本发明属于细胞免疫治疗
技术领域：
，具体涉及一种中药成分人参皂苷Rg3在诱导CIK细胞体外培养中的应用。
背景技术：
：免疫杀伤细胞治疗是一种新的肿瘤细胞治疗技术，是对传统的肿瘤治疗手段的有力补充，如：手术、化疗、放疗等。免疫杀伤细胞治疗对于消除残留的肿瘤病灶、促进患者免疫系统的再建具有良好的效果，并逐步成为化学治疗和造血干细胞移植后清除残留肿瘤细胞的重要治疗手段。细胞因子的诱导杀伤细胞(cytokineinducedkiller，CIK)是应用最为广泛的免疫细胞之一，其克服了以往免疫治疗细胞在体外扩增难、对抗肿瘤细胞的毒性弱和可能潜在的致癌性等缺陷。用于过继免疫治疗的CIK细胞是以CD3+CD56+、CD3+CD8+为主的异质性细胞群。CD3+CD56+细胞又称为自然杀伤细胞(naturalkillercell，NK)；CD3+CD8+细胞又称为细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxiclymphocyte，CTL)。其中，CD3+CD8+细胞群在肿瘤杀伤过程中发挥重要作用。传统的CIK体外诱导扩增方法是通过抗CD3单克隆抗体诱导，为了实现CIK细胞在体外更好的增殖，本发明提供了一种新的细胞培养方法，此方法很好的将传统中药与先进的免疫细胞培养治疗技术相结合。人身皂苷Rg3是从人参中提取出的一种中药成分，为二醇类四环三萜皂苷，Rg3具有较好的抑制肿瘤细胞、抵抗肿瘤细胞转移作用。小剂量的服用人参皂苷Rg3就可以发挥抑制肿瘤细胞血管生成的作用，因此人参皂苷Rg3适合预防肿瘤发生和肿瘤的复发、转移，并且无其它抗癌药常见的毒副作用，完全可以长期使用。大剂量的Rg3通过抑制肿瘤血管内皮生长因子(VEGF)的产生，抑制肿瘤细胞黏附、浸润、穿越血管，进而抑制转移灶生长，形成对残余癌细胞围剿之势，阻止癌细胞卷土重来。另外，特别在肿瘤患者手术后、放化疗后的康复上有积极作用，能减轻放疗、化疗的毒副反应，提高自身免疫力，使NK细胞、T细胞亚群数量提高，并对化疗引起的白细胞下降有保护作用。临床实验证实人参皂苷Rg3作用于肿瘤细胞有丝分裂G2期，可有效抑制肿瘤细胞有丝分裂前期蛋白质和ATP的合成，使肿瘤细胞增殖速度减慢，进而有效抑制肺癌、肝癌、胃癌、肠癌、乳腺癌生长,明显改善临床症状、提高生存质量、预防和治疗癌症、改善心脏血管功能、抗血小板凝集、保护脑神经细胞、提高机体免疫力。人参皂苷Rg3可以有效作用于全身，阻断肿瘤生长，扩散，防转移防复发，迅速提高免疫力，增效减毒，止痛防脱发等等。技术实现要素：为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种中药成分人参皂苷Rg3在诱导CIK细胞体外培养中的应用。本发明的另一目的在于提供一种中药成分诱导的CIK细胞体外培养方法。通过在培养基中添加一种新的有效成分人参皂苷Rg3，与传统的有丝分裂原抗CD3单克隆抗体共同诱导CIK细胞的体外扩增，该种方法细胞扩增倍数大，CIK细胞表型表达比例高，成本低廉，稳定性好。本发明的目的通过下述技术方案实现：本发明的目的在于提供中药成分人参皂苷Rg3在诱导CIK细胞体外培养中的应用。一种中药成分诱导的CIK细胞体外培养方法，包括如下步骤：从脐血中分离脐血单个核细胞，采用将抗CD3单克隆抗体与人参皂苷Rg3先后依次诱导的方式进行诱导培养。所述的分离脐血单个核细胞的方法为密度梯度离心法，具体包括如下步骤：①取新鲜的脐血，按照1:5(羟乙基淀粉体积：脐血体积)的比例加入羟乙基淀粉；②羟乙基淀粉和脐血混合均匀后静置10min，用水平离心机离心，温度20℃，离心力50g，离心时间8min。③用巴氏吸管吸取血浆层，加入适量培养基继续离心，温度20℃，离心力400g，离心时间10min。④离心完毕收集细胞沉淀，加入适量培养基重悬。⑤取适量淋巴细胞分离液加入新的离心管中，用巴氏吸管吸取细胞悬液，缓慢叠加到分离液面上。⑥小心水平放入离心机离心，设定温度20℃，离心力500g，离心时间25min。⑦离心完毕用巴氏吸管吸取白膜层，生理盐水洗涤两次，温度20℃，离心力200g，离心时间8min；即获得脐血单个核细胞。所述的诱导培养，包括如下步骤：将分离的脐血单个核细胞进行细胞计数，用基本培养基按1×106个细胞/mL接种到6孔细胞培养板中，再加入IFN-γ，恒温培养，加入抗CD3单克隆抗体及IL-2，连续培养，细胞全量换液，同时加入含有人参皂苷Rg3的诱导培养基继续进行细胞培养；隔天进行半量换液，培养3天后将细胞转移至T25培养瓶，培养7天后将细胞转移至T75培养瓶，体外共培养12～21天，培养的第7天与第14天分别取适量细胞进行细胞计数与流式细胞检测。所述的基本培养基为RPMI-1640培养基+10％血浆+2mmol/L谷氨酰胺；所述的IFN-γ的浓度为1000U/mL；所述的恒温培养的条件为置于体积浓度为5％的CO2，37℃的恒温条件下恒温培养24～36小时；所述的抗CD3单克隆抗体的浓度为50ng/mL；所述的IL-2的浓度为1000U/mL；所述的连续培养的时间为24～36小时；所述的含有人参皂苷Rg3的诱导培养基中人参皂苷Rg3的浓度为0.5～2μg/mL；最优浓度为2μg/mL。所述的含有人参皂苷Rg3的诱导培养基为基本培养基+0.5～2μg/mL人参皂苷Rg3+1000U/mLIL-2；优选为基本培养基+2μg/mL人参皂苷Rg3+1000U/mLIL-2。本发明相对于现有技术，具有如下的优点及效果：首先，本发明首次在CIK的诱导培养体系中引入人参的中药成分提取物人参皂苷Rg3。其次，人参皂苷Rg3对CIK细胞的二次诱导活化显著的提高了CIK体外扩增的增殖倍数，以及CD3+CD8+表型的细胞比例增加明显，增强了细胞抗肿瘤的能力。最后，人参皂苷Rg3本身就是一种很好的抗癌剂，无毒副作用，利用人参皂苷Rg3诱导的CIK细胞培养体系中本身就含有适量的人参皂苷Rg3存在，因此可以在CIK原有杀伤肿瘤能力的基础上进一步发挥抗击肿瘤的作用。附图说明图1是人参皂苷Rg3-CIK细胞培养14天时形态图。具体实施方式下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。实施例1用羟乙基淀粉和Ficoll密度梯度分离人脐血单个核细胞(具体包括如下步骤：①取新鲜的脐血，按照1:5(羟乙基淀粉体积：脐血体积)的比例加入羟乙基淀粉；②羟乙基淀粉和脐血混合均匀后静置10min，用水平离心机离心，温度20℃，离心力50g，离心时间8min。③用巴氏吸管吸取血浆层，加入适量培养基继续离心，温度20℃，离心力400g，离心时间10min。④离心完毕收集细胞沉淀，加入适量培养基重悬。⑤取适量淋巴细胞分离液加入新的离心管中，用巴氏吸管吸取细胞悬液，缓慢叠加到分离液面上。⑥小心水平放入离心机离心，设定温度20℃，离心力500g，离心时间25min。⑦离心完毕用巴氏吸管吸取白膜层，生理盐水洗涤两次，温度20℃，离心力200g，离心时间8min；即获得脐血单个核细胞)，用完全RPMI-1640培养基(购自GBICO公司)重悬细胞，培养基中添加10％自体脐血浆和2mmol/L谷氨酰胺。将分离的单个核细胞按照1×106密度接种到6孔细胞培养板中，体积为1mL。第一天加入1000U/mLIFN-γ，放置于37℃、5％CO2培养箱内培养36小时后，加入1000U/mLIL-2，50ng/mL抗CD3单克隆抗体(购自Peprotech公司)，连续培养36小时后，细胞进行全量换液，同时加入含有人参皂苷Rg3的诱导培养基(基本培养基+1000U/mLIL-2+2μg/mL人参皂苷Rg3(购自SIGMA公司)；所述的基本培养基为RPMI-1640培养基+10％血浆+2mmol/L谷氨酰胺)。根据细胞的生长状态，隔天进行半量换液或者补液，培养3天后将细胞转移至T25培养瓶，培养7天后将细胞转移至T75培养瓶，体外共培养14天，细胞状态如图1所示，收集细胞。本实验重复3次。三次实验在细胞培养第7天和第14天时，分别取适量细胞用流式细胞仪分析细胞表型，统计结果显示，CD3+CD56+T细胞纯度平均值为24.96％，CD3+CD8+T细胞平均占67.35％。细胞计数仪计数第14天结果计算CD3+CD8+T细胞平均增殖106.40倍。第14天时，CIK组与Rg3-CIK细胞免疫表型表达比例的结果见表1；CIK组与Rg3-CIK组细胞增殖倍数的结果见表2。表1CIK组与Rg3-CIK细胞免疫表型表达比例，以【均值(mean)±标准差(S)】％表示细胞表型CD3+CD8+CD3+CD56+CIK61.66±2.2824.82±3.49Rg3-CIK67.35±2.42*24.96±1.38P值0.0410.952*表示P<0.05有显著性差异。表2CIK组与Rg3-CIK组细胞增殖倍数，以【均值(mean)±标准差(S)】表示细胞分组细胞倍数(mean±S)CIK82.53±3.74Rg3-CIK106.40±2.57*P值0.0005*表示P<0.05有显著性差异。上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。当前第1页1 2 3