技术领域本发明涉及分子标记技术领域，特别涉及引物组的应用、利用该引物组进行棉花种质资源遗传多样性分析的方法。
背景技术：
分子标记是以个体间遗传物质内核苷酸序列变异为基础的遗传标记，是DNA水平遗传多态性的直接的反映，能稳定遗传，可反映生物的个体和群体特征。与其它几种遗传标记——形态学标记、生物化学标记、细胞学标记相比，DNA分子标记具有的优点是：大多数分子标记为共显性，对隐性性状的选择十分便利；基因组变异极其丰富，分子标记的数量几乎是无限的；在生物发育的不同阶段，不同组织的DNA都可用于标记分析；分子标记揭示来自DNA的变异；表现为中性，不影响目标性状的表达，与不良性状无连锁；检测手段简单、迅速。分子标记是检测种质资源遗传多样性的有效工具,分子标记技术不仅能够检测物种内的遗传多样性,而且可以对物种间的遗传多样性进行比较。因此利用分子标记进行检测,选育出具有外源目标性状基因、尽可能不带或少带不利基因、且遗传达到平衡的新种质,对现代作物改良将是十分重要的。SSR(Simplesequencerepeat，简称SSR)也叫微卫星DNA，是建立在PCR基础上的第二代分子标记。SSR标记的多态性主要依赖于基本单元重复次数的变异，而这种变异在生物群体中是大量存在的。与其它标记相比，SSR标记数量丰富，覆盖整个基因组，揭示的多态性高；具有复等位基因的特性，提供的信息量大，操作简便，重复性好，因此已广泛应用于、基因组作图、基因定位、物种亲缘关系鉴别、基因库构建、基因克隆等方面。SSR在棉花基因组中的分布是十分广泛的。SSR分子标记技术在棉花种质资源的鉴定上具有非常广阔的应用前景。亚洲棉(G.arboreumL.)产于印度次大陆,由于它在亚洲最早栽培和传播,故称亚洲棉。亚洲棉在我国栽培历史悠久,分布广阔,经自然和人工选择，已形成了具有中国特色的种系和类型,也称之为中棉，其种质资源丰富多样。中国亚洲棉在我国和世界棉花基因库中占有重要地位。亚洲棉具有早熟、抗病虫、耐瘠薄、烂铃少、产量稳定、纤维强力高、弹性强、栽培管理较为简便等优点,因此存在较大的直接利用的潜力。有效发掘利用亚洲棉优异种质资源,对我国棉花育种具有重要意义目前，genecotton中收录了78,340对棉花SSR引物，这些引物具有多态性高、重复性好、耗时少和成本低等优点，可以作为种质鉴定的优选引物。本发明利用197份有代表性的亚洲棉种质资源材料，从genecotton数据库中筛选出了62对条带清晰，多态性高，扩增效果好的SSR引物，旨在为亚洲棉进行分子水平的遗传多样性研究，核心种质构建，为有效发掘利用亚洲棉优异种质资源提供依据。
技术实现要素：
有鉴于此，本发明提供引物组的应用、利用该引物组进行棉花种质资源遗传多样性分析的方法。本发明的目的在于提供一组适合亚洲棉种质资源鉴定，遗传多样性分析的核心引物及试验方法，并为同类研究提供方便。为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：本发明提供了选自具有如下所示的核苷酸序列的引物组在陆地棉种质资源鉴定中的应用；本发明还提供了所述的引物组在棉花种质资源遗传多样性分析中的应用。本发明还提供了一种棉花种质资源遗传多样性分析的方法，包括如下步骤：步骤1：提取获得样品的总DNA；步骤2：以步骤1获得的总DNA为模板，以如权利要求1所述的引物组进行扩增，电泳检测，显色，进行多态性统计分析。在本发明的一些具体实施方案中，所述多态性统计分析为按0，1进行统计，用Jaccard系数计算成对品种间遗传相似性，在遗传相似系数基础上利用非加权平均UPGMA法对所有供试材料建立树状图，相似系数和聚类分析用PowemarkerV3.25软件完成。在本发明的一些具体实施方案中，步骤2中所述扩增的10μL反应体系包括10×PCR(含20mMMg2+)1μL，dNTP(10mM)0.2μL，Taq酶(2.5U/μL)0.2μL，去离子无菌水6.1μL，上游引物(5μM)0.75μL，下游引物(5μM)0.75PowemarkerV3.25，模板DNA(50ng/μL)1μL。在本发明的一些具体实施方案中，步骤2中所述扩增的反应程序为95℃变性2min；94℃变性40s，57℃退火45s，72℃延伸60s，共30个循环；72℃延伸7min。在本发明的一些具体实施方案中，步骤1中所述提取为：取棉花叶片针叶一片，放入2mL离心管中，同时装入一粒钢珠，放在液氮里冷冻0.5h；取出离心管放入研磨仪中研磨2次，每次30S；研磨后取出钢珠，加700μL60℃水浴预热的提取液；60℃水浴40-60min,每10min摇动离心管；取出离心管，加入等体积的氯仿-异戊醇混合物，氯仿与异戊醇的体积比为24：1，混合；12,000g，离心10min；取上清，置于2ml离心管，加等体积的氯仿-异戊醇混合物，氯仿与异戊醇的体积比为24：1；混合；12,000g，离心10min；取上清，置于2ml离心管，加0.6倍体积的异丙醇；缓慢颠倒离心管，直至有絮状沉淀，静置10min；倒去上清或钩出DNA到1.5mL的离心管中，用70％乙醇洗2～3次，无水乙醇洗一次，真空干燥；加500uLTE溶解DNA，保存于-20℃冰箱备用。在本发明的一些具体实施方案中，所述电泳检测为：8％的聚丙烯酰胺凝胶，具体为：配制凝胶，丙烯酰胺∶甲叉双丙烯酰胺(Acr:Bis30)6.7mL，5×TBE5mL，去离子水(dH2O)13.25mL，10％AP(10％过硫酸铵350μL，四甲基乙二胺(TEMED)11μL；电泳1h。在本发明的一些具体实施方案中，所述显色为取电泳后的胶放在乙酸和无水乙醇及纯水配制的固定液里固定7-8min，用硝酸银渗透液渗透10min；水洗两次后放在含有氢氧化钠、甲醛的显色液里显色，直到胶出现棕色带为止，放在含有无水碳酸钠溶液中终止。本发明具有如下的优点：本发明公开了62对棉花核心SSR引物，平均分配在13条染色体上，这些引物多态性好，条带清晰，可以直接用于亚洲棉品种资源的鉴定，遗传多样性分析，省去了通常的实验过程中SSR引物的筛选过程，提高了实验效率。本发明公开的利用62对SSR核心引物鉴定亚洲棉种质资源的方法，实验操作简单，结果好，能有效地区别不同来源背景的亚洲棉种质资源材料，是一种值得推崇的种质资源鉴定的方法。附图说明为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。图1示24个代表材料对引物NAU5233和NAU5351的筛选结果；其中，1-24分别是材料：贵池小籽棉白籽，凤阳中棉，皖贵池乌籽，广西富钟中棉，广西左县中棉，安龙小花，完县紫秸小白花，石系亚1号，商丘小白花，华中紫秆中棉，江苏常熟龙种1，小白花，泗阳仓集青茎中棉，太仓白籽(浏)，莲花中棉，铁木赤，赤木黑种，山东济阳小棉，景洪中棉，平湖小种灰籽，褐子中棉，平果黎明中棉，中印杂交棉4，白密拉黄花黑籽；图2示引物NAU2026对197个材料其中的1～48号材料的扩增图；1-48号泳道分别对应1-48号材料(材料名称见附表3，Marker同图1)；图3示是引物NAU2026对197个材料其中的49～96号材料的扩增图；1-48号泳道分别对应49-96号材料(材料名称见附表3，Marker同图1)；图4示引物NAU2026对197个材料其中的97～144号材料的扩增图；1-48号泳道分别对应97-144号材料(材料名称见附表3，Marker同图1)图5示引物NAU2026对197个材料其中的145～192号材料的扩增图；1-48号泳道分别对应145-192号材料(材料名称见附表3，Marker同图1)；图6示示引物NAU2026对197个材料其中的193～197号材料的扩增图；1-5号泳道分别对应193-197号材料(材料名称见表3，Marker同图1)；图7示197份亚洲棉材料的亲缘关系聚类图；图8示无多态性引物MON_CGR5118和MON_CGR5127对表2中24个筛引物材料的扩增效果图；图9示表2中24个材料筛选引物，扩增无多态性且效果不好的引物MON_CGR5426和MON_CGR5429示意图。具体实施方式本发明公开了引物组的应用、利用该引物组进行棉花种质资源遗传多样性分析的方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。本发明提供了亚洲棉种质资源鉴定的核心引物。所述的62对SSR引物其序列及染色体位置信息见表1。本发明还提供了所述的62对SSR引物在棉花种质资源鉴定中的应用所述的62对SSR引物在棉花种质资源遗传多样性分析的方法，包括如下步骤：(1)DNA提取利用改良的CTAB法，提取样品的总DNA。(2)引物扩增和电泳以步骤(1)提取的DNA模板，利用所述的引物进行PCR扩增，将步骤(2)的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，然后银染显色，最后进行多态性统计分析。(3)数据按0，1进行统计，用Jaccard系数计算成对品种间遗传相似性，在遗传相似系数基础上利用非加权平均UPGMA法对所有供试材料建立树状图，相似系数和聚类分析用PowemarkerV3.25软件完成。(4)所述的引物是从genecotton数据库(http://genecotton.com/),中，根据引物的染色体的位置，挑选出来，然后用197份亚洲棉种质资源材料中的24个代表性的品种筛选出来。SSR引物进行棉花种质资源鉴定的方法，其特征是所述方法包括如下步骤：DNA的提取：1.取棉花叶片针叶一片，放入2mL离心管中，同时装入一粒钢珠，放在液氮里冷冻半个小时；2.用漏勺取出离心管放入研磨仪中研磨2次，每次30S；3.研磨后取出钢珠加700ul提取液(60℃水浴预热)；4.60℃水浴40-60分钟(此过程中，每10分钟摇动离心管)；5.取出离心管，加入等体积氯仿：异戊醇(24：1)，缓慢混匀(翻转离心管约50次)；6.放入离心机，12,000g，离心10分钟；7.取上清，置于2ml离心管，加等体积氯仿：异戊醇(24：1)。重复5、6步骤；8.取上清，置于2ml离心管，加0.6倍体积的冰冷异丙醇；9.缓慢颠倒离心管，直至有絮状沉淀，静置10分钟。10.倒去上清(或钩出DNA到1.5ml的离心管中)，用70％乙醇洗2-3次，无水乙醇洗一次，真空干燥11.加500uLTE溶解DNA，保存于-20℃冰箱备用。所述步骤(2)的10μlPCR反应体系：10×PCR(含20mMMg2+)1μl，dNTP(10mM)0.2μl，Taq酶(2.5U/μl)0.2μl，去离子无菌水6.1μl，F.P.(5μM)0.75μl，R.P.(5μM)0.75μl，模板DNA(50ng/μl)1μl.所述步骤(2)的PCR反应程序：95℃变性2分钟；94℃变性40秒，57℃退火45秒，72℃延伸60秒，共30个循环；72℃延伸7分钟。所述步骤(2)的电泳检测为：8％的聚丙烯酰胺凝胶。具体顺序为：配制凝胶，丙烯酰胺∶甲叉双丙烯酰胺(Acr:Bis30)6.7ml，5×TBE5ml，去离子水(dH2O)13.25ml，10％AP(10％过硫酸铵350μl，四甲基乙二胺(TEMED)11μl。安装好电泳槽玻璃，灌胶，待胶凝固后，拔下梳子，灌胶，电泳1个小时。所述步骤(2)的染色过程：1：放在乙酸和无水乙醇及纯水配制的固定液里固定7-8分钟，然后用硝酸银渗透液渗透10分钟；纯水水洗两次后放在含有氢氧化钠、甲醛的显色液里显色，直到胶出现棕色带为止，最后放在含有无水碳酸钠溶液中终止。把染好的胶放在观片灯上照相，按有带记为1,无带记为0进行统计。本发明具有如下的优点：本发明公开了62对棉花核心SSR引物，平均分配在13条染色体上，这些引物多态性好，条带清晰，可以直接用于亚洲棉品种资源的鉴定，遗传多样性分析，省去了通常的实验过程中SSR引物的筛选过程，提高了实验效率。本发明公开的利用62对SSR核心引物鉴定亚洲棉种质资源的方法，实验操作简单，结果好，能有效地区别不同来源背景的亚洲棉种质资源材料，是一种值得推崇的种质资源鉴定的方法。本发明提供的引物组的应用、利用该引物组进行棉花种质资源遗传多样性分析的方法中所用原料及试剂均可由市场购得。下面结合实施例，进一步阐述本发明：实施例1197份亚洲棉种质资源的遗传多样性分析，具体步骤如下:从国家棉花种质中期库中根据品种来源及表型特征挑选197份亚洲棉种质，作为实验材料。用24个代表性的材料筛选本实验室的7500对SSR引物。最后筛选到62对条带清晰，易于统计的多态性的SSR引物。用上述62对引物，对上述197份亚洲棉种质，进行扩增，电泳并银染。扩增的PCR反应程序：95℃变性2分钟；94℃变性40秒，57℃退火45秒，72℃延伸60秒，共30个循环；72℃延伸7分钟。电泳的方法：8％的聚丙烯酰胺凝胶。具体顺序为：配制凝胶，丙烯酰胺∶甲叉双丙烯酰胺(Acr:Bis30)6.7ml，5×TBE5ml，去离子水(dH2O)13.25ml，10％AP(10％过硫酸铵350μl，四甲基乙二胺(TEMED)11μl。安装好电泳槽玻璃，灌胶，待胶。凝固后，拔下梳子，灌胶，电泳1个小时。染色过程：1：放在乙酸和无水乙醇及纯水配制的固定液里固定7-8分钟，然后用硝酸银渗透液渗透10分钟；纯水水洗两次后放在含有氢氧化钠、甲醛的显色液里显色，直到胶出现棕色带为止，最后放在含有无水碳酸钠溶液中终止。数据统计：数据按0，1进行统计，用Jaccard系数计算成对品种间遗传相似性，在遗传相似系数基础上利用非加权平均UPGMA法对所有供试材料建立树状图，相似系数和聚类分析用PowemarkerV3.25软件完成。结果如下：利用PopGen3.2对62对引物的扩增结果进行分析，62对具有多态性位点的SSR引物在197份亚洲棉材料中共扩增出218个等位基因，其中多态性等位基因数178个，占81.7％。每对引物等位基因变幅是2～5个，平均为2.6个，位点多态性信息量(PIC)的变化范围为0.17～0.79，ShannonPIC值平均为0.633。说明所选用的62对SSR引物在197份亚洲棉中具有较高水平的多态性。采用PowermarkerV3.25对197个陆地棉品种进行UPGMA聚类分析，(见图7)结果，在阈值为0.17时197份亚洲棉可聚为3大类。第一类包含有78份亚洲棉材料，第一类可以进一步细分为两个亚类，分别包含有37和41份亚洲棉材料；第二类包含有77份亚洲棉材料，第二类可以进一步细分为三个亚类，分别包含有26、33和18份亚洲棉材料；第三类包含有42份亚洲棉材料。从聚类结果看，SSR类群和地理来源没有必然关系，每一类群来源不一定相同，有的甚至较为分散，这与亚洲棉的广泛引种与传播有关，也说明各棉区多样性都很丰富；但从小的类群或类群间来看，来源同一棉区的种质还是趋于聚在一起，说明地理来源相近的部分种质亲缘关系较近。研究还发现，部分具有某些特殊质量性状的种质基于SSR标记聚类时也聚在了一起，说明质量性状更能反映种质间的遗传变异。总之，实验筛选出的这62对多态性的SSR引物能具有较高的多样性，并能够把本实验所用的197份亚洲棉进行分类，较好地反映出了这些亚洲棉材料的遗传多样性。表162对引物信息表224个筛选引物的代表材料表3应用实例所用的197份亚洲棉材料对照组选用24份亚洲棉材料，对无多态性引物MON_CGR5118和MON_CGR5127、MON_CGR5426和MON_CGR5429进行筛选，方法同实施例1。结果见图8、图9。可见，本发明提供的62对多态性的SSR引物能具有较高的多样性，并能够把本实验所用的197份亚洲棉进行分类，较好地反映出了这些亚洲棉材料的遗传多样性。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。