无血清上清液。采用抗proteing纯化柱纯化单抗hetumomab。再用10％sds-page经考马斯亮兰染色鉴定分离纯化的hetumomab单抗的纯度。结果显示，hetumomab的重链分子量约在47kda，轻链分子量约在26kda，这与理论上一般igg抗体重链和轻链的分子量相符合。扫描分析电泳目的条带的纯度在95％以上，纯化的hetumomab单抗纯度满足后续实验的要求。

实施例2hetumomab靶抗原在多种肿瘤细胞及组织中特异表达

一、hetumomab靶抗原在人多种肝癌、肺癌、胃癌细胞系中表达且可表达于活细胞表面。

采用常规活细胞免疫荧光染色技术检测了单抗hetumomab靶抗原在人多种肿瘤细胞系如肝癌、肺癌、胃癌细胞系中在活细胞表面的表达情况。具体技术方法大致如下：细胞爬片或接种96孔培养板(4×10³个/孔)，待细胞长到60％～70％满时，无血清培养液洗2次，pbs洗1次。加入一抗(杂交瘤上清或纯化抗体)，鼠抗α-tublin抗体(稀释度1:1000)作为细胞是否通透的对照，正常鼠igg、sp2/0上清、pbs作为阴性对照，室温孵育1h；活细胞洗液(含1％bsa的pbs)洗涤5次，每次5min；4％多聚甲醛室温下固定15min；固定细胞洗液(含0.1％bsa、0.05％tween-20的pbs)洗涤5次，每次5min；加入100μl的二抗，避光室温孵育30min；固定细胞洗液洗涤5次，每次5min；50μl含10μg/mldapi、50％甘油的pbs封闭；荧光显微镜下观察。以观察到部分细胞出现膜荧光染色为阳性结果。

结果发现，单抗hetumomab靶抗原可表达于以下这些人肝癌、肺癌、胃癌细胞系(购自中国医学科学院基础医学研究所细胞资源中心)活细胞的表面：

人肝癌细胞系：mhcc97l、bel7402-v13；

人肺癌细胞系：a549、spca-1；

人胃癌细胞系：snu-5、bgc-823。

部分典型的阳性结果照片如图1所示。

以上结果说明单抗hetumomab靶抗原在人多种肿瘤，例如肝癌、肺癌、胃癌细胞系中均有表达且可表达于活的癌细胞的膜表面。

二、hetumomab靶抗原在人肝癌、肺癌、胃癌组织中特异高表达。

采用传统的常规免疫组织化学技术，以hetumomab为一抗，采用抗鼠抗体二抗，检测了单抗hetumomab靶抗原在多例人肝癌、肺癌、胃癌患者及相关其他组织中的表达情况。

具体技术方法大致如下：将组织片子常规脱蜡；柠檬酸缓冲液(ph6.0)倒入抗原修复盒，放入片子，将修复盒置于沸水中，水浴加热30min，室温自然冷却2h；pbs洗涤3min×3次，将片子上的水甩干，立即用组化笔沿组织划圈；每块组织上加一滴内源性过氧化物酶阻断溶液，室温孵育20min，pbs洗涤3min×3次，甩掉洗液，加一滴正常动物血清——羊血清封闭，室温孵育20min；甩掉封闭血清，各组织点上加一抗，放入保湿盒中，4℃过夜孵育；甩掉一抗，pbs洗涤3min×3次，甩掉洗液，加二抗biotin-抗鼠抗体二抗，室温孵育20min；pbs洗涤3min×5次，甩掉洗液，加一滴avidin-hrp，室温孵育10min；pbs洗涤3min×3次，甩掉洗液，加一滴新鲜配制的dab，显微镜下观察，同时严格计时，待组织呈阳性后，自来水冲洗终止；苏木素复染5min，1％盐酸-75％酒精分色2秒，自来水冲洗；片子脱水后用中性树胶封片，显微镜下观察。

以单抗hetumomab为一抗，检测了120例人肝癌组织、20例癌旁组织、10例正常肝组织、10例肝炎组织、40例肝硬化组织中单抗hetumomab靶抗原的表达情况。实验结果(表1)显示：单抗hetumomab的靶抗原在79.17％(95/120)的人肝癌组织中特异性表达，而在癌旁组织、正常肝组织、肝炎组织及肝硬化组织中均未见其表达，说明了单抗hetumomab靶抗原在人肝癌组织中特异高表达。

表1.免疫组化技术检测单抗hetumomab靶抗原在人肝癌组织中表达的结果

以单抗hetumomab为一抗，检测了160例人肺癌组织、32例癌旁组织、3例正常肺组织中单抗hetumomab靶抗原的表达情况。实验结果(表2)显示：单抗hetumomab的靶抗原在82.5％(132/160)的人肺癌组织中特异性表达，而仅仅在6.25％的癌旁组织中表达，在正常肺组织中未见其表达，说明了单抗hetumomab靶抗原在人肺癌组织中特异高表达。

表2.免疫组化技术检测hetumomab靶抗原在人肺癌组织中的表达

以单抗hetumomab为一抗，检测了110例人胃癌组织、20例癌旁组织、3例正常胃组织中单抗hetumomab靶抗原的表达情况。实验结果(表3)显示：单抗hetumomab的靶抗原在93.64％(103/110)的人胃癌组织中特异性表达，而在癌旁组织和正常胃组织中均未见其表达，说明了单抗hetumomab靶抗原在人胃癌组织中特异高表达。

表3.免疫组化技术检测单抗hetumomab靶抗原在人胃癌组织中表达的结果

以上免疫组化检测结果的部分典型的阳性结果照片如图2所示。

以上这些结果说明单抗hetumomab靶抗原在人多种肿瘤，例如肝癌、肺癌、胃癌的多数患者的癌组织中均有特异的高表达。

实施例3单抗hetumomab识别肿瘤干细胞

一、单抗hetumomab识别的癌细胞在癌细胞的sphere培养细胞中富集。

根据现有大量文献报道，无血清悬浮培养即sphere(成球)培养可以富集肿瘤干细胞(reynolds,b.a.ands.weiss,"clonalandpopulationanalysesdemonstratethatanegf-responsivemammalianembryoniccnsprecursorisastemcell."devbiol,1996.175(1):p.1-13.；fang,n.,etal.,"phresponsiveadhesionofphospholipidvesicleonpoly(acrylicacid)cushiongraftedtopoly(ethyleneterephthalate)surface."colloidssurfbbiointerfaces,2005.42(3-4):p.245-52.；和tirino,v.,etal.,"theroleofcd133intheidentificationandcharacterisationoftumour-initiatingcellsinnon-small-celllungcancer."eurjcardiothoracsurg,2009.36(3):p.446-53.)。所以根据单抗hetumomab识别的癌细胞能否在sphere培养中得到富集来初步判断单抗hetumomab识别的细胞是否与肿瘤干细胞相关。

对人肝癌细胞系bel7402-v13和mhcc97l细胞进行了无血清培养5天后，采用活细胞流式荧光术对亲本细胞和sphere培养细胞中hetumomab⁺细胞进行了检测。实验结果(表4)显示hetumomab⁺细胞在bel7402-v13sphere细胞的比例为8.92％，比其在亲本细胞中的比例2.25％富集了3.96倍；hetumomab⁺细胞在mhcc97lsphere细胞中的比例为7.51％，比其在亲本细胞中的比例3.45％富集了2.18倍。即经过无血清培养后，肝癌细胞系的hetumomab⁺细胞得到了富集。

表4.免疫流式荧光技术检测单抗hetumomab识别的肝癌细胞在肝癌细胞的sphere培养细胞中富集的结果

对人肺癌细胞系spca-1和a549细胞进行了无血清培养5天后，采用活细胞流式荧光术对亲本细胞和sphere培养细胞中hetumomab⁺细胞进行了检测。实验结果(表5)显示hetumomab⁺细胞在spca-1sphere细胞的比例为7.34％，比其在亲本细胞中的比例1.74％富集了4.22倍；hetumomab⁺细胞在a549sphere细胞中的比例为13.30％，比其在亲本细胞中的比例7.23％富集了1.84倍。即经过无血清培养后，肺癌细胞系的hetumomab⁺细胞得到了富集。

表5.免疫流式荧光技术检测单抗hetumomab识别的肺癌细胞在肺癌细胞的sphere培养细胞中富集的结果

对人胃癌细胞系snu-5和bgc-823细胞进行了无血清培养5天后，采用活细胞流式荧光术对亲本细胞和sphere培养细胞中hetumomab⁺细胞进行了检测。实验结果(表6)显示hetumomab⁺细胞在snu-5sphere细胞的比例为7.19％，比其在亲本细胞中的比例3.38％富集了2.13倍；hetumomab⁺细胞在bgc-823sphere细胞中的比例为7.45％，比其在亲本细胞中的比例2.95％富集了2.53倍。即经过无血清培养后，胃癌细胞系的hetumomab⁺细胞得到了富集。

表6.免疫流式荧光技术检测单抗hetumomab识别的胃癌细胞在胃癌细胞的sphere培养细胞中富集的结果

以上免疫流式荧光检测结果的部分典型的图谱如图3所示。

以上这些结果说明单抗hetumomab识别的癌细胞在人多种肿瘤，例如肝癌、肺癌、胃癌细胞系的sphere培养细胞中均显著富集。

二、单抗hetumomab识别esa、cd90阳性的肿瘤干细胞。

现已有多篇文献(yamashitat,etal.epcampositivehepatocellularcarcinomacellsaretumor-initiatingcellswithstem/progenitorcellfeatures.gastroenterology.2009,136(3):1012-1024.；和yangzf.identificationoflocalandcirculatingcancerstemcellsinhumanlivercancer.hepatology.2008,47(3):919-928.)证明了esa和cd90为一些肝癌细胞的肿瘤干细胞表面标志物。为了检测在人肝癌细胞bel7402-v13细胞中单抗hetumomab识肝癌细胞同时也是esa、cd90标志物阳性的肝癌干细胞，我们采用双色流式荧光术，对在无血清培养基中培养5天的人肝癌bel7402-v13细胞进行了染色。

结果(如表7)显示，单抗hetumomab识别的细胞比例为8.52％，esa⁺干细胞表达比例为9.02％，两者共染比例为3.63％，即单抗hetumomab识别了40.2％的esa⁺干细胞。对在无血清培养基中培养5天的人肝癌mhcc97l细胞进行了染色，结果(如表7)显示，单抗hetumomab识别的细胞比例为2.38％，cd90⁺干细胞表达比例为4.54％，两者共染比例为2.01％，即单抗hetumomab识别了44.3％的cd90⁺干细胞。

表7.双色流式荧光术检测单抗hetumomab与esa、cd90肝癌干细胞表面标志物在肝癌细胞中共染色的结果

以上这些结果说明单抗hetumomab识别esa、cd90等标志物阳性的人肿瘤干细胞。

三、单抗hetumomab识别的癌细胞具有更强的自我更新能力

自我更新能力、强侵袭能力、耐受化疗药物能力和强致瘤能力是肿瘤干细胞区别于普通子代肿瘤细胞的重要基本特征。因此，为了进一步验证单抗hetumomab识别的细胞是否具有肿瘤干细胞特性，分选了多种人肿瘤细胞中的hetumomab⁺细胞，检测其自我更新、侵袭、耐药和体内致瘤能力。

肿瘤干细胞的自我更新能力主要的表现形式为在无血清培养基中的成球能力，其方式称为不对称分裂，即一个细胞分裂成两个子代细胞时，其中一个子代细胞保持着与亲代细胞完全相同的特征，而另一个子代细胞可以继续分裂，形成正常的子代细胞。因此，可以通过检测hetumomab⁺细胞在无血清培养基中的成球能力来确定其自我更新能力。

采用流式分选技术从培养5天的人肝癌bel7402-v13sphere细胞中分离出hetumomab⁺细胞、亲本细胞和hetumomab^-细胞。将分选得到的细胞以500个/孔接种于含0.8％甲基纤维素的半固态sphere培养基(半固态sphere培养基为含0.8％甲基纤维素、20ng/mlegf、20ng/mlbfgf、按1:50比例添加b27、10ng/mllif、2mmol/ml谷氨酰胺、1u/mlheparin的dmem/f12(1:1)培养液)中，在超低粘附24孔板中培养，观察各细胞成球数量。结果显示(表8)，hetumomab⁺细胞、亲本细胞和hetumomab^-细胞在无血清培养基条件下的成球数分别为262±8.5、168±5.6、98±5.6，即hetumomab⁺细胞的成球率明显高于其他两种细胞(p<0.05)。因此，hetumomab⁺细胞比亲本细胞和hetumomab^-细胞具有更强的自我更新能力。

表8肝癌细胞中hetumomab⁺细胞、亲本细胞和hetumomab^-细胞自我更新能力的比较

采用流式分选技术从人肺癌spca-1sphere细胞中分离出hetumomab⁺细胞、亲本细胞和hetumomab^-细胞。将分选得到的细胞以500个/孔接种于含0.8％甲基纤维素的半固态sphere培养基中，在超低粘附24孔板板中培养，观察各细胞成球数量。结果显示(表8)，hetumomab⁺细胞、亲本细胞和hetumomab^-细胞在无血清培养基条件下的成球数分别为165.7±6.0、127±5.6、83.7±4.7，即hetumomab⁺细胞的成球率明显高于其他两种细胞(p<0.05)。因此，hetumomab⁺细胞比亲本细胞和hetumomab^-细胞具有更强的自我更新能力。

表9肺癌细胞中hetumomab⁺细胞、亲本细胞和hetumomab^-细胞自我更新能力的比较

采用流式分选技术从人胃癌snu-5sphere细胞中分离出hetumomab⁺细胞、亲本细胞和hetumomab^-细胞。将分选得到的细胞以500个/孔接种于含0.8％甲基纤维素的半固态sphere培养基中，在超低粘附24孔板板中培养，观察各细胞成球数量。结果显示(表10)，hetumomab⁺细胞、亲本细胞和hetumomab^-细胞在无血清培养基条件下的成球数分别为24±1.4、15.5±0.7、11.5±0.7，即hetumomab⁺细胞的成球率明显高于其他两种细胞(p<0.05)。因此，hetumomab⁺细胞比亲本细胞和hetumomab^-细胞具有更强的自我更新能力。

表10胃癌细胞中hetumomab⁺细胞、亲本细胞和hetumomab^-细胞自我更新能力的比较

以上这些结果说明单抗hetumomab识别的多种癌细胞(肝癌、肺癌、胃癌)均具有更强的自我更新能力，即具有肿瘤干细胞主要特征之一：高自我更新能力。

四、单抗hetumomab识别的癌细胞具有更强的侵袭能力

自我更新能力、强侵袭能力、耐受化疗药物能力和强致瘤能力是肿瘤干细胞区别于普通子代肿瘤细胞的重要基本特征。因此，为了进一步验证单抗hetumomab识别的细胞是否具有肿瘤干细胞特性，故分选了多种人肿瘤细胞中的hetumomab⁺细胞，检测其自我更新、侵袭、耐药和体内致瘤能力。

采用流式分选技术从培养5天的人肝癌bel7402-v13sphere细胞中分离出hetumomab⁺细胞、亲本细胞和hetumomab^-细胞。将分选得到的细胞以相同数量接种于预先包被matrigel胶的transwell小室中，24h后固定，显微镜下观察穿膜的细胞数。结果显示(表11)，hetumomab⁺细胞、亲本细胞和hetumomab^-细胞穿膜的细胞数为分别为每视野308±9.5、210±10.7和132±14.7，即hetumomab⁺细胞的侵袭穿过膜的数量明显高于其他两种细胞(p<0.05)。因此，hetumomab⁺细胞比亲本细胞和hetumomab^-细胞具有更强的侵袭能力。

表11肝癌细胞中hetumomab⁺细胞、亲本细胞和hetumomab^-细胞侵袭能力的比较

采用流式分选技术从培养的人肺癌spca-1sphere细胞中分离出hetumomab⁺细胞、亲本细胞和hetumomab^-细胞。将分选得到的细胞以相同数量接种于预先包被matrigel胶的transwell小室中，24h后固定，显微镜下观察穿膜的细胞数。结果显示(表12)，hetumomab⁺细胞、亲本细胞和hetumomab^-细胞穿膜的细胞数为分别为每视野222±11.5、193.7±5.7、154.3±12.1，即hetumomab⁺细胞的侵袭穿过膜的数量明显高于其他两种细胞(p<0.05)。因此，hetumomab⁺细胞比亲本细胞和hetumomab^-细胞具有更强的侵袭能力。

表12肺癌细胞中hetumomab⁺细胞、亲本细胞和hetumomab^-细胞侵袭能力的比较

采用流式分选技术从培养的人胃癌snu-5sphere细胞中分离出hetumomab⁺细胞、亲本细胞和hetumomab^-细胞。将分选得到的细胞以相同数量接种于预先包被matrigel胶的transwell小室中，24h后固定，显微镜下观察穿膜的细胞数。结果显示(表13)，hetumomab⁺细胞、亲本细胞和hetumomab^-细胞穿膜的细胞数为分别为每视野247.5±19.1、142.5±9.2和145.0±11.3，即hetumomab⁺细胞的侵袭穿过膜的数量明显高于其他两种细胞(p<0.05)。因此，hetumomab⁺细胞比亲本细胞和hetumomab^-细胞具有更强的侵袭能力。

表13胃癌细胞中hetumomab⁺细胞、亲本细胞和hetumomab^-细胞侵袭能力的比较

以上这些结果说明单抗hetumomab识别的多种癌细胞(肝癌、肺癌、胃癌)均具有更强的侵袭能力，即具有肿瘤干细胞主要特征之一：高侵袭性。

五、单抗hetumomab识别的癌细胞具有更强的耐受化疗药物的能力

自我更新能力、强侵袭能力、耐受化疗药物能力和强致瘤能力是肿瘤干细胞区别于普通子代肿瘤细胞的重要基本特征。因此，为了进一步验证单抗hetumomab识别的细胞是否具有肿瘤干细胞特性，故分选了多种人肿瘤细胞中的hetumomab⁺细胞，检测其自我更新、侵袭、耐药和体内致瘤能力。

为了检测hetumomab⁺肝癌细胞的耐药能力，将人肝癌细胞bel7402-v13sphere细胞流式分选获得的hetumomab⁺细胞、亲本细胞和hetumomab^-细胞以5000个/孔的数量接种于96孔板中，每组细胞均用含0μg/ml、0.0625μg/ml、0.125μg/ml、0.25μg/ml、0.5μg/ml、1μg/ml、2μg/ml和4μg/ml8种不同浓度的顺铂的完全培养基培养，3天后更换1次培养基，7天后用cck8法检测od值测定反映其耐药能力的ic50。实验结果显示(表14，图4)，hetumomab⁺细胞、亲本细胞和hetumomab^-细胞的ic50分别为0.739μg/ml、0.502μg/ml和0.313μg/ml，即hetumomab⁺细胞的耐药性明显高于亲本细胞和hetumomab^-细胞，差异有统计学意义(p<0.05)。因此，hetumomab⁺肝癌细胞比亲本细胞和hetumomab^-细胞具有更强的耐受化疗药物的能力。

表14肝癌细胞中hetumomab⁺细胞、亲本细胞和hetumomab^-细胞耐受化疗药物能力的比较

为了检测hetumomab⁺肺癌细胞的耐药能力，将人肺癌细胞spca-1sphere细胞中流式分选获得的hetumomab⁺细胞、亲本细胞和hetumomab^-细胞以5000个/孔的数量接种于96孔板中，每组细胞均用含0μg/ml、0.2μg/ml、0.4μg/ml、0.6μg/ml、0.8μg/ml、1μg/ml和2μg/ml7种不同浓度的顺铂的完全培养基培养，之后用cck8法检测od值测定反映其耐药能力的ic50。实验结果显示(表15，图4)，hetumomab⁺细胞、亲本细胞和hetumomab^-细胞的ic50分别为0.707μg/ml、0.513μg/ml和0.180μg/ml，即hetumomab⁺细胞的耐药性明显高于亲本细胞和hetumomab^-细胞，差异有统计学意义(p<0.05)。因此，hetumomab⁺肺癌细胞比亲本细胞和hetumomab^-细胞具有更强的耐受化疗药物的能力。

表15肺癌癌细胞中hetumomab⁺细胞、亲本细胞和hetumomab^-细胞耐受化疗药物能力的比较

为了检测hetumomab⁺胃癌细胞的耐药能力，我们将人胃癌细胞snu-5sphere细胞中流式分选获得的hetumomab⁺细胞、亲本细胞和hetumomab^-细胞以5000个/孔的数量接种于96孔板中，每组细胞均用含0μg/ml、0.0125μg/ml、0.025μg/ml、0.05μg/ml、0.1μg/ml、0.2μg/ml、0.4μg/ml和0.8μg/ml8种不同浓度的顺铂的完全培养基培养，之后用cck8法检测od值测定反映其耐药能力的ic50。实验结果显示(表16，图4)，hetumomab⁺细胞、亲本细胞和hetumomab^-细胞的ic50分别为0.285μmol/l、0.155μmol/l和0.094μmol/l，即hetumomab⁺细胞的耐药性明显高于亲本细胞和hetumomab^-细胞，差异有统计学意义(p<0.05)。因此，hetumomab⁺胃癌细胞比亲本细胞和hetumomab^-细胞具有更强的耐受化疗药物的能力。

表16胃癌细胞中hetumomab⁺细胞、亲本细胞和hetumomab^-细胞耐受化疗药物能力的比较

以上这些结果说明单抗hetumomab识别的多种癌细胞(肝癌、肺癌、胃癌)均具有更强的耐受化疗药物能力，即具有肿瘤干细胞主要特征之一：强耐药性。

六、单抗hetumomab识别的癌细胞具有更强的体内致瘤能力

自我更新能力、强侵袭能力、耐受化疗药物能力和强致瘤能力是肿瘤干细胞区别于普通子代肿瘤细胞的重要基本特征。因此，为了进一步验证单抗hetumomab识别的细胞是否具有肿瘤干细胞特性，故分选了多种人肿瘤细胞中的hetumomab⁺细胞，检测其自我更新、侵袭、耐药和体内致瘤能力。

检验一种细胞是否为肿瘤干细胞的“金标准”是体内的强致瘤性。因此，将人肝癌细胞bel7402-v13sphere细胞流式分选获得的hetumomab⁺细胞、亲本细胞和hetumomab^-细胞分别接种至4周龄大小的裸鼠皮下，长时间观察其体内成瘤的情况。结果如表17所示，1×10⁴个hetumomab⁺细胞在接种3周时就可在小鼠体内致瘤，而亲本细胞则需1×10⁵个细胞在接种3周后才出瘤，hetumomab^-细胞在观察期间始终没有出瘤。这项经典实验的结果说明hetumomab⁺细胞的体内致瘤性较亲本和hetumomab^-细胞显著强。提示hetumomab⁺细胞具有肿瘤干细胞的高致瘤性特征，符合肿瘤干细胞的判定“金标准”。因此，单抗hetumomab识别的细胞是肝癌肿瘤干细胞。

表17肝癌细胞bel7402-v13中hetumomab⁺细胞、亲本细胞和hetumomab^-细胞体内致瘤能力的比较(成瘤的动物只数)

将人胃癌细胞snu-5sphere细胞流式分选获得的hetumomab⁺细胞、亲本细胞和hetumomab^-细胞分别接种至4周龄大小的裸鼠皮下，长时间观察其体内成瘤的情况。结果如表18所示，2×10³个hetumomab⁺细胞在接种3月时就可在小鼠体内半数小鼠致瘤，而亲本细胞2×10³个细胞在接种4个月后仍未出瘤，hetumomab^-细胞在观察期间始终没有出瘤。这项经典实验的结果说明hetumomab⁺细胞的体内致瘤性较亲本和hetumomab^-细胞显著强。提示hetumomab⁺细胞具有肿瘤干细胞的高致瘤性特征，符合肿瘤干细胞的判定“金标准”。因此，单抗hetumomab识别的细胞是胃癌肿瘤干细胞。

表18胃癌细胞snu-5中hetumomab⁺细胞、亲本细胞和hetumomab^-细胞体内致瘤能力的比较(成瘤的动物只数)

以上这些结果说明单抗hetumomab识别的多种癌细胞(肝癌、胃癌)均具有更强的体内致瘤能力，即具有肿瘤干细胞主要特征之一高致瘤性。

实施例4单抗hetumomab可以抑制肿瘤干细胞的自我更新、侵袭和耐药功能

一、单抗hetumomab显著抑制多种肿瘤(肝癌、胃癌、肺癌)的肿瘤干细胞的自我更新能力(肿瘤干细胞主要特征之一)。

肿瘤干细胞的自我更新能力主要的表现形式为在无血清培养基中的成球能力，其方式称为不对称分裂，即一个细胞分裂成两个子代细胞时，其中一个子代细胞保持着与亲代细胞完全相同的特征，而另一个子代细胞可以继续分裂，形成正常的子代细胞。为了证明单抗hetumomab是否是能够直接抑制肝癌干细胞的功能性单抗，我们将在无血清培养基中培养5天的人肝癌细胞系bel7402-v13sphere细胞制备成单细胞悬液后，以纯化的单抗hetumomab(250μg/ml)为实验组，以pbs为阴性对照组，与细胞在37℃孵育2h，期间每隔半小时将细胞与抗体或阴性对照混匀一次。各组取500个细胞接种于含0.8％甲基纤维素的半固态sphere培养基(含egf、lif、bfgf等)中，于超低粘附24孔板板中培养，隔天补液1-1.5ml，14天后观察两组细胞成球数量。实验结果(图5)显示，实验组的成球数量为212±2.8，而阴性对照组的成球数量为278.5±0.7个，明显高于实验组。单抗hetumomab对bel7402-v13细胞的成球抑制率达23.9％，p<0.05，有统计学差异。结果表明，单抗hetumomab可直接作用于肝癌干细胞并抑制其自我更新能力。

为了证明单抗hetumomab是否是能够直接抑制肺癌干细胞的功能性单抗，采用同样的方法检测了单抗hetumomab对人肺癌细胞系spca-1成球的抑制作用。结果(如表19、图5)显示，实验组最高抗体浓度的成球数量为88.3±7.2，而阴性对照组的成球数量为151.3±9.1个，明显高于实验组，单抗hetumomab对spca-1细胞的成球抑制率达41.6％，p<0.01，有统计学差异。结果表明，单抗hetumomab可直接作用于肺癌干细胞并抑制其自我更新能力。

表19检测单抗hetumomab抑制人肺癌细胞系spca-1成球的结果

为了证明单抗hetumomab是否是能够直接抑制胃癌干细胞的功能性单抗，采用同样的方法检测了单抗hetumomab对人胃癌细胞系snu-5的cd44阳性细胞肿瘤干细胞亚群成球的抑制作用。结果(如表20、图5)显示，实验组最高抗体浓度的成球数量为18±2.0，而阴性对照组的成球数量为128±4.0个，明显高于实验组，单抗hetumomab对snu-5cd44⁺细胞的成球抑制率达85.9％，p<0.01，有统计学差异。结果表明，单抗hetumomab可直接作用于胃癌干细胞并抑制其自我更新能力。

表20检测单抗hetumomab抑制人胃癌细胞系snu-5cd44⁺细胞成球的结果

以上这些结果说明单抗hetumomab可以直接显著抑制多种癌细胞(肝癌、肺癌、胃癌)的自我更新能力，证明单抗hetumomab不仅能识别靶向肿瘤干细胞，而且是可以直接抑制肿瘤干细胞的功能性(治疗性)抗肿瘤干细胞单抗。

二、单抗hetumomab显著抑制多种肿瘤(肝癌、胃癌、肺癌)的肿瘤干细胞的侵袭能力(肿瘤干细胞主要特征之二)。

高侵袭性是肿瘤干细胞的另一个重要生物学特征。为了证明单抗hetumomab是否是能够直接抑制肝癌干细胞的功能性单抗，采用transwell侵袭实验对单抗hetumomab抑制肝癌细胞的侵袭能力进行了分析。实验结果显示(图6)，pbs阴性对照组的侵袭细胞数为(301.0±16.3)/视野，单抗hetumomab(0.5mg/ml)组的侵袭细胞数为(148±16.4)/视野。实验结果表明，单抗hetumomab直接作用后的细胞侵袭能力明显减弱，其对bel7402-v13sphere细胞侵袭的抑制率为50.8％，p<0.05，有统计学差异。该实验结果表明，单抗hetumomab可直接作用于肝癌干细胞并抑制其侵袭能力。

为了证明单抗hetumomab是否是能够直接抑制肺癌干细胞的功能性单抗，采用同样的方法检测了单抗hetumomab对人肺癌细胞系spca-1侵袭的抑制作用。实验结果显示(表21、图6)，pbs阴性对照组的侵袭细胞数为(232.3±3.1)/视野，单抗hetumomab组的侵袭细胞数最低为(153.0±6.1)/视野。实验结果表明，单抗hetumomab直接作用后的细胞侵袭能力明显减弱，其对spca-1sphere细胞侵袭的抑制率为34.1％，p<0.05，有统计学差异。该实验结果表明，单抗hetumomab可直接作用于肺癌干细胞并抑制其侵袭能力。

表21检测单抗hetumomab抑制人肺癌细胞系spca-1侵袭的结果

为了证明单抗hetumomab是否是能够直接抑制胃癌干细胞的功能性单抗，采用同样的方法检测了单抗hetumomab对人胃癌细胞系snu-5的cd44阳性细胞肿瘤干细胞亚群侵袭的抑制作用。实验结果显示(表22、图6)，pbs阴性对照组的侵袭细胞数为(231±7.0)/视野，单抗hetumomab组的侵袭细胞数最低为(56±4.0)/视野。实验结果表明，单抗hetumomab直接作用后的细胞侵袭能力明显减弱，其对snu-5cd44⁺细胞侵袭的抑制率为75.8％，p<0.05，有统计学差异。该实验结果表明，单抗hetumomab可直接作用于胃癌干细胞并抑制其侵袭能力。

表21检测单抗hetumomab抑制人胃癌细胞系snu-5cd44⁺细胞侵袭的结果

以上这些结果说明单抗hetumomab可以直接显著抑制多种癌细胞(肝癌、肺癌、胃癌)的侵袭能力，证明单抗hetumomab不仅能识别靶向肿瘤干细胞，而且是可以直接抑制肿瘤干细胞的功能性(治疗性)抗肿瘤干细胞单抗。

三、单抗hetumomab显著抑制多种肿瘤(肝癌、肺癌)的肿瘤干细胞的耐受化疗药物的能力(肿瘤干细胞主要特征之三)。

耐药是肿瘤干细胞的生物学特征之一。为了证明单抗hetumomab是否是能够直接抑制肝癌干细胞的功能性单抗，将培养5天的bel7402-v13sphere细胞以5000个/孔的数量接种于96孔板中，并加入纯化的单抗hetumomab(0.5mg/ml)和pbs于各孔中，在37℃，5％co2孵箱中培养24h后，移去含抗体的培养基，每组细胞均用含0、0.0625、0.125、0.25、0.5、1、2、4和8μg/ml共9不同浓度顺铂的培养基培养细胞，48h更换1次含顺铂的完全培养基，5天后按照cck-8试剂盒说明书加入cck-8试剂，检测od450吸光度值，并计算各组ic50值。实验结果显示(图7)，单抗hetumomab直接作用后的细胞的耐药能力明显下降，其ic50值为0.334μg/ml，而对照组的ic50值为0.9μg/ml，单抗hetumomab直接作用的细胞耐药能力明显低于对照组。该实验结果表明，单抗hetumomab可直接作用于肝癌干细胞并抑制其耐药的能力。

为了证明单抗hetumomab是否是能够直接抑制肺癌干细胞的功能性单抗，采用同样的方法检测了单抗hetumomab对人肺癌细胞系spca-1耐药的抑制作用。实验结果显示(图7)，单抗hetumomab直接作用后的细胞的耐药能力明显下降，其ic50值最低为0.136μg/ml，而对照组的ic50值为0.351μg/ml，单抗hetumomab直接作用的细胞耐药能力明显低于对照组。该实验结果表明，单抗hetumomab可直接作用于肺癌干细胞并抑制其耐药的能力。

以上这些结果说明单抗hetumomab可以直接显著抑制多种癌细胞(肝癌、肺癌)的耐受化疗药物的能力，证明单抗hetumomab不仅能识别靶向肿瘤干细胞，而且是可以直接抑制肿瘤干细胞的功能性(治疗性)抗肿瘤干细胞单抗。

实施例5单抗hetumomab在动物体内具有抑制肿瘤移植瘤生长、协同化疗的药效学作用

前面的一系列实验结果证明，单抗hetumomab是靶向多种肿瘤干细胞的单抗；并且体外药效学研究结果表明，单抗hetumomab可以明显的抑制多种肿瘤干细胞的自我更新、侵袭和耐药能力。为了进一步明确单抗hetumomab在体内对多种肿瘤生长、转移和耐药的影响，采用多种人肿瘤动物模型，评价了单抗hetumomab在体内对多种肿瘤生长、转移和耐药的药效学作用。

一、单抗hetumomab显著抑制人肝癌移植瘤在体内的生长，并能明显协同增强化疗的疗效、显著延长生存期，具有显著的抗肿瘤药效学作用。

进行了单抗hetumomab在裸鼠体内治疗肝癌的实验研究，观察并比较单用单抗、单用化疗药及单抗联合化疗药治疗肝癌的疗效，分析比较单抗hetumomab在体内能否治疗肝癌的生长和耐药，并探讨靶向肝癌干细胞治疗肝癌的最优方案。

将bel7402-v13的sphere细胞以3万/只接种至裸鼠皮下，将裸鼠随机分为6组(6只/组)，分别为：单独化疗药组(顺铂0.3mg/kg，6只)；抗体高剂量组(10mg/kg，6只)；抗体高剂量+化疗组(6只)；抗体低剂量组(2.5mg/kg，6只)；抗体低剂量+化疗组(6只)；pbs组(6只)。接种细胞后第二天开始治疗，每周治疗2次，5周后结束治疗。每周2次测量皮下移植瘤的长径和短径，用公式v＝(π/6)×(长径×短径×短径)计算瘤体积，观察各组的肿瘤体积、生长速率的变化。停药后，继续观察移植瘤的生长情况，并记录肿瘤大小。肿瘤生长速率＝(vt-v0)/天数，vt是每次测量时的肿瘤体积，v0是给药前的肿瘤体积(v0指停止给药时的肿瘤体积)。

小鼠体内移植瘤的生长曲线如图8所示，单抗hetumomab能显著抑制裸鼠体内移植瘤的生长。并且随着抗体的剂量升高移植瘤抑制率也逐渐升高，存在着剂量依赖关系。实验结果如图9显示，在治疗5个星期停药时，高、低剂量的单抗hetumomab对移植瘤的抑制率分别为71.5％、54.4％，化疗药组的抑制率为83.5％，单抗高、低剂量联合化疗药组的抑制率相似，都达到了97％左右。结果提示，与单用单抗和单用化疗药组相比，单抗联合化疗药组在移植瘤的治疗中显示出了较好的治疗效果。

停药一个月时，小鼠出现死亡的情况。这时各组的抑制率如图10所示，单抗高、低对移植瘤的抑制率分别为49.1％、34.4％，单抗高、低联合化疗药组的抑制率相似，约为84.5％左右，但单用化疗药组的抑制率为48.6％。该结果提示，单抗联合化疗药组对小鼠移植瘤的抑制率高于其他几种治疗方案组，p<0.05，差异有统计学意义。停药后一个月时的移植瘤体积与停药时的相比，单抗联合化疗组的肿瘤生长速率为0.051cm³/天，比pbs对照组肿瘤生长速率(0.239cm³/天)低4.7倍，且比单抗高、低剂量组和化疗药组的肿瘤生长速率(0.148cm³/天、0.185cm³/天和0.154cm³/天)分别低2.9、3.6和3.1倍，该结果表明单抗联合化疗药的方法可有效抑制肿瘤的生长和复发。

整个治疗和观察过程持续六个月。小鼠在六个月中生存曲线(图11)显示，这6组小鼠的生存曲线分布差别有统计学意义，p<0.05。说明单抗联合化疗药组的小鼠生存状况明显好于pbs对照组、单抗组和化疗药组。提示，单抗联合化疗药治疗可以延长小鼠的生存期。

以上结果说明，单抗hetumomab单独使用能够显著抑制人肝癌移植瘤的生长，具有显著的抑制肝癌的药效学作用。单抗hetumomab联合化疗药组都显示出了对移植瘤高的抑制率，能显著抑制肿瘤的生长，且治疗效果优于单用抗体组和单用化疗药组，表明单抗联合化疗药可有效抑制肿瘤的生长，降低化疗耐药。联合用药组的小鼠生存期明显大于单用抗体组和单用化疗药组，表明单抗hetumomab联合化疗药治疗肿瘤的方案不仅能治疗肿瘤的生长，还能延长小鼠的生存期，可能是显著抑制了肿瘤在体内的转移引起的小鼠死亡。

二、单抗hetumomab显著抑制人肺癌移植瘤在体内的生长，具有显著的抗肿瘤药效学作用。

进行了单抗hetumomab在裸鼠体内治疗肺癌的实验研究，并观察单用单抗、单用化疗药治疗肺癌的疗效。

具体地，收获人肺癌细胞系spca-1的球体细胞，以2.5×10⁵个细胞/只接种裸小鼠。共分5组，每组5只：pbs对照组、单独化疗组(顺铂0.3mg/kg)、hetumomab抗体高剂量组(40mg/kg)、hetumomab抗体中剂量组(10mg/kg)、hetumomab低剂量组(2.5mg/kg)。接种肺癌细胞后第2天开始抗体治疗，实验组以及对照组通过腹腔注射进行治疗，共治疗至接种28天后，停药。化疗药组治疗每周2次。每周2次测量皮下移植瘤的长径和短径，计算瘤体积，公式v＝(π/6)×(长径×短径×短径)。观察各组的肿瘤体积变化。

接种28天后停止治疗时，观察并测量小鼠瘤体积生长情况，计算抑制率。小鼠体内移植瘤的生长曲线如图12所示，瘤体积抑制率如表22所示，单抗hetumomab能显著抑制裸鼠体内移植瘤的生长，并随着抗体的剂量升高移植瘤抑制率也相应升高，在停药时，高、中、低剂量的单抗hetumomab对移植瘤的抑制率分别为55.97％、43.56％、35.58％，化疗药组的抑制率仅为24.91％。

以上结果说明，单抗hetumomab单独使用能够显著抑制人肺癌移植瘤的生长，具有显著的抑制肺癌的药效学作用。

表22单抗hetumomab抑制动物体内人肺癌spca-1移植瘤生长的结果

三、单抗hetumomab显著抑制人胃癌移植瘤在体内的生长，并能明显协同增强化疗的疗效，具有显著的抗肿瘤药效学作用。

进行了单抗hetumomab在裸鼠体内治疗胃癌的实验研究，并观察比较单用单抗、单用化疗药及单抗联合化疗药治疗胃癌的疗效，分析比较单抗hetumomab在体内能否治疗胃癌的生长和协同增强化疗疗效。

具体地，收获人胃癌细胞系snu-5-v13的球体细胞，以2.5×10⁵个细胞/只接种裸小鼠。共分7组，每组8只：pbs对照组、鼠igg对照组、单独化疗组(顺铂0.3mg/kg)、hetumomab抗体高剂量组(20mg/kg)、hetumomab低剂量组(1.25mg/kg)、hetumomab高剂量+化疗药、hetumomab低剂量+化药。接种胃癌细胞后第2天开始抗体治疗，实验组以及对照组通过腹腔注射进行治疗，共治疗一个月后，停药。化疗药组治疗4周，每周2次后停药。每周2次测量皮下移植瘤的长径和短径，计算瘤体积，公式v＝(π/6)×(长径×短径×短径)。观察各组的肿瘤体积变化。

接种一个月后停止治疗时，观察并测量小鼠瘤体积生长情况，计算抑制率。小鼠体内移植瘤的生长曲线如图13所示，瘤体积抑制率如表23所示，单抗hetumomab能显著抑制裸鼠体内移植瘤的生长，并随着抗体的剂量升高移植瘤抑制率也相应升高，在停药时，高、低剂量的单抗hetumomab对移植瘤的抑制率分别为57.62％、30.68％，化疗药组的抑制率仅为33.16％，单抗高、低剂量联合化疗药组的抑制率分别达到了70.68％和47.93％，结果提示，单抗联合化疗药组对小鼠移植瘤的抑制率高于单独化疗和单独抗体治疗的治疗方案组，p<0.05，单抗联合化疗药组在移植瘤的治疗中显示出了更好的治疗效果。

以上结果说明，单抗hetumomab单独使用能够显著抑制人胃癌移植瘤的生长，具有显著的抑制胃癌的药效学作用。单抗hetumomab联合化疗药组都显示出了对移植瘤高的抑制率，能显著抑制肿瘤的生长，且治疗效果优于单用抗体组和单用化疗药组，表明单抗联合化疗药可有效抑制肿瘤的生长，降低化疗耐药。

表23单抗hetumomab抑制动物体内人胃癌snu-5移植瘤生长的结果

以上这一系列动物体内抑制肿瘤的实验结果证明，单抗hetumomab在体内对多种人肿瘤(如肝癌、肺癌、胃癌)的生长和耐药具有显著的抑制作用(药效学作用)，对于治疗多种肿瘤生长、转移和耐药具有重要的应用价值。