一种单克隆抗体的制作方法

本发明涉及生物
技术领域：
，特别涉及一种单克隆抗体。
背景技术：
：凝血级联反应是止血过程的中心环节。当凝血途径存在缺陷时，出血时间(bleedingtime)延长，出血量增加。凝血因子是参与凝血过程的蛋白质分子，生理情况下，多数凝血因子以无活性的酶原形式存在，当组织损伤时，这些凝血因子相继被酶解激活转化为有活性的蛋白酶，最终凝血酶原转化为凝血酶，使可溶性的纤维蛋白原转变为不溶性的纤维蛋白团块。凝血因子vii属维生素k依赖的凝血因子,由肝脏合成，其主要作用是与组织因子形成复合物，从而启动外源性凝血途径。血友病a和血友病b为x染色体连锁的遗传性出血性疾病，分别以凝血因子viii(fviii)和ix(fix)缺乏为特征。这类病人面临着创伤后大量出血和自发性出血的危险。世界卫生组织统计显示血友病a的发病率约为1/5000新生男婴，血友病b的发病率约1/20000新生男婴。血友病的传统治疗方式是凝血因子补充治疗，即静脉输注血浆来源或基因重组的fviii或fix，纠正凝血因子异常，降低出血倾向。但是，约有25％的重症血友病a病人产生fviii抑制物(抗体)，约有4％的重症血友病b病人产生fix抑制物，使凝血因子补充治疗疗效降低甚至无效。许多患者死于无法控制的出血；因出血而导致的重度关节损害的问题仍然十分严重；对有抑制物的患者进行手术时如何止血，尤其是一个特殊的难题。fviia可通过旁路途径绕过依赖于fviii和fix的凝血途径，激活fx产生fxa,促进大量的凝血酶原转化成凝血酶，形成“凝血酶爆发”。重组fviia用于治疗存在有fviii或fix抑制物的先天性血友病患者的自发性或手术性出血，先天性凝血因子vii缺乏患者。人凝血因子vii抗体可用于重组凝血因子vii的亲和层析纯化及检测。然而，一般抗体介导的亲和层析需采用酸洗脱，由此产生的影响之一是改变了纯化工艺中的样品缓冲液，使纯化工艺复杂化；此外，低ph极有可能影响样品的活性。而钙离子依赖的抗体可在原有样品缓冲液中加入钙离子螯合剂edta使抗原抗体分离，避免了酸洗脱带来的上述不利影响。因此，迫切需要自主开发钙离子依赖的抗人凝血因子vii单克隆抗体。技术实现要素：有鉴于此，本发明提供一种单克隆抗体。该单克隆抗体可与凝血因子vii特异性结合，具有较好的亲和力。为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：本发明提供了一种钙离子依赖的特异性结合凝血因子vii的单克隆抗体，由保藏编号为cctccno：c2012158的杂交瘤细胞株产生。本发明所述单克隆抗体的制备方法如下：用商品化的重组人活化凝血因子vii(novoseven)与等体积的弗氏完全佐剂充分混合乳化后于balb/c小鼠背部皮下多点注射，4周后取novoseven与等体积弗氏不完全佐剂混合乳化后小鼠背部皮下多点注射加强免疫一次，8周后取novoseven小鼠尾静脉注射免疫冲击，4天后取出脾脏，分离出脾脏细胞，与小鼠骨髓瘤细胞sp2/0以10:1的细胞数比例混合，离心后于细胞沉淀中加入融合剂peg1500进行融合，转入96孔板中用含1％hat的选择性培养基筛选，以后每隔2天对半换液，10-14天取细胞培养上清进行elisa检测筛选。为筛选钙离子依赖的抗fvii抗体，novoseven(1μg/ml)包被的elisa板，预先加入含/不含10mmedta的tbs，然后加入细胞培养上清，37℃孵育1小时，tbst(0.1％tween-20)洗涤5次后加入辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠igg二抗，37℃孵育1小时，tbst(0.1％tween-20)洗涤5次后加入tmb底物显色，1n硫酸终止反应，酶标仪读数od450。获得了一株在不含edta的上清结合强阳性而加入10mmedta显著抑制抗体结合的杂交瘤细胞3g3(表1、图1)。结果表明3g3抗体结合fvii依赖钙离子的存在；而另一株杂交瘤3d7在edta存在下仍能与fvii结合，说明3d7结合fvii不依赖于钙离子。进而对3g3杂交瘤细胞采用有限稀释法进行单克隆化，将3g3细胞扩大培养后冻存保种。单克隆抗体的纯化：在注射杂交瘤细胞前5-7天，预先腹腔注射pristane0.5ml/只，取3g3细胞腹腔注射，10-14天后腹腔穿刺采集小鼠腹水，37℃放置半小时后4℃放置过夜。第二天离心去除血凝块，在腹水中加入3倍体积的磷酸缓冲液，离心，上清用滤膜过滤后用proteing柱纯化。单克隆抗体的鉴定：采用roche公司的抗体亚型鉴定试纸条对3g3抗体亚型进行鉴定，结果证实3g3单克隆抗体亚型为igg1,kappa型(图2)。本发明还提供了一种杂交瘤细胞株，其保藏编号为cctccno：c2012158。本发明还提供了所述的单克隆抗体在制备用于纯化凝血因子vii的工具中的应用。在本发明的一些具体实施方案中，所述纯化为亲核层析纯化。本发明还提供了一种纯化工具，包括所述的单克隆抗体。在本发明的一些具体实施方案中，所述纯化为亲核层析纯化。本发明还提供了所述的单克隆抗体在制备用于检测凝血因子vii的检测工具中的应用。在本发明的一些具体实施方案中，所述检测工具为试剂盒、芯片或试纸。此外，本发明还提供了一种检测工具，包括所述的单克隆抗体。在本发明的一些具体实施方案中，所述检测工具为试剂盒、芯片或试纸。本发明提供了一种杂交瘤细胞株(保藏编号为cctccno：c2012158)，以及由此杂交瘤细胞株产生的单克隆抗体3g3。本发明还提供了单克隆抗体在制备用于纯化凝血因子vii的工具中的应用以及其在制备用于检测凝血因子vii的检测工具中的应用，含有该单克隆抗体的检测工具。本发明提供的单克隆抗体3g3结合fvii依赖钙离子的存在。采用roche公司的抗体亚型鉴定试纸条对3g3抗体亚型进行鉴定，结果证实3g3单克隆抗体亚型为igg1,kappa型。经过本发明提供的单克隆抗体固相化用于纯化凝血因子vii，结果表明，应用单克隆抗体3g3偶联的sepharose4b可成功纯化重组人凝血因子vii，目的蛋白分子量显示为60kda，与预期一致。用商品化的重组凝血因子fvii(novoseven)包被在生物传感芯片上，使用biacorex100蛋白相互作用系统测定3g3单克隆抗体的亲和常数。结果显示3g3抗体的亲和常数为1.3×10-9m。表明本发明提供的单克隆抗体3g3与凝血因子fvii的亲和力非常好。当本发明提供的单克隆抗体用于纯化凝血因子fvii时，由于钙离子依赖的单克隆抗体3g3可在原有样品缓冲液中加入钙离子螯合剂edta使抗原抗体分离，避免了酸洗脱带来的不利影响。生物保藏说明杂交瘤细胞株anti-f7-3g3：分类命名：杂交瘤细胞株anti-f7-3g3，于2012年11月8日保藏在中国典型培养物保藏中心(cctcc)，保藏中心地址为湖北省武昌市珞珈山武汉大学校内，保藏编号为cctccno.c2012158。附图说明为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。图1示elisa筛选钙离子依赖的抗人fvii抗体；图2示3g3抗体亚型鉴定；图3示sds-page电泳后考马斯亮蓝染色鉴定亲和层析纯化的重组凝血因子vii；nr:非还原条件；r：还原条件；图4示3g3单克隆抗体的亲和常数；其中，线1示150nm；线2示75nm；线3示37.5nm；线4示18.75nm；线5示9.375nm。具体实施方式本发明公开了一种单克隆抗体，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本
发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。本发明提供的单克隆抗体的各个具体实施方案中所用原料及试剂均可由市场购得。下面结合实施例，进一步阐述本发明：实施例1动物免疫及杂交瘤筛选用商品化的重组人活化凝血因子vii(novoseven)100μg与等体积的弗氏完全佐剂充分混合乳化后于balb/c小鼠背部皮下多点注射，4周后取100μgnovoseven与等体积弗氏不完全佐剂混合乳化后小鼠背部皮下多点注射加强免疫一次，8周后取100μgnovoseven小鼠尾静脉注射免疫冲击，4天后取出脾脏，分离出脾脏细胞，与小鼠骨髓瘤细胞sp2/0以10:1的细胞数比例混合，离心后于细胞沉淀中加入1ml融合剂peg1500进行融合，转入96孔板中用含1％hat的选择性培养基筛选，以后每隔2天对半换液，10-14天取细胞培养上清进行elisa检测筛选。为筛选钙离子依赖的抗fvii抗体，novoseven(1μg/ml)包被的elisa板，预先加入50μl含/不含10mmedta的tbs，然后加入50μl细胞培养上清，37℃孵育1小时，tbst(0.1％tween-20)洗涤5次后加入辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠igg二抗，37℃孵育1小时，tbst(0.1％tween-20)洗涤5次后加入tmb底物显色，1n硫酸终止反应，酶标仪读数od450。获得了一株在不含edta的上清结合强阳性而加入10mmedta显著抑制抗体结合的杂交瘤细胞3g3(表1、图1)，结果表明3g3抗体结合fvii依赖钙离子的存在；而另一株杂交瘤3d7在edta存在下仍能与fvii结合，说明3d7结合fvii不依赖于钙离子。进而对3g3杂交瘤细胞采用有限稀释法进行单克隆化，将3g3细胞扩大培养后冻存保种。表1edta抑制3g3抗体结合凝血因子vii组别od4503g32.1443d72.2383g3+edta0.1733d7+edta2.231实施例2抗人凝血因子vii单克隆抗体的纯化在注射杂交瘤细胞前5-7天，预先腹腔注射pristane0.5ml/只，取5×1063g3细胞腹腔注射，10-14天后腹腔穿刺采集小鼠腹水，37℃放置半小时后4℃放置过夜。第二天离心去除血凝块，在腹水中加入3倍体积的磷酸缓冲液，13000rpm离心30分钟，上清用0.4μm滤膜过滤后用proteing柱纯化。实施例3抗体亚型鉴定采用roche公司的抗体亚型鉴定试纸条对3g3抗体亚型进行鉴定，结果证实3g3单克隆抗体亚型为igg1,kappa型(图2)。实施例4抗体固相化用于纯化凝血因子vii3g3单克隆抗体偶联sepharose4b凝胶的制备：称取0.268g溴化氰活化的sepharose4b干胶，加入10ml预冷的1mm盐酸溶胀30分钟，离心后沉淀加入15ml预冷的1mm盐酸洗涤，离心，凝胶用偶联缓冲液洗涤一次，加入6mg3g3单克隆抗体，室温温和混匀反应2小时，离心，用偶联缓冲液洗游离的3g3抗体，然后用0.1mtris-hcl(ph8.0)封闭，室温反应1小时。依次用低ph洗涤缓冲液(0.1m醋酸钠，0.5m氯化钠，ph3.5)和高ph洗涤缓冲液(0.1m碳酸氢钠，0.5m氯化钠，ph8.3)洗涤，反复洗涤4次后装柱。4℃保存。亲和层析纯化重组凝血因子vii:转染重组凝血因子vii的cho细胞，转染后24小时换含10μg/ml维生素k1的无血清培养基cd-cho(invitrogen公司)，连续培养7天后，收集上清，高速离心去除不溶性颗粒，0.22μm过滤，加入3g3-sepharose4b凝胶柱中，洗涤去除未结合的杂质蛋白，目的蛋白用含10mmedta的tbs缓冲液洗脱，收集洗脱产物，每管收集2ml，共收集5管。洗脱产物加入等体积还原型上样缓冲液，煮沸5分钟后冷却，上样，经10％sds-page电泳，考马斯亮蓝染色，脱色，观察凝血因子纯化效果。结果：可见应用3g3单克隆抗体偶联的sepharose4b可成功纯化重组人凝血因子vii,目的蛋白分子量显示为60kda，与预期一致(图3)。实施例5钙离子依赖的fvii的单克隆抗体3g3亲和力测定用商品化的重组凝血因子fvii(novoseven)包被在生物传感芯片上，使用biacorex100蛋白相互作用系统测定3g3单克隆抗体的亲和常数。实验材料：cm5芯片：ge,货号br100012；runningbuffer：10mmhepes,150mmnacl,5mmedtana2,0.05％p20,ph7.4；氨基偶联试剂盒：ge，货号：2060499；样品：3g3单克隆抗体以及重组人凝血因子vii(novoseven)各1支。实验方法：1、偶联根据等电点以及按照biacorex100controlsoft的protocol优化偶联条件，斜率优化选择醋酸钠作为偶联稀释缓冲液。用此缓冲液稀释novoseven样品至25μg/ml后偶联到cm5芯片上。预设偶联水平1500ru。2、kd测试用ph7.4的runningbuffer稀释3g3单克隆抗体，稀释一系列浓度至0nm、9.375nm、18.75nm、37.5nm、75nm、150nm。设置结合时间为180s，解离时间15min，再生缓冲液用50mmgly-hcl(ph1.7)。按照biacorex100controlsoft的protocol进行上机测试。3、数据处理采用biacorex100自带分析软件进行分析。数据解读如下：ka：结合常数，反应结合快慢程度，数值越大结合越快。kd：解离常数，反应解离快慢程度，数值越小解离越慢。kd：kd＝kd/ka，亲和力常数，反应抗原抗体结合牢固程度，数值越小，亲和力越强。实验结果：1、偶联根据抗原的等电点特性以及结合斜率，最终选择ph4.5醋酸钠作为偶联稀释缓冲液。偶联水平为1500ru。2、亲和力结果：见图4。结果显示3g3抗体的亲和常数为1.3×10-9m。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本
技术领域：
的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。当前第1页12