一种猪瘟病毒E2蛋白的抗原表位模拟肽及制备方法和应用与流程

本发明属于生物
技术领域：
。更具体涉及一种猪瘟病毒E2蛋白的抗原表位模拟肽，同时还涉及一种猪瘟病毒E2蛋白的抗原表位模拟肽的制备方法，还涉及一种猪瘟病毒E2蛋白的抗原表位模拟肽的用途。
背景技术：
：猪瘟病毒(Classicalswinefevervirus，CSFV)是黄病毒科瘟病毒属成员，猪瘟病毒引起的猪瘟是目前对我国养猪业危害较为严重的一种烈性传染病，对该病进行血清学监测有助于控制猪瘟的发生，最早检测猪瘟是用间接血凝试验，需要培养病毒，制备病毒抗原，检测时还需要绵羊红细胞，过程复杂繁琐。后来研究深入后知道猪瘟E2蛋白是病毒囊膜糖蛋白，拥有较多的中和抗体表位，在免疫学诊断上有重要意义。因此E2蛋白在大肠杆菌、杆状病毒表达系统和腺病毒等重组病毒系统中得到了表达，同时这些表达的E2蛋白还被用来作为检测CSFV抗体的抗原。目前表达E2蛋白过程依然较为复杂，表达产物还需要纯化鉴定才能做为诊断抗原。随着基因工程技术和免疫学的发展，根据基因序列进而合成多肽也可以获得抗原表位，但通常都是线性表位。研究显示，蛋白质刺激机体产生抗体的表位，90％都是构象表位，仅10％为线性表位，因此，确定抗原空间构象表位对于抗原-抗体的免疫诊断具有重要意义。噬菌体展示技术是一项十九世纪初发展起来的新的基因操作技术，它将外源多肽或蛋白与噬菌体的衣壳蛋白融合表达，融合蛋白展示在病毒颗粒表面，而编码该融合蛋白的DNA则位于病毒粒子内部，使大量多肽和其DNA编码序列之间建立了直接联系，使各种靶分子(抗体、酶等)的多肽配体通过淘选得以快速鉴定。从噬菌体随机肽库中筛选抗原表位的基本原理是生物淘选，使用纯化的单克隆抗体为靶分子可以筛选出与原始序列完全相同的线性表位抗原，也能筛选出与原始序列不同但功能相似的构象表位抗原，即模拟表位抗原。技术实现要素：本发明的目的是在于提供了一种猪瘟病毒E2蛋白的抗原表位模拟肽，其特征是由12个氨基酸残基构成的短肽，序列如SEQIDNO:1：IRRRTRPIIKMR所示。编码所述的猪瘟病毒E2蛋白模拟抗原表位的核苷酸序列包括SEQIDNO:2：5′-ATACGACGTAGGACTAGGCCTATTATAAAGATGCGA-3′。该模拟肽可以被猪瘟病毒E2蛋白的单克隆抗体4A7(细胞保藏编号：CCTCCNO.C2014229)所识别。同时也可以被猪瘟阳性血清所识别。本发明的另一个目的是在于提供了一种猪瘟病毒E2蛋白的抗原表位模拟肽的制备方法，该方法优点是利用噬菌体随机肽库来筛选猪瘟E2单克隆抗体4A7识别的表位，可以筛选出与原始序列不同但功能相似的构象表位抗原，即模拟表位抗原。本发明还有一个目的是在于提供了一种猪瘟病毒E2蛋白的抗原表位模拟肽在猪瘟抗体药物检测试剂中的应用，该应用使得猪瘟抗体诊断抗原可以用普通化学合成方法制备，相比基因工程表达蛋白做为诊断抗原，合成抗原工艺简便，纯度更高。为了实现上述的目的，本发明通过以下技术措施实现。一种猪瘟病毒E2蛋白的抗原表位模拟肽的制备方法，其步骤是：A、以杆状病毒表达的猪瘟病毒E2蛋白免疫BALB/C小鼠，制备针对E2蛋白的单抗克隆抗体，经筛选鉴定获得一株具有阻断效果的单抗4A7(细胞保藏编号：CCTCCNO.C2014229)。B、将此单抗纯化并包被在酶标板上，利用NEB公司的噬菌体12肽库进行筛选，每轮筛选加大筛选压力，最后获得高亲合力的阳性克隆，C、经DNA测序并进行序列比较分析，与原猪瘟病毒E2蛋白序列并不完全一致，由此确定12肽为猪瘟病毒E2蛋白的一个空间构象表位，而非线性表位。E、利用合成肽技术将筛选得到的12个氨基酸序列进行化学合成，合成的12肽为IRRRTRPIIKMR(纯度大于95％)。此12肽具有免疫学活性可以作为包被抗原应用于猪瘟病毒抗体检测。一种猪瘟病毒E2蛋白的模拟肽在制备治疗或预防猪瘟ELSIA抗体药物检测(试剂盒)中的应用，其步骤是：1、以模拟肽序列作为参考化学合成抗原。2、以合成抗原制备试剂盒主要组分抗原包被板。3、按常规方法制备试剂盒其他组分。4、使用试剂盒检测血清中猪瘟抗体。本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果：1、本发明的合成肽抗原其序列是由针对猪瘟病毒的特定单抗筛选而来，因此其序列的空间结构与天然病毒抗原表位有相似性。2、合成肽抗原生产技术与现有的灭活病毒抗原或基因表达抗原技术相比，生产过程中不涉及菌种和毒株，工艺安全有保障，不会对环境造成污染。3、合成肽抗原与基因工程表达抗原相比，生产周期短，易纯化且纯度较高。4、本发明适合大规模的临床血清检测，反应时间短，2小时即可出结果。5、本发明试剂盒与其他病毒阳性血清无交叉反应，敏感性高，特异性好。6、本发明试剂盒操作简便，与猪瘟正向间接血凝试剂盒符合率高达94％。附图说明图1为一种单抗4A7提纯后SDS-PAGE(12％)电泳图。由图中可以看出单抗纯化后仅仅只有2条带(一条重链带约50kD。一条轻链带约27kD)，而无其他杂带，说明抗体纯化效果良好。图2为一种噬菌体克隆ELSIA检测示意图。图中显示大部分噬菌体克隆都与单抗4A7有反应，而与BSA反应很弱，其中有6个克隆(#4，#5，#7，#8，#13，#14)反应的A差值较大(>0.6),因此这6个噬菌体为强阳性克隆。图3为一种阳性噬菌体竞争抑制试验示意图。该图说明E2蛋白和噬菌体阳性克隆可以竞争结合单抗4A7。说明噬菌体阳性克隆具有E2蛋白相似的抗原表位。具体实施方式实施例1：一种猪瘟病毒E2蛋白的抗原表位模拟肽的制备方法，其步骤是：A、E2单抗的纯化与鉴定：采用辛酸-硫酸铵法(金伯泉，细胞和分子免疫学技术。西安：第四军医大学出版社，2002)纯化4A7单抗(杂交瘤细胞4A7的保藏编号：CCTCCNO.C2014229，2014年保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心)，并通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴定纯化效果，具体步骤稍许改动，方法如下：向一份预处理过的腹水中加入四份0.06mol/L(pH＝5.0)的乙酸缓冲液，用0.1mol/L的盐酸调pH值至4.5。再在室温(15℃～25℃，以下相同)下缓慢加入原腹水体积3.3％的辛酸，边滴加边搅拌。30分钟后以12000r/min离心10分钟，取上清，滤纸过滤后，调pH值至7.4，然后边搅拌边缓慢加入饱和硫酸铵至终浓度为45％，搅拌30分钟后12000r/min离心10分钟，弃上清，沉淀用原腹水体积的10mmol/LTris-HCl(pH＝9.0)溶解后再在10mmol/LTris-HCl缓冲液中透析16小时，取出后经SDS-PAGE鉴定纯度(见图1)。B、噬菌体12肽库筛选：M13噬菌体12肽库(Ph.D.-12TMPhageDisplayPeptideLibraryKit)购自NewEnglandBiolabs公司。筛选方法：将纯化的4A7单抗用包被液(pH9.6的碳酸盐缓冲液)稀释成100μg/mL包被在酶标板上，每孔100μL，4℃过夜，次日倾去包被液，加200μL含1％(m/v)BSA的封闭液，37℃封闭2h。倾去封闭液，用TBST洗涤3次后，每孔加入用TBS稀释的噬菌体随机12肽库100μL(约含2×1011个噬菌体)，室温孵育1小时，倒掉液体，用含0.1％(v/v)Tween20的TBST缓冲液洗涤10次，用100μL洗脱液(pH2.2甘氨酸缓冲液)洗下特异性结合的噬菌体，取10μL进行噬菌体滴度测定，其余转入20mL新鲜菌液E.coliER2738(OD600为0.5左右)进行扩增。37℃扩增4小时后，10000rpm离心10min，取上清重复离心一次，取80％上清至50mL离心管中，加入1/6体积的聚乙二醇/氯化钠，4℃沉淀过夜。次日10000r/min离心15min，取沉淀，用1mLTBS悬浮，转到1.5mL离心管中，离心5min去掉未溶的残渣，将上清转至一新管中，即为扩增产物。扩增产物经梯度稀释滴定后投入下一轮筛选，后面2轮筛选时，单抗包被浓度分别为50μg/mL和25μg/mL，同时漂洗液中Tween20的浓度分别为0.3％(v/v)和0.5％(v/v)。C、噬菌体滴度的测定：每轮筛选必须对投入和洗脱下来的噬菌体进行滴度测定，计算产率，将待测噬菌体做10倍系列稀释(101～1012)，取10μL稀释后的待测噬菌体悬液，加到200μL含有大肠杆菌ER2738(来源于M13噬菌体12肽库)(OD为0.2～0.4)的LB培养基中，孵育1-5分钟，转移到3mL预热的45℃顶层琼脂中，混匀后，立即均匀铺于含5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D半乳糖苷(X-gal)和异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)的底层LB琼脂板上。室温冷却5min,倒置培养于37℃恒温生化培养箱过夜。计数蓝色克隆数并计算噬菌体滴度。产率计算公式为：产率＝洗出噬菌体数/投入噬菌体数。随着淘筛的进行，洗脱下来的噬菌体抗体亲和力越来越高，产率也逐渐升高。说明阳性噬菌体克隆得到富集(表1)。表1三轮筛选对噬菌体的富集轮数加入物洗脱物产出率第一轮2.04×10112.32×1021.14×10-9第二轮1.98×10116.52×1053.29×10-6第三轮1.95×10116.13×1073.14×10-4D、噬菌体阳性克隆检测：1、在第3轮筛选得到的噬菌体克隆中，随机挑选15个蓝色噬菌体克隆分别感染大肠杆菌ER2738，扩增噬菌体，直接ELSIA检测每个噬菌体和4A7单抗结合的能力，BSA为阴性对照，结果显示大部分噬菌体克隆都与单抗4A7有反应，而与BSA反应很弱(见图2)，其中有6个克隆(#4，#5，#7，#8，#13，#14)反应的A差值较大(>0.6),因此将这6个噬菌体克隆测序。获得12个氨基酸残基构成的短肽，12个氨基酸残基构成的短肽，其氨基酸序列如SEQIDNO:1所示。SEQIDNO:1：IRRRTRPIIKMR和其编码的核苷酸序列:SEQIDNO:2：5`-ATACGACGTAGGACTAGGCCTATTATAAAGATGCA-3`。2、阳性噬菌体克隆DNA序列测定用噬菌体gⅢ基因-96引物对第三轮淘筛的6个阳性噬菌体进行测序，并将测序结果翻译为氨基酸序列。测序结果显示，阳性噬菌体中获得同一种核酸序列：ATACGACGTAGGACTAGGCCTATTATAAAGATGCGA(SEQIDNO:2)。其编码的氨基酸序列为IRRRTRPIIKMR(SEQIDNO:1)。经过与猪瘟E2序列进行对比，未发现有一致序列，说明该表位肽为猪瘟E2蛋白上的一个空间构象表位，而非线性表位。3、阳性噬菌体克隆竞争抑制试验：将猪瘟E2单抗4A7(100μg/mL)包被于96孔酶标板，4度过夜，1％BSA封闭。取阳性噬菌体扩增液上清与不同稀释倍数的E2蛋白等体积混合，加入酶标板中37℃孵育1小时，TBST漂洗3次，加入HRP标记的鼠抗M13单抗，37℃孵育1小时，漂洗后加底物显色10min，终止反应，酶标仪检测OD630读值。按如下公式计算竞争抑制率：[(A1-A2)/A1]×100％，A1为未加抑制物竞争时的A630，A2为有抑制物竞争时的A630。结果如图3。实施例2：一种猪瘟病毒E2蛋白的模拟肽在制备治疗或预防猪瘟ELSIA抗体药物检测(试剂盒)中的应用，其步骤是：A、猪瘟ELISA抗体检测试剂盒中的抗原包被板制备：根据本发明SEQIDNO:1所示的12肽序列和本领域中常规的化学合成方法，制备纯度大于95％的短肽，此短肽即为检测抗原。将此抗原用碳酸盐缓冲液溶解并稀释至2μg/mL，然后按每孔100μL加入到96孔酶标板中，4℃放置过夜，使抗原吸附在酶标板中。第二天弃去孔中液体，每孔再加入150μL磷酸盐缓冲液(含0.5％BSA)，置37℃温箱中2小时、弃去孔中液体。拍干。B、猪瘟ELISA抗体检测试剂盒其他组分制备：试剂盒其他组分还包含酶标记物、样品稀释液、阳性对照、阴性对照、显色液A、显色液B、洗涤液和终止液。酶标记物为羊抗猪二抗，样品稀释液为磷酸盐缓冲液，阳性对照为猪瘟疫苗免疫的猪阳性对照血清，阴性对照为未免疫猪瘟疫苗的健康猪阴性血清。洗涤液为含有0.05％Tween-20的PBS缓冲液；显色液A为含有50mg/mL过氧化氢脲的柠檬酸盐缓冲液，显色液B液为含有0.2mg/mLTMBpH5.0的柠檬酸/柠檬酸钠缓冲液。终止液为含0.25％体积比氢氟酸溶液。C、猪瘟ELISA抗体检测试剂盒操作步骤：1)从试剂盒中取出预包被有抗原的检测板，将稀释好的待检血清(1:40稀释)100μL加入抗原包被板中，同时设阴、阳性对照孔，各设2孔，每孔100μL。2)轻轻振匀孔中样品，置37℃温育60分钟。甩掉板孔中的溶液，加洗涤液200μL/孔，洗板5次，最后一次在吸水纸上拍干。3)每孔加酶标记物100μL，置37℃温育30分钟。洗涤5次,方法同步骤2。4)每孔加显色液A、显色液B各50μL，混匀，室温(18～26℃)避光显色10分钟。每孔加终止液50μL，10分钟内用酶标仪测定每孔OD630nm读值。本发明试剂盒判定标准为：试验成立条件是阴性对照孔平均OD630nm值与阳性对照孔平均OD630nm值之差大于或等于0.5。S＝样品孔OD630nm值，N＝阴性对照孔平均OD630nm值。若S/N比值大于2.1，样品判为猪瘟抗体阳性。若S/N比值小于或等于2.1，样品判为猪瘟抗体阴性。D、猪瘟ELSIA抗体检测试剂盒的应用：1、特异性试验用猪瘟ELISA抗体检测试剂盒检测猪伪狂犬病、猪瘟、猪口蹄疫(O型)、猪细小病毒、猪流感和猪繁殖与呼吸综合征等标准阳性血清和猪瘟阴性血清，除猪瘟标准阳性血清的的S/N值显著大于2.1外，其余血清S/N值均小于2.1，符合阴性血清的判定标准，表明这种方法的特异性良好。表1血清特异性检测2、敏感性的检测用试剂盒检测不同稀释度的猪瘟阳性血清，从表2中可以看出即使640倍稀释的猪瘟阳性血清，依然检测为阳性，说明试剂盒的敏感性很高。表2血清敏感性检测3、符合率试验用两种检测试剂盒检测来自临床的90份血清，结果见表3。从表中可以看出，两种试剂盒总符合率为94％。表3自制猪瘟ELISA抗体检测试剂盒与猪瘟正向间接血凝抗体检测试剂盒比较SEQUENCELISTING<110>人ǰɷ޹˾<120>һE2׵ĿԭλģļӦ<130>һE2׵ĿԭλģļӦ<160>2<170>PatentInversion3.1<210>1<211>12<212>PRT<213>˹<400>1IleArgArgArgThrArgProIleIleLysMetArg1510<210>2<211>36<212>DNA<213>˹<400>2atacgacgtaggactaggcctattataaagatgcga36当前第1页1 2 3