一种酶修复等温循环放大荧光法检测沙门氏菌的方法与流程

本发明涉及一种检测方法，特别涉及循环方法荧光法检测沙门氏菌的方法。

背景技术：

沙门氏菌是一种常见的食源性致病菌，是革兰氏阴性、细胞内寄生的一种肠道菌。该菌广泛存在于自然界中，不但能引起家畜家禽及其他动物发生急性、慢性或隐性感染，而且还能通过污染食物导致人的食物中毒，对人类造成很大威胁。据统计在世界各国的种类细菌性食物中毒中，沙门氏菌引起的食物中毒常列榜首。沙门氏菌每年会导致约四万美国人病倒，约600人死亡。在我国沙门氏菌是食物中毒中最常见的致病菌，占食物中毒的第一位。沙门氏菌病的临床症状主要包括头痛、腹痛、发热等，死亡率在1 %，对人危害很大。

目前报道的检测沙门氏菌的方法包括传统的培养方法、酶联免疫法、PCR技术等。传统的沙门氏菌检测方法检测周期长达一周，工序繁琐，设备昂贵等，这远远不能满足要求。因此，食品工业急需一种快速、准确、简便、微量的分析方法，以对食品中的沙门氏菌进行检测。

技术实现要素：

为了解决以上现有技术中检测沙门氏菌的方法中特异性和灵敏度都比较低、检测周期长的问题，本发明提供了一种特异性和灵敏度高、检测速度快的基于酶修复循环放大的荧光法检测沙门氏菌的方法。

本发明还提供了基于核酸内切酶IV修复循环放大的荧光检测沙门氏菌的生物传感器的制备方法。

本发明是通过以下步骤得到的：

本发明中一共用到了4条DNA链，其序列分别是：

Trigger：5’-TCTTTTCC AAAA CGGGCATTACT-3’（SEQ ID NO:1）；

Aptamer : 5’-AGT AAT GCC CG GTAGTTATTCAAAGATGAGTA GGA AAA GA -3’（SEQ ID NO:2）；

HAP： 5’- CTTGCGCTTGAGCCCTGTGTCCCGTCATGCGAGTAATGCCC -3’（SEQ ID NO:3）；

Signal probe： 5’- （FAM）CTTGXGCTTG（Dabcyl） -3’（SEQ ID NO:4）；

其中Signal probe 的5’端修饰荧光基团FAM，3’端修饰猝灭基团Dabcyl。HAP既用作聚合酶合成DNA的模板，又可以在UDG和核酸内切酶IV的作用实现信号的放大，同时产生与Signal probe互补的D’链。HAP总共包括四部分和两个酶切位点分别是：A（黑体部分）能够与Trigger部分互补，在聚合酶作用下Trigger作引物，HAP为模板，进行DNA链的延长。B（黑体下划线部分）维持发夹的稳定和两个酶切位点。C（斜体部分）用于诱导进一步的循环放大，产生的C’与其完全互补，且C’也能够打开发夹实现另一个循环。D（斜体下划线部分）产生与Signal probe完全互补的D’， D’ 与Signal probe通过碱基互补配对形成双链，在核酸内切酶IV作用下，将Signal probe剪切成两部分，使得荧光基团（FAM）和猝灭集团（Dabcyl）分离，从而产生荧光信号。通过测量荧光强度来定量检测沙门氏菌。

本发明中沙门氏菌的检测是在均相溶液中实现的，通过Bst DNA 聚合酶、UDG和核酸内切酶IV的配合实现三循环，使得信号放大，从而实现沙门氏菌的高灵敏检测，并获得较低的检测下限。

均相中发生的反应主要有：Trigger与Aptamer进行碱基互补配对形成拱型结构。当有沙门氏菌存在时，Aptamer与沙门氏菌进行结合，这可以将拱型结构打开，同时使得Trigger释放。释放出的Trigger可以与HAP的A部分进行碱基互补配对，在Bst DNA 聚合酶和dATP、dCTP、dGTP和dUTP存在下以Trigger为引物，HAP为模板进行DNA的延伸。（注：dUTP是用于代替dTTP来产生酶切位点(AP位点)）复制的DNA模板所得的链包含两个尿嘧啶（U）,这两个尿嘧啶能够被糖基化酶（UDG）切割，产生两个碱基空位（AP位点），随后，在核酸内切酶IV的作用下进行剪切， C’和D’片段从双链中剪切下来，剩余双链部分在Bst DNA 聚合酶、UDG和核酸内切酶IV作用下实现第一次循环。此外，产生的C’能够再次打开HAP并且在聚合酶的作用下进行DNA的延伸，实现第二次循环。产生的D’与Signal probe进行碱基互补配对形成双链，核酸内切酶IV能够剪切Signal probe中间的四氢呋喃碱基位点（TAP位点）使得Signal probe断裂且与D’分开，从而产生荧光信号，分开的D’能够与其他的Signal probe再次进行碱基互补配对，实现第三次循环。通过这三次的循环实现信号的放大。

在均相反应中，拱形探针的形成反应条件均为95℃，反应时间是5 min，缓慢冷却至室温。拱形探针与目标菌孵育以及三步放大的反应温度均为37℃，反应时间是2 h。

所述的生物传感器的制备方法，包括以下步骤：

（1）拱形探针的构建；

（2）将目标菌与拱形探针加入到均相中，同时加入HAP、Signal probe、Bst DNA 聚合酶、UDG和核酸内切酶IV，37℃，孵育2 h；

所述的制备方法，具体的操作步骤如下：

（1）将灭菌水，10×的buffer缓冲液、20 μM 的Aptamer 1 μL和20 μM的Trigger 1 μL加入EP管中，在95℃下孵育5min，缓慢冷却至室温；

（2）在37℃下，向EP管中加入目标菌，向EP管中加入10μM HAP 1 μL、10 μM Signal probe 1μL、1μL Bst DNA 聚合酶、1μL UDG和1μL核酸内切酶IV，37℃，孵育2 h；

（3）将上述反应后的溶液10 μL稀释至70 μL，荧光仪激发波长设置为486nm，用荧光仪在518nm处检测荧光。

该发明的检测方式是荧光法检测，利用荧光仪。在检测之前，先将Aptamer和Trigger形成拱形探针。然后将目标菌加入到反应后的均相溶液，在37℃孵育2h，目标物与aptamer结合，释放Trigger序列，并与HAP结合，在Bst DNA 聚合酶、UDG和核酸内切酶IV 作用下完成三步放大过程，从而实现信号的放大。然后用荧光仪设置激发波长为486nm，检测518 nm处荧光强度。

本发明基于核酸适配体与目标物的特异性识别，具有链延伸功能的Bst DNA 聚合酶实现链的延伸，产生大量与Signal probe互补的D’， Bst DNA 聚合酶、UDG和核酸内切酶IV的配合的酶修复循环放大作用以及荧光基团与猝灭基团的荧光共振能量转移构建了适体生物传感器。该传感器具有检测速度快，检测限低，特异性高等优点，可以弥补沙门氏菌现有检测方法的缺陷与不足，实现对其快速，准确的定量检测。

本发明的有益效果：

1、利用了核酸适配体的特异型识别，利用适配体与沙门氏菌的结合实现了对目标物的高特异性检测；

2、利用了UDG产生核酸内切酶IV的切割位点（AP位点），实现定位切割；

3、利用酶修复循环放大功能，实现了三次循环放大，放大了荧光信号，提高了检测的灵敏度，实现对目标物沙门氏菌的超灵敏性检测；

4、该传感器的反应条件温和，反应速度快；

5、由于使用荧光法，其检测方法操作简便、检测周期短；

6、检测原理的主要过程均是在均相中实现的，提高了反应速度，降低了操作的复杂程度，实现了目标物的快速，简单，灵敏的检测；

7、制备方法简单，性能稳定，荧光检测的重复性好，适用于食品安全及水体中沙门氏菌的检测和生物传感器产业化的实际应用；

8、制作该生物传感器的工艺成本低，适用于产业化中价廉的要求。

附图说明

图1为本发明的工作原理图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明。

实施例1

所述的荧光生物传感器的制备方法，包括以下步骤：

（1）将灭菌水，10×的缓冲液（buffer），1 μL 20μM的aptamer链和Trigger链加入到预先准备好的灭菌的EP管中；震荡30s，在95℃下孵育5min，缓慢冷却至室温；

（2）向该EP管中加入1 μL目标菌（浓度分别为10⁶ cfu/mL、10⁵ cfu/mL、10⁴ cfu/mL、10³ cfu/mL、10² cfu/mL）、UDG(1 μL)、10μM HAP(1 μL)、10μM Signal probe（1 μL）、核酸内切酶IV（1 μL）、Bst DNA 聚合酶（1 μL）和dNTP（1 μL）震荡30s，放入37℃的恒温箱中孵育2 h；

（3将上述反应后的溶液（10 μL）稀释至70 μL，用荧光仪在518nm处检测荧光；

荧光仪激发波长设置为486nm，发射波长为518nm，检测范围450nm-530nm，读取荧光信号变化，检测目标物。

上述过程中用到的溶液的制备方法：

1、超纯水均需进行高温灭菌处理。具体方法是，将超纯水分别放置在锥形瓶中，然后用锡箔纸和报纸进行封口。在高压灭菌锅中在120℃的温度下灭菌20 min。

2、10×的缓冲液（buffer）及酶均为直接购买，直接使用。

检测结果如下表所示：

。

从上表可以看出，沙门氏菌浓度在10cfu mL^-1以上时，各检测浓度呈正相关，所以，其可以检测最低10cfu mL^-1的浓度的沙门氏菌。

<110>济南大学

<120>一种酶修复等温循环放大荧光法检测沙门氏菌的方法

<160>2

<210>1

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(23)

<223>引物

<400>1

TCT TTT CCA AAA CGG GCA TTA CT 23

<210>2

<211>40

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(40)

<223>引物

<400>2

AGT AAT GCC CGG TAG TTA TTC AAA GAT GAG 30

TAG GAA AAG A 40

<210>3

<211>41

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(41)

<223>引物

<400>3

CTT GCG CTT GAG CCC TGT GTC CCG TCA TGC 30

GAG TAA TGC CC 41

<210>4

<211>10

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(10)

<223>引物

<400>4

CTT GXG CTT G 10