用于确认人体是否暴露于乙苯的微RNA及利用其的暴露确认方法与流程

本发明涉及用于确认人体是否暴露于乙苯的微RNA及利用其的确认方法，更详细而言，涉及一种因暴露于乙苯而特异性地发生表达变化的微RNA及利用其的确认人体是否暴露于乙苯的方法。

背景技术：

最近，作为与遗传基因表达调节相关的调节性RNA的重要类别，微RNA(miR,miRNA，小分子核糖核酸)日益抬头。这些小型(典型的是18-24个核苷酸长度)非编码RNA分子通过促进RNA分解、抑制mRNA翻译及对遗传基因转录的影响而能够调节蛋白质表达模式。微RNA调节发育及分化、细胞增殖控制、应激反应等多样的生物学过程。现在已知约1000个以上人类微RNA。

微RNA借助于RNA聚合酶II(pol II)或RNA聚合酶III(pol III；参照Qi,P.et al.Cell.Mol.Immunol.3,411-419,2006)而转录，各个微RNA遗传基因、蛋白质编码遗传基因的基因内区也可以从主要对多个密切相关的微RNA进行编码的多顺反子转录物进行介导。基于RNA pol II或pol III的miRNA遗传基因的转录，一般生产数千碱基长度的称为原始miRNA转录物(pri-miRNAs)的最初转录物。在核中，pri-miRNAs借助于RNAse、Drosha而加工，生产70-至100-核苷酸发夹-状前体(pre-miRNAs)。运输到细胞质后，发夹pre-miRNA为了生产双链miRNA而被DICER追加进行加工。熟化的miRNA链混合于RNA-介导沉默复合体(RISC)内，其中，熟化的miRNA借助于碱基对互补性而与其标的mRNAs结合。miRNA碱基对与mRNA标的完美一致的比较罕见情形，其促进mRNA分解。进一步一般而言，miRNAs形成与标的mRNAs不完全一致的异型双链，对mRNA翻译产生影响。

微RNA机制对癌发病、细胞老化、脏器的成长等产生重要影响，因此，微RNA相关研究不仅在查明癌发病、老化等生命现象与人的关系方面发挥中心作用，而且，预计今后还将能够应用于发生及分化或基于干细胞的细胞治疗剂开发等研究，奠定韩国生物研究的核心领域地位。因此，微RNA标记的发掘将对预测包括癌在内的疾病的早期诊断可能性带来很多帮助，从这一点而言具有意义。

而且，微RNA标记被认为在特定环境有害物质的暴露预测方面也可以有用地使用。截止目前，主要进行因暴露于环境有害物质而导致的遗传基因(mRNA)变化形态及与因此导致的疾病的关联性相关研究，但最近，随着对与微RNA的关联性的关注日益增加，在一些研究中，观察了因暴露于诸如benzene(苯)、arsenic(砷)或RDX的有害物质而导致的微RNA的表达变化，把特异性地表达发生变化的微RNA及其标的遗传基因，作为对有害物质的标记而提出(Baccarelli,参照A.&Bollati,V.Curr.Opin.Prediatr.21,243-251,2009)。另外，发掘的微RNA不仅作为用于暴露预测的标记，而且作为调节标的遗传基因的表达的调节者，也可以作为用于环境有害物质的毒性机理预测的标记而有用地使用。尽管可以说微RNA标记在环境有害物质暴露及毒性机理预测中的作用非常重要，但目前微RNA相关研究主要局限于疾病诊断用标记发掘，对在多样环境中暴露可能性很大的诸如挥发性有机化合物类的有害物质暴露导致的微RNA表达变化的研究不足。另外，后成遗传学变化与诸如遗传基因表达的遗传学变化的多样性相比，其程度不严重，因此，与需要多种标记的遗传基因表达性能分析相比，具有利用诸如一个微RNA或DNA甲基化的后成(epigenetic)标记，便可以早期诊断疾病或有害物质暴露的优点，而且具有能够以非侵入式方法进行诊断的优点。各微RNA调节多样的标的遗传基因，在高等真核生物中存在千余个微RNA，因而预计，可借助于微RNA进行调节的潜在机会巨大。

乙苯(Ethylbenzene；CAS No.1330-20-7)是代表性的挥发性有机化合物类(Volatile organic compounds)之一。是苯与乙烯实现烷基化的挥发性有机化合物，还被用作苯乙烯制造工序或有机溶剂及沥青或纤维的构成成分。乙苯与木聚糖混合物用于涂料或杀虫剂喷雾、汽油合成等，还用于合成橡胶的制造和汽车、飞机燃料。

作为主要发生源，炼油时、因汽油的使用而造成的挥发与燃烧时发生的尾气，加油站汽油和煤油的挥发及泄漏，在油库保管及运输期间的挥发及泄漏，因汽车尾气以及香烟烟气而释放到大气中。

乙苯暴露时，对皮肤及鼻、咽、眼睛引起炎症(G.Inal.Med.Lav.Ergon.,29,417-418,2007)。液体形态的乙苯通过皮肤和肠道吸收到人体内(Rev.Environ.Contam.Toxicol.,106,189-203,1998)，蒸气状的乙苯通过吸入而吸收。报告称，被人类吸入的乙苯的40～60％残留于肺，吸收的乙苯在脂肪中积累。

报告称，如果高浓度地暴露于乙苯，则导致眩晕症、咽与眼的刺激、胸部压迫感等，感觉象眼睛燃烧一样，对中枢神经系统与肝、肾脏、眼睛等造成影响。国际癌症研究机构(IARC)把该物质归类为对人类有致癌可能性的2B类。

乙苯因家用洗涤剂、油漆、炼油工厂、汽车尾气等而发生，石化产业从业者经常暴露于苯，引起中毒现象。但是，是否暴露于乙苯的诊断，停留于血液内乙苯的量、小便检查等基本的观察。

另外，对挥发性有机化合物类的人类毒性程度与遗传基因表达变化的研究虽然已经有部分报告，但几乎局限于对被认为是代表性的挥发性有机化合物类的甲醛、苯(Formaldehyde,Benzene)等的研究。尽管乙苯对人类的这种潜在危害性，但在人体中的危害度评价数据不充分，对暴露的探索方法也局限于GC-MS(Gas Chromatography-Mass Spectrometer，气相色谱质谱仪)或HPLC(High Performance Liquid Chromatography，高效液相色谱法)等古典的方法。如果利用GC-MS或HPLC方法等，则虽然可以定量，但需要对用于分析的适当条件进行设置，需要昂贵的设备等。因此，发掘一种分子型指标，能够以更快、更简便的筛查(screening)方法，例如以利用微阵列芯片或引物(primer)的实时(real-time)PCR(Real-time reverse transcript polymerase chain reaction，反转录聚合酶链反应)等，通过迅速的危害性评价，可以探索在人体内的毒性作用，特别是探索与诱发诸如癌的多种疾病相关的微RNA表达变化与否等，并利用这种分子型指标，执行对人体暴露于乙苯的适当对策及管理，堪称是非常重要的课题。

微RNA自1997年首次被发现以来，哺乳类、微生物等多种种类的微RNA被快速发现并报告Sanger miRBASE database(http://www.mirbase.org/index.shtml)。为了以如此发现的微RNA数据为基本来研究遗传基因的功能，进行了全基因组表达(genome-wide expression)研究。为了通过一次实验分析数千个遗传基因的表达，执行了微阵列(microarray)分析(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93,10614-10619,1996)。

微阵列是把cDNA(complementary DNA，互补脱氧核糖核酸)或20-25碱基对(base pair)长度的低聚核苷酸(oligonucleotide)的片段集成于玻璃。cDNA微阵列由学校内的研究室或安捷伦、Genomic Solutions等公司，在芯片上以机械方式使cDNA收集物固定化，或利用喷墨(ink jetting)方法而生产(Sellheyer K.et.al.J.Am.Acad.Dermatol.51,681-692,2004)。低聚核苷酸微阵列由昂飞公司借助于利用光刻工序(photolithography)在芯片上直接合成的方法制成，在安捷伦公司等处，以对合成的低聚核苷酸进行固定化的方法生产(Sellheyer,K.et.al.J.Am.Acad.Dermatol.51,681-692,2004)。

为了分析遗传基因的表达，在组织等试料中获得微RNA，与微阵列中的低聚核苷酸执行杂交反应。获得的微RNA用荧光或同位素进行标记。

作为通过微阵列来测定遗传基因表达的方法，大致有双染色(two-dye)方式与单染色(one-dye)方式。当测定杂交反应时，在对照组样本与实验组样本中，分别用两个不同的荧光(例:Cye3及Cye5)标记后，使得在微阵列中进行反应并测定，把这种方式称为双染色微阵列(two-dye microarray)；在两种样本中携带相同的荧光后，使得在两个互不相同的微阵列中进行反应并测定，把这种方式称为单染色微阵列(one-dye microarray)(Nature 21,15-19,1999)。

最近，与作为利用DNA微阵列技术的尖端技法的毒理基因组学(Toxicogenomics)研究等接轨，不仅是大量产出(high throughput)的医药品及新药候选物质，而且包括代表性的环境污染物质在内，能够进行因所有化学物质导致的在特定组织或细胞株中表达的微RNA的表达模式分析、定量分析。因此，在特定细胞内，分析特定小分子DNA的表达频度，从而能够发掘与药物的副作用及环境污染物质的有害作用相关的基因，由此，能够理解环境污染物质的有害作用和药物作用及副作用的分子机制，进而能够检索及确认诱发毒性及副作用的物质。

因此，本发明人利用集成了人类微RNA的低聚核苷酸微阵列，针对乙苯的微RNA表达图谱，从实际暴露于乙苯的工厂的劳动者取得血液试料，通过观察及分析，发掘了因人体暴露于乙苯而特异性地发生表达变化的微RNA，确立了能够检测在暴露于乙苯时微RNA表达与否的生物标记及利用其的确认暴露与否的方法，从而完成了本发明。

技术实现要素：

要解决的技术问题

本发明的目的是提供一种因人体暴露于乙苯(Ethylbenzene)而特异性地发生表达变化的微RNA及利用所述生物标记的确认人体是否暴露于乙苯的方法。

解决问题的手段

为达成所述目的，本发明提供一种因暴露于乙苯(Ethylbenzene)而特异性地引起表达变化的选自以下述组的微RNA生物标记：

微RNA登记号(miRbase)MIMAT0000063(hsa-let-7b,Homo sapiens let-7b)，微RNA登记号(miRbase)MIMAT0004482(hsa-let-7b*,Homo sapiens let-7b*)，微RNA登记号(miRbase)MIMAT0004484(hsa-let-7d*,Homo sapiens let-7d*)，微RNA登记号(miRbase)MIMAT0004485(hsa-let-7e*,Homo sapiens let-7e*)，微RNA登记号(miRbase)MIMAT0004486(hsa-let-7f-1*,Homo sapiens let-7f-1*)，微RNA登记号(miRbase)MIMAT0004584(hsa-let-7g*,Homo sapiens let-7g*)，微RNA登记号(miRbase)MIMAT0000415(hsa-let-7i,Homo sapiens let-7i)，微RNA登记号(miRbase)MIMAT0000253(hsa-miR-10a,Homo sapiens miR-10a)，微RNA登记号(miRbase)MIMAT0000254(hsa-miR-10b,Homo sapiens miR-10b)，微RNA登记号(miRbase)MIMAT0005823(hsa-miR-1178,Homo sapiens miR-1178)，微RNA登记号(miRbase)MIMAT0005868(hsa-miR-1204,Homo sapiens miR-1204)，微RNA登记号(miRbase)MIMAT0005580(hsa-miR-1227,Homo sapiens miR-1227)，微RNA登记号(miRbase)MIMAT0005591(hsa-miR-1236,Homo sapiens miR-1236)，微RNA登记号(miRbase)MIMAT0005911(hsa-miR-1260,Homo sapiens miR-1260)，微RNA登记号(miRbase)MIMAT0015041(hsa-miR-1260b,Homo sapiens 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miR-29c)，微RNA登记号(miRbase)MIMAT0000688(hsa-miR-301a,Homo sapiens miR-301a)，微RNA登记号(miRbase)MIMAT0000692(hsa-miR-30e,Homo sapiens miR-30e)，微RNA登记号(miRbase)MIMAT0000693(hsa-miR-30e*,Homo sapiens miR-30e*)，微RNA登记号(miRbase)MIMAT0015010(hsa-miR-3141,Homo sapiens miR-3141)，微RNA登记号(miRbase)MIMAT0015036(hsa-miR-3162,Homo sapiens miR-3162)，微RNA登记号(miRbase)MIMAT0015058(hsa-miR-3180-3p,Homo sapiens miR-3180-3p)，微RNA登记号(miRbase)MIMAT0015079(hsa-miR-3195,Homo sapiens miR-3195)，微RNA登记号(miRbase)MIMAT0015080(hsa-miR-319,Homo sapiens miR-3196)，微RNA登记号(miRbase)MIMAT0015083(hsa-miR-3198,Homo sapiens miR-3198)，微RNA登记号(miRbase)MIMAT0017392(hsa-miR-3200-5p,Homo sapiens miR-3200-5p)，微RNA登记号(miRbase)MIMAT0000510(hsa-miR-320a,Homo sapiens miR-320a)，微RNA登记号(miRbase)MIMAT0004694(hsa-miR-342-5p,Homo sapiens miR-342-5p)，微RNA登记号(miRbase)MIMAT0000703(hsa-miR-361-5p,Homo sapiens miR-361-5p)，微RNA登记号(miRbase)MIMAT0000705(hsa-miR-362-5p,Homo sapiens miR-362-5p)，微RNA登记号(miRbase)MIMAT0018073(hsa-miR-3653,Homo sapiens miR-3653)，微RNA登记号(miRbase)MIMAT0018087(hsa-miR-3665,Homo sapiens miR-3665)，微RNA登记号(miRbase)MIMAT0018104(hsa-miR-3679-5p,Homo sapiens miR-3679-5p)，微RNA登记号(miRbase)MIMAT0000727(hsa-miR-374a,Homo sapiens miR-374a)，微RNA登记号(miRbase)MIMAT0004955(hsa-miR-374b,Homo sapiens miR-374b)，微RNA登记号(miRbase)MIMAT0000732(hsa-miR-378,Homo sapiens miR-378)，微RNA登记号(miRbase)MIMAT0004748(hsa-miR-423-5p,Homo sapiens miR-423-5p)，微RNA登记号(miRbase)MIMAT0001341(hsa-miR-424,Homo sapiens miR-424)，微RNA登记号(miRbase)MIMAT0016900(hsa-miR-4270,Homo sapiens miR-4270)，微RNA登记号(miRbase)MIMAT0016907(hsa-miR-4281,Homo sapiens miR-4281)，微RNA登记号(miRbase)MIMAT0016852(hsa-miR-4298,Homo sapiens miR-4298)，微RNA登记号(miRbase)MIMAT0016851(hsa-miR-4299,Homo sapiens miR-4299)，微RNA登记号(miRbase)MIMAT0016869(hsa-miR-4318,Homo sapiens miR-4318)，微RNA登记号(miRbase)MIMAT0003885(hsa-miR-454,Homo sapiens miR-454)，微RNA登记号(miRbase)MIMAT0004761(hsa-miR-483-5p,Homo sapiens miR-483-5p)，微RNA登记号(miRbase)MIMAT0002816(hsa-miR-494,Homo sapiens miR-494)，微RNA登记号(miRbase)MIMAT0004773(hsa-miR-500a,Homo sapiens miR-500a)，微RNA登记号(miRbase)MIMAT0002871(hsa-miR-500a*,Homo sapiens miR-500a*)，微RNA登记号(miRbase)MIMAT0004774(hsa-miR-501-3p,Homo sapiens miR-501-3p)，微RNA登记号(miRbase)MIMAT0002872(hsa-miR-501-5p,Homo sapiens miR-501-5p)，微RNA登记号(miRbase)MIMAT0004775(hsa-miR-502-3p,Homo sapiens miR-502-3p)，微RNA登记号(miRbase)MIMAT0004776(hsa-miR-505*,Homo sapiens miR-505*)，微RNA登记号(miRbase)MIMAT0002888(hsa-miR-532-5p,Homo sapiens miR-532-5p)，微RNA登记号(miRbase)MIMAT0003258(hsa-miR-590-5p,Homo sapiens miR-590-5p)，微RNA登记号(miRbase)MIMAT0003294(hsa-miR-625,Homo sapiens miR-625)，微RNA登记号(miRbase)MIMAT0003296(hsa-miR-627,Homo sapiens miR-627)，微RNA登记号(miRbase)MIMAT0004810(hsa-miR-629,Homo sapiens miR-629)，微RNA登记号(miRbase)MIMAT0003308(hsa-miR-638,Homo sapiens miR-638)，微RNA登记号(miRbase)MIMAT0018444(hsa-miR-642b,Homo sapiens miR-642b)，微RNA登记号(miRbase)MIMAT0003338(hsa-miR-660,Homo sapiens miR-660)，微RNA登记号(miRbase)MIMAT0003880(hsa-miR-671-5p,Homo sapiens miR-671-5p)，微RNA登记号(miRbase)MIMAT0000252(hsa-miR-7,Homo sapiens miR-7)，微RNA登记号(miRbase)MIMAT0004945(hsa-miR-744,Homo sapiens miR-744)，微RNA登记号(miRbase)MIMAT0010313(hsa-miR-762,Homo sapiens miR-762)，微RNA登记号(miRbase)MIMAT0004983(hsa-miR-940,Homo sapiens miR-940)，微RNA登记号(miRbase)MIMAT0004985(hsa-miR-942,Homo sapiens miR-942)，微RNA登记号(miRbase)MIMAT0000095(hsa-miR-96,Homo sapiens miR-96)，微RNA登记号(miRbase)MIMAT0000096(hsa-miR-98,Homo sapiens miR-98)，微RNA登记号(miRbase)MIMAT0000066(hsa-let-7e,Homo sapiens let-7e)。

另外，本发明提供一种集成了所述微RNA或其互补链分子的用于确认是否暴露于乙苯(Ethylbenzene)的微RNA微阵列芯片。

另外，本发明提供一种包括所述微阵列芯片的用于确认是否暴露于乙苯的试剂盒。

另外，本发明提供一种包括与所述微RNA互补并能够使所述微RNA扩增的所有引物的用于确认是否暴露于乙苯的试剂盒。

另外，本发明提供一种确认人体是否暴露于乙苯的方法，包括：

1)在从作为实验组的被检个体分离的血液试料及从作为对照组的正常个体分离的血液试料中，分离各个RNA的步骤；

2)把步骤1)的实验组及对照组用互不相同的荧光物质进行标记的步骤；

3)使步骤2)的用荧光物质的标记的RNA与权利要求1的微阵列芯片杂交的步骤；

4)对步骤3)的反应的微RNA微阵列芯片进行分析的步骤；及

5)在步骤4)的分析的数据中，把权利要求1的微阵列芯片上集成的所有微RNA的表达程度与对照组进行比较并确认的步骤。

而且，本发明提供一种确认是否暴露于乙苯的方法，包括：

1)在从作为实验组的被检个体分离的血液试料及从作为对照组的正常个体分离的血液试料中，分离各个RNA的步骤；

2)把步骤1)的实验组及对照组的RNA分别合成为cDNA的步骤；

3)把步骤2)的实验组及对照组的cDNA，分别使用能够对在权利要求1的微阵列芯片上集成的各个微RNA进行扩增的引物，执行实时RT-PCR(Real-time reverse transcript polymerase chain reaction)的步骤；及

4)把步骤3)的实验组的扩增产物的表达程度与对照组进行比较并确认的步骤。

发明的效果

本发明的针对人体暴露于乙苯(Ethylbzene)而特异性地发生表达变化的微RNA，可以特异性地用于监视及判定乙苯的污染，能够有用地用作查明因乙苯引起的毒性作用机理的工具。

附图说明

图1是显示利用微RNA微阵列芯片对暴露于乙苯的人类血液试料中的微RNA表达形态进行分析的结果的图。

图2是显示对因人体暴露于乙苯而特异性地发生表达变化的202种微RNA的表达形态进行分析的结果的图。

图3是利用PCA分析而对暴露于乙苯的人类血液试料与未暴露的人类血液试料的微RNA表达形态进行比较分析的结果的图。

具体实施方式

下面详细说明本发明。

本发明提供一种针对乙苯的微RNA表达与否确认用生物标记，其特征是因人体暴露于乙苯而引起表达变化。

所述生物标记作为p-value<0.05具有意义地显示出表达的微RNA，由因暴露于乙苯而表达增加或减少1.5倍以上的微RNA构成。

本发明提供一种生物标记，其特征是包括选自如下构成的组的某一种以上：优选

微RNA登记号(miRbase)MIMAT0000063(hsa-let-7b,Homo sapiens let-7b)，微RNA登记号(miRbase)MIMAT0004482(hsa-let-7b*,Homo sapiens let-7b*)，微RNA登记号(miRbase)MIMAT0004484(hsa-let-7d*,Homo sapiens let-7d*)，微RNA登记号(miRbase)MIMAT0004485(hsa-let-7e*,Homo sapiens let-7e*)，微RNA登记号(miRbase)MIMAT0004486(hsa-let-7f-1*,Homo sapiens let-7f-1*)，微RNA登记号(miRbase)MIMAT0004584(hsa-let-7g*,Homo sapiens let-7g*)，微RNA登记号(miRbase)MIMAT0000415(hsa-let-7i,Homo sapiens let-7i)，微RNA登记号(miRbase)MIMAT0000253(hsa-miR-10a,Homo sapiens miR-10a)，微RNA登记号(miRbase)MIMAT0000254(hsa-miR-10b,Homo sapiens miR-10b)，微RNA登记号(miRbase)MIMAT0005823(hsa-miR-1178,Homo sapiens miR-1178)，微RNA登记号(miRbase)MIMAT0005868(hsa-miR-1204,Homo sapiens miR-1204)，微RNA登记号(miRbase)MIMAT0005580hsa-miR-1227,Homo sapiens miR-1227)，微RNA登记号(miRbase)MIMAT0005591(hsa-miR-1236,Homo sapiens miR-1236)，微RNA登记号(miRbase)MIMAT0005911(hsa-miR-1260,Homo sapiens miR-1260)，微RNA登记号(miRbase)MIMAT0015041(hsa-miR-1260b,Homo sapiens miR-1260b)，微RNA登记号(miRbase)MIMAT0005915(hsa-miR-1263,Homo sapiens miR-1263)，微RNA登记号(miRbase)MIMAT0004548(hsa-miR-129*,Homo sapiens miR-129*)，微RNA登记号(miRbase)MIMAT0004605(hsa-miR-129-3p,Homo sapiensmiR-129-3p)，微RNA登记号(miRbase)MIMAT0005794hsa-miR-1296,Homo sapiens miR-1296)，微RNA登记号(miRbase)MIMAT0004680(hsa-miR-130b*,Homo sapiens miR-130b*)，微RNA登记号(miRbase)MIMAT0000450(hsa-miR-149,Homo sapiens miR-149)，微RNA登记号(miRbase)MIMAT0000452(hsa-miR-154,Homo sapiens miR-154)，微RNA登记号(miRbase)MIMAT0007882hsa-miR-1909*,Homo sapiens miR-1909*)，微RNA登记号(miRbase)MIMAT0007884hsa-miR-1910,Homo sapiens miR-1910)，微RNA登记号(miRbase)MIMAT0007889(hsa-miR-1914,Homo sapiens miR-1914)，微RNA登记号(miRbase)MIMAT0009201(hsa-miR-196b*,Homo sapiens miR-196b*)，微RNA登记号(miRbase)MIMAT0000227(hsa-miR-197,Homo sapiens miR-197)，微RNA登记号(miRbase)MIMAT0009451(hsa-miR-1976,Homo sapiens miR-1976)，微RNA登记号(miRbase)MIMAT0000265(hsa-miR-204,Homo sapiens miR-204)，微RNA登记号(miRbase)MIMAT0000268(hsa-miR-211,Homo sapiens miR-211)，微RNA登记号(miRbase)MIMAT0011777(hsa-miR-2277-3p,Homo sapiens miR-2277-3p)，微RNA登记号(miRbase)MIMAT0002890(hsa-miR-299-5p,Homo sapiens miR-299-5p)，微RNA登记号(miRbase)MIMAT0004673(hsa-miR-29c*,Homo sapiens miR-29c*)，微RNA登记号(miRbase)MIMAT0000684(hsa-miR-302a,Homo sapiens miR-302a)，微RNA登记号(miRbase)MIMAT0015015(hsa-miR-3144-3p,Homo sapiens miR-3144-3p)，微RNA登记号(miRbase)MIMAT0000752(hsa-miR-328,Homo sapiens miR-328)，微RNA登记号(miRbase)MIMAT0000754(hsa-miR-337-3p,Homo sapiens miR-337-3p)，微RNA登记号(miRbase)MIMAT0000773(hsa-miR-346,Homo sapiens miR-346)，微RNA登记号(miRbase)MIMAT0004676(hsa-miR-34b,Homo sapiens miR-34b)，微RNA登记号(miRbase)MIMAT0017982(hsa-miR-3605-3p,Homo sapiens miR-3605-3p)，微RNA登记号(miRbase)MIMAT0017991(hsa-miR-3613-3p,Homo sapiens miR-3613-3p)，微RNA登记号(miRbase)MIMAT0018004(hsa-miR-3622a-3p,Homo sapiens miR-3622a-3p)，微RNA登记号(miRbase)MIMAT0018006(hsa-miR-3622b-3p,Homo sapiens miR-3622b-3p)，微RNA登记号(miRbase)MIMAT0018065(hsa-miR-3646,Homo sapiens miR-3646)，微RNA登记号(miRbase)MIMAT0018112(hsa-miR-3684,Homo sapiens miR-3684)，微RNA登记号(miRbase)MIMAT0018113(hsa-miR-3685,Homo sapiens miR-3685)，微RNA登记号(miRbase)MIMAT0001621(hsa-miR-369-5p,Homo sapiens miR-369-5p)，微RNA登记号(miRbase)MIMAT0000723(hsa-miR-371-3p,Homo sapiens miR-371-3p)，微RNA登记号(miRbase)MIMAT0018165(hsa-miR-3714,Homo sapiens miR-3714)，微RNA登记号(miRbase)MIMAT0018197(hsa-miR-3922,Homo sapiens miR-3922)，微RNA登记号(miRbase)MIMAT0018350(hsa-miR-3935,Homo sapiens miR-3935)，微RNA登记号(miRbase)MIMAT0018356(hsa-miR-3940,Homo sapiens miR-3940)，微RNA登记号(miRbase)MIMAT0016884(hsa-miR-4254,Homo sapiens miR-4254)，微RNA登记号(miRbase)MIMAT001692(hsa-miR-4290,Homo sapiens miR-4290)，微RNA登记号(miRbase)MIMAT0016846(hsa-miR-4297,Homo sapiens miR-4297)，微RNA登记号(miRbase)MIMAT0016864(hsa-miR-4312,Homo sapiens miR-4312)，微RNA登记号(miRbase)MIMAT0016875(hsa-miR-4323,Homo sapiens miR-4323)，微RNA登记号(miRbase)MIMAT001687(hsa-miR-4324,Homo sapiens miR-4324)，微RNA登记号(miRbase)MIMAT0009203(hsa-miR-449b*,Homo sapiens miR-449b*)，微RNA登记号(miRbase)MIMAT0002173(hsa-miR-483-3p,Homo sapiens miR-483-3p)，微RNA登记号(miRbase)MIMAT0002176(hsa-miR-485-3p,Homo sapiens miR-485-3p)，微RNA登记号(miRbase)MIMAT0016925(hsa-miR-500b,Homo sapiens miR-500b)，微RNA登记号(miRbase)MIMAT0002878(hsa-miR-506,Homo sapiens miR-506)，微RNA登记号(miRbase)MIMAT0002827(hsa-miR-515-3p,Homo sapiens miR-515-3p)，微RNA登记号(miRbase)MIMAT0002857(hsa-miR-517b,Homo sapiens miR-517b)，微RNA登记号(miRbase)MIMAT0002863(hsa-miR-518a-3p,Homo sapiens miR-518a-3p)，微RNA登记号(miRbase)MIMAT0002853(hsa-miR-519d,Homo sapiens miR-519d)，微RNA登记号(miRbase)MIMAT0002829(hsa-miR-519e,Homo sapiens miR-519e)，微RNA登记号(miRbase)MIMAT0002834(hsa-miR-520a-3p,Homo sapiens miR-520a-3p)，微RNA登记号(miRbase)MIMAT0002856(hsa-miR-520d-3p,Homo sapiens miR-520d-3p)，微RNA登记号(miRbase)MIMAT0002830(hsa-miR-520f,Homo sapiens miR-520f)，微RNA登记号(miRbase)MIMAT0002858(hsa-miR-520g,Homo sapiens miR-520g)，微RNA登记号(miRbase)MIMAT0002854(hsa-miR-521,Homo sapiens miR-521)，微RNA登记号(miRbase)MIMAT0003254(hsa-miR-548b-3p,Homo sapiens miR-548b-3p)，微RNA登记号(miRbase)MIMAT0003233(hsa-miR-551b,Homo sapiens miR-551b)，微RNA登记号(miRbase)MIMAT0003241(hsa-miR-576-5p,Homo sapiens miR-576-5p)，微RNA登记号(miRbase)MIMAT0003263(hsa-miR-595,Homo sapiens miR-595)，微RNA登记号(miRbase)MIMAT0003273(hsa-miR-605,Homo sapiens miR-605)，微RNA登记号(miRbase)MIMAT0003283(hsa-miR-615-3p,Homo sapiens miR-615-3p)，微RNA登记号(miRbase)MIMAT0003300(hsa-miR-631,Homo sapiens miR-631)，微RNA登记号(miRbase)MIMAT0003304(hsa-miR-634,Homo sapiens miR-634)，微RNA登记号(miRbase)MIMAT0003310(hsa-miR-640,Homo sapiens miR-640)，微RNA登记号(miRbase)MIMAT0004814(hsa-miR-654-3p,Homo sapiens miR-654-3p)，微RNA登记号(miRbase)MIMAT0003881(hsa-miR-668,Homo sapiens miR-668)，微RNA登记号(miRbase)MIMAT0004554(hsa-miR-7-2*,Homo sapiens miR-7-2*)，微RNA登记号(miRbase)MIMAT0004946(hsa-miR-744*,Homo sapiens miR-744*)，微RNA登记号(miRbase)MIMAT0010367(hsa-miR-764,Homo sapiens miR-764)，微RNA登记号(miRbase)MIMAT0003888(hsa-miR-766,Homo sapiens miR-766)，微RNA登记号(miRbase)MIMAT0004947(hsa-miR-885-5p,Homo sapiens miR-885-5p)，微RNA登记号(miRbase)MIMAT0004907(hsa-miR-892a,Homo sapiens miR-892a)，微RNA登记号(miRbase)MIMAT0004980(hsa-miR-937,Homo sapiens miR-937)针对暴露于乙苯，其表达增加，

微RNA登记号(miRbase)MIMAT0000099(hsa-miR-101,Homo sapiens miR-101)，微RNA登记号(miRbase)MIMAT0005865(hsa-miR-1202,Homo sapiens miR-1202)，微RNA登记号(miRbase)MIMAT0005871(hsa-miR-1207-5p,Homo sapiensmiR-1207-5p)，微RNA登记号(miRbase)MIMAT0005572(hsa-miR-1225-5p,Homo sapiens miR-1225-5p)，微RNA登记号(miRbase)MIMAT0005583(hsa-miR-1228,Homo sapiens miR-1228)，微RNA登记号(miRbase)MIMAT0005589(hsa-miR-1234,Homo sapiens miR-1234)，微RNA登记号(miRbase)MIMAT0000423(hsa-miR-125b,Homo sapiens miR-125b)，微RNA登记号(miRbase)MIMAT0000445(hsa-miR-126,Homo sapiens miR-126)，微RNA登记号(miRbase)MIMAT0000444(hsa-miR-126*,Homo sapiens miR-126*)，微RNA登记号(miRbase)MIMAT0005927(hsa-miR-1274a,Homo sapiens miR-1274a)，微RNA登记号(miRbase)MIMAT0005938(hsa-miR-1274b,Homo sapiens miR-1274b)，微RNA登记号(miRbase)MIMAT0000424(hsa-miR-128,Homo sapiens miR-128)，微RNA登记号(miRbase)MIMAT0005876(hsa-miR-1285,Homo sapiens miR-1285)，微RNA登记号(miRbase)MIMAT0005893(hsa-miR-1305,Homo sapiens miR-1305)，微RNA登记号(miRbase)MIMAT0000425(hsa-miR-130a,Homo sapiens miR-130a)，微RNA登记号(miRbase)MIMAT0000691(hsa-miR-130b,Homo sapiens miR-130b)，微RNA登记号(miRbase)MIMAT0000431(hsa-miR-140-5p,Homo sapiens miR-140-5p)，微RNA登记号(miRbase)MIMAT0000434(hsa-miR-142-3p,Homo sapiens miR-142-3p)，微RNA登记号(miRbase)MIMAT0000433(hsa-miR-142-5p,Homo sapiens miR-142-5p)，微RNA登记号(miRbase)MIMAT0004600(hsa-miR-144*,Homo sapiens miR-144*)，微RNA登记号(miRbase)MIMAT000044(hsa-miR-146a,Homo sapiens miR-146a)，微RNA登记号(miRbase)MIMAT0002809(hsa-miR-146b-5p,Homo sapiens miR-146b-5p)，微RNA登记号(miRbase)MIMAT0000243(hsa-miR-148a,Homo sapiens miR-148a)，微RNA登记号(miRbase)MIMAT0000759(hsa-miR-148b,Homo sapiens miR-148b)，微RNA登记号(miRbase)MIMAT0000757(hsa-miR-151-3p,Homo sapiens miR-151-3p)，微RNA登记号(miRbase)MIMAT0000646(hsa-miR-155,Homo sapiens miR-155)，微RNA登记号(miRbase)MIMAT0000068(hsa-miR-15a,Homo sapiens miR-15a)，微RNA登记号(miRbase)MIMAT0000071(hsa-miR-17*,Homo sapiens miR-17*)，微RNA登记号(miRbase)MIMAT0000259(hsa-miR-182,Homo sapiens miR-182)，微RNA登记号(miRbase)MIMAT0000261(hsa-miR-183,Homo sapiens miR-183)，微RNA登记号(miRbase)MIMAT0000456(hsa-miR-186,Homo sapiens miR-186)，微RNA登记号(miRbase)MIMAT0000072(hsa-miR-18a,Homo sapiens miR-18a)，微RNA登记号(miRbase)MIMAT0001412(hsa-miR-18b,Homo sapiens miR-18b)，微RNA登记号(miRbase)MIMAT0000440(hsa-miR-191,Homo sapiens miR-191)，微RNA登记号(miRbase)MIMAT0007890(hsa-miR-1914*,Homo sapiens miR-1914*)，微RNA登记号(miRbase)MIMAT0007892(hsa-miR-1915,Homo sapiens miR-1915)，微RNA登记号(miRbase)MIMAT0000222(hsa-miR-192,Homo sapiens miR-192)，微RNA登记号(miRbase)MIMAT0000460(hsa-miR-194,Homo sapiens miR-194)，微RNA登记号(miRbase)MIMAT0000461(hsa-miR-195,Homo sapiens miR-195)，微RNA登记号(miRbase)MIMAT0000232(hsa-miR-199a-3p,Homo sapiens miR-199a-3p)，微RNA登记号(miRbase)MIMAT0000073(hsa-miR-19a,Homo sapiens miR-19a)，微RNA登记号(miRbase)MIMAT0000074(hsa-miR-19b,Homo sapiens miR-19b)，微RNA登记号(miRbase)MIMAT0000617(hsa-miR-200c,Homo sapiens miR-200c)，微RNA登记号(miRbase)MIMAT0000076(hsa-miR-21,Homo sapiens miR-21)，微RNA登记号(miRbase)MIMAT0000267(hsa-miR-210,Homo sapiens miR-210)，微RNA登记号(miRbase)MIMAT0000272(hsa-miR-215,Homo sapiens miR-215)，微RNA登记号(miRbase)MIMAT0000278(hsa-miR-221,Homo sapiens miR-221)，微RNA登记号(miRbase)MIMAT0000279(hsa-miR-222,Homo sapien miR-222)，微RNA登记号(miRbase)MIMAT0000418(hsa-miR-23b,Homo sapiens miR-23b)，微RNA登记号(miRbase)MIMAT0000080(hsa-miR-24,Homo sapiens miR-24)，微RNA登记号(miRbase)MIMAT0000082(hsa-miR-26a,Homo sapiens miR-26a)，微RNA登记号(miRbase)MIMAT0000083(hsa-miR-26b,Homo sapiens miR-26b)，微RNA登记号(miRbase)MIMAT0000084(hsa-miR-27a,Homo sapiens miR-27a)，微RNA登记号(miRbase)MIMAT0000419(hsa-miR-27b,Homo sapiens miR-27b)，微RNA登记号(miRbase)MIMAT0000085(hsa-miR-28-5p,Homo sapiens miR-28-5p)，微RNA登记号(miRbase)MIMAT0013802(hsa-miR-2861,Homo sapiens miR-2861)，微RNA登记号(miRbase)MIMAT0000100(hsa-miR-29b,Homo sapiens miR-29b)，微RNA登记号(miRbase)MIMAT0000681(hsa-miR-29c,Homo sapiens miR-29c)，微RNA登记号(miRbase)MIMAT0000688(hsa-miR-301a,Homo sapiens miR-301a)，微RNA登记号(miRbase)MIMAT0000692(hsa-miR-30e,Homo sapiens miR-30e)，微RNA登记号(miRbase)MIMAT0000693(hsa-miR-30e*,Homo sapiens miR-30e*)，微RNA登记号(miRbase)MIMAT0015010(hsa-miR-3141,Homo sapiens miR-3141)，微RNA登记号(miRbase)MIMAT0015036(hsa-miR-3162,Homo sapiens miR-3162)，微RNA登记号(miRbase)MIMAT0015058(hsa-miR-3180-3p,Homo sapiens miR-3180-3p)，微RNA登记号(miRbase)MIMAT0015079(hsa-miR-3195,Homo sapiens miR-3195)，微RNA登记号(miRbase)MIMAT0015080(hsa-miR-319,Homo sapiens miR-3196)，微RNA登记号(miRbase)MIMAT0015083(hsa-miR-3198,Homo sapiens miR-3198)，微RNA登记号(miRbase)MIMAT0017392(hsa-miR-3200-5p,Homo sapiens miR-3200-5p)，微RNA登记号(miRbase)MIMAT0000510(hsa-miR-320a,Homo sapiens miR-320a)，微RNA登记号(miRbase)MIMAT0004694(hsa-miR-342-5p,Homo sapiens miR-342-5p)，微RNA登记号(miRbase)MIMAT0000703(hsa-miR-361-5p,Homo sapiens miR-361-5p)，微RNA登记号(miRbase)MIMAT0000705(hsa-miR-362-5p,Homo sapiens miR-362-5p)，微RNA登记号(miRbase)MIMAT0018073(hsa-miR-3653,Homo sapiens miR-3653)，微RNA登记号(miRbase)MIMAT0018087(hsa-miR-3665,Homo sapiens miR-3665)，微RNA登记号(miRbase)MIMAT0018104(hsa-miR-3679-5p,Homo sapiens miR-3679-5p)，微RNA登记号(miRbase)MIMAT0000727(hsa-miR-374a,Homo sapiens miR-374a)，微RNA登记号(miRbase)MIMAT0004955(hsa-miR-374b,Homo sapiens miR-374b)，微RNA登记号(miRbase)MIMAT0000732(hsa-miR-378,Homo sapiens miR-378)，微RNA登记号(miRbase)MIMAT0004748(hsa-miR-423-5p,Homo sapiens miR-423-5p)，微RNA登记号(miRbase)MIMAT0001341(hsa-miR-424,Homo sapiens miR-424)，微RNA登记号(miRbase)MIMAT0016900(hsa-miR-4270,Homo sapiens miR-4270)，微RNA登记号(miRbase)MIMAT0016907(hsa-miR-4281,Homo sapiens miR-4281)，微RNA登记号(miRbase)MIMAT0016852(hsa-miR-4298,Homo sapiens miR-4298)，微RNA登记号(miRbase)MIMAT0016851(hsa-miR-4299,Homo sapiens miR-4299)，微RNA登记号(miRbase)MIMAT0016869(hsa-miR-4318,Homo sapiens miR-4318)，微RNA登记号(miRbase)MIMAT0003885(hsa-miR-454,Homo sapiens miR-454)，微RNA登记号(miRbase)MIMAT0004761(hsa-miR-483-5p,Homo sapiens miR-483-5p)，微RNA登记号(miRbase)MIMAT0002816(hsa-miR-494,Homo sapiens miR-494)，微RNA登记号(miRbase)MIMAT0004773(hsa-miR-500a,Homo sapiens miR-500a)，微RNA登记号(miRbase)MIMAT0002871(hsa-miR-500a*,Homo sapiens miR-500a*)，微RNA登记号(miRbase)MIMAT0004774(hsa-miR-501-3p,Homo sapiens miR-501-3p)，微RNA登记号(miRbase)MIMAT0002872(hsa-miR-501-5p,Homo sapiens miR-501-5p)，微RNA登记号(miRbase)MIMAT0004775(hsa-miR-502-3p,Homo sapiens miR-502-3p)，微RNA登记号(miRbase)MIMAT0004776(hsa-miR-505*,Homo sapiens miR-505*)，微RNA登记号(miRbase)MIMAT0002888(hsa-miR-532-5p,Homo sapiens miR-532-5p)，微RNA登记号(miRbase)MIMAT0003258(hsa-miR-590-5p,Homo sapiens miR-590-5p)，微RNA登记号(miRbase)MIMAT0003294(hsa-miR-625,Homo sapiens miR-625)，微RNA登记号(miRbase)MIMAT0003296(hsa-miR-627,Homo sapiens miR-627)，微RNA登记号(miRbase)MIMAT0004810(hsa-miR-629,Homo sapiens miR-629)，微RNA登记号(miRbase)MIMAT0003308(hsa-miR-638,Homo sapiens miR-638)，微RNA登记号(miRbase)MIMAT0018444(hsa-miR-642b,Homo sapiens miR-642b)，微RNA登记号(miRbase)MIMAT0003338(hsa-miR-660,Homo sapiens miR-660)，微RNA登记号(miRbase)MIMAT0003880(hsa-miR-671-5p,Homo sapiens miR-671-5p)，微RNA登记号(miRbase)MIMAT0000252(hsa-miR-7,Homo sapiens miR-7)，微RNA登记号(miRbase)MIMAT0004945(hsa-miR-744,Homo sapiens miR-744)，微RNA登记号(miRbase)MIMAT0010313(hsa-miR-762,Homo sapiens miR-762)，微RNA登记号(miRbase)MIMAT0004983(hsa-miR-940,Homo sapiens miR-940)，微RNA登记号(miRbase)MIMAT0004985(hsa-miR-942,Homo sapiens miR-942)，微RNA登记号(miRbase)MIMAT0000095(hsa-miR-96,Homo sapiens miR-96)，微RNA登记号(miRbase)MIMAT0000096(hsa-miR-98,Homo sapiens miR-98)，微RNA登记号(miRbase)MIMAT0000066(hsa-let-7e,Homo sapiens let-7e)针对暴露于乙苯，其表达减少。

在本发明的具体实施例中，本发明人为了发掘针对人体暴露于乙苯的微RNA表达与否确认用生物标记，以位于全罗南道灵岩的处置乙苯的船舶制造厂的劳动者为对象采集了血液试料，根据生物接触指数(biological exposure index,BEI)对对象产物进行分析，用作有害物质暴露的活体指标。对于乙苯，把尿中扁桃酸与苯乙醛酸之和(sum of mandelic and phenylglyoxylic acid)用活体指标进行了分析，进行了尿中肌酸酐分析，对各个数值进行了校正。

然后，从显示为以所述浓度暴露于乙苯的非暴露组与暴露组劳动者的血液试料，分离包括微RNA的总RNA，用荧光物质(Cy3)进行了标记。把所述经荧光标记的微RNA与Agilent Human miRNA array v14.0(安捷伦，美国)进行杂交，扫描荧光图像，分析了微RNA表达形态的差异(参照图1)。分析时，把与非暴露组相比有意义地显示出表达变异的微RNA，通过unpaired Welch's t-test、Multiple Test Correction-Benjamini and Hochberg False Discovery Rate，遴选了p-value<0.05有意义地显示出表达的微RNA 695种。其分析结果，表达增加1.5倍以上的微RNA为91种，减少的微RNA为111种，共202种(表2至表4，图2)，没有报告指出这些微RNA在人体暴露于乙苯时与毒性相关联。

因此，本发明的针对人体暴露于乙苯而发生特异性表达变化的微RNA，可以特异性地用于监视及判定乙苯的污染，可以有用地用作查明因乙苯而引起的毒性作用机理的工具。

另外，本发明提供一种集成了包括本发明的微RNA序列全部或一部分的低聚核苷酸或其互补链分子的、用于确认人体是否暴露于乙苯的特异性微RNA微阵列芯片。

所述低聚核苷酸或其互补链分子，包括所述生物标记微RNA的15至20个核酸。

本发明的乙苯检索用微RNA微阵列芯片，可以以本领域技术人员已知的方法制作。制作所述微阵列芯片的方法如下。把所述探索的生物标记用作探针微RNA分子，为了使得固定化于芯片的基板上，优选使用inkjet方式等，但不限定于此，在本发明的优选实施例中，利用了SurePrint inkjet micro dropping微阵列。优选所述DNA微阵列芯片的基板涂布了选自由环氧树脂(epoxy)、氨基硅烷(amino-silane)、聚-l-赖氨酸(poly-L-lysine)及乙醛(aldehyde)构成的组的一种活性基，但不限定于此。另外，所述基板可以在由载玻片、塑料、金属、硅酮、尼龙膜及硝酸纤维膜(nitrocellulose membrane)构成的组中选择，但不限定于此，在本发明的优选实施例中，使用涂布了环氧树脂的载玻片。

另外，本发明提供一种利用所述生物标记的确认人体是否暴露于乙苯的方法。

本发明提供一种包括如下步骤的确认人体是否暴露于乙苯的方法：

1)在从作为实验组的被检个体分离的血液试料及从作为对照组的正常个体分离的血液试料中，分离各个RNA的步骤；

2)把步骤1)的实验组及对照组用互不相同的荧光物质进行标记的步骤；

3)使步骤2)的用荧光物质的标记的RNA与权利要求1的微阵列芯片杂交的步骤；

4)对步骤3)的反应的微RNA微阵列芯片进行分析的步骤；及

5)在步骤4)的分析的数据中，把本发明的生物标记的表达程度与对照组进行比较并确认的步骤。

在所述确认是否暴露的方法中，优选步骤1)的血液试料使用从暴露于或未暴露于乙苯的劳动者的组中收得者。

在所述确认是否暴露的方法中，优选步骤2)的荧光物质选自由Cy3、Cy5、聚L-赖氨酸-异硫氰酸荧光素(poly Llysine-fluorescein isothiocyanate,FITC)、罗丹明-B-异硫氰酸酯(rhodamine-B-isothiocyanate,RITC)及若丹明(rhodamine)构成的组，但不限定于此，本领域技术人员已知的荧光物质均可使用。

在所述确认是否暴露的方法中，优选步骤3)的微RNA微阵列芯片使用Agilent Human miRNA array v14.0(安捷伦，美国)等，但不限定于此，只要是搭载了人类微RNA中的在本发明中所述共同地发生表达变化的微RNA(参照表2至表4)的微阵列芯片，则均可使用，最优选使用所述本发明人制作的微RNA微阵列芯片。另外，优选步骤4)的分析方法使用GeneSpring GX 11软件(安捷伦，美国)，但不限定于此，使用所属领域技术人员已知的分析软件也无妨。

另外，本发明提供一种包括如下步骤的对人体暴露于乙苯的确认方法：

1)在从作为实验组的被检个体分离的血液试料及从作为对照组的正常个体分离的血液试料中，分离各个RNA的步骤；

2)把步骤1)的实验组及对照组的RNA分别合成为cDNA的步骤；

3)把步骤2)的实验组及对照组的cDNA，分别使用能够对在权利要求1的微阵列芯片上集成的各个微RNA进行扩增的引物，执行实时RT-PCR(Real-time reverse transcript polymerase chain reaction，实时反转录聚合酶链反应)的步骤；及

4)把步骤3)的实验组的扩增产物的表达程度与对照组进行比较并确认的步骤。

在所述确认是否暴露的方法中，优选步骤1)的血液试料使用从暴露于或未暴露于乙苯的劳动者的组中收得者。

所述能够对微RNA扩增的引物，只要能够扩增本发明的微RNA，则使用哪一种均无妨。

另外，本发明提供一种针对人体暴露于乙苯的微RNA表达与否确认用试剂盒。

本发明提供一种包含所述本发明中制作的微RNA微阵列芯片的、针对人体暴露于乙苯的微RNA表达与否确认用试剂盒。

提供一种在所述确认用试剂盒中追加包括人类血液试料的、对人体暴露于乙苯的微RNA表达与否确认用试剂盒。优选所述人类血液试料使用从暴露于或未暴露于乙苯的劳动者的组中收得者。

在所述试剂盒中可以追加包括荧光物质，优选所述荧光物质是选自由链霉亲和素-碱性磷酸酶结合物质(strepavidin-like phosphatease conjugate)、化学荧光物质(chemiflurorensce)及化学发光物质(chemiluminescent)构成的组，但不限定于此，在本发明的优选实施例中使用了Cy3。

在所述试剂盒中可以追加包括反应试剂，所述反应试剂可以由用于杂交的缓冲溶液、诸如荧光染色剂的化学性介导剂的标识试剂、洗涤缓冲溶液等构成，但不限定于此，可以全部包括所属领域技术人员已知的微RNA微阵列芯片的杂交反应所需的反应试剂。

下面根据实施例，对本发明进行详细说明。

不过，下述实施例只是对本发明进行举例，并非本发明内容限定于下述实施例。

<实施例1>研究募集团及血液试料的收得

<1-1>研究募集团

暴露组与非暴露组劳动者由韩国天主教大学医科学院产业保健研究所的研究员募集。本研究的募集团由处置乙苯的船舶制造厂的暴露于或不暴露于乙苯的劳动者(N＝26)构成(参照表1)。这些试料与性别、年龄分布、工作环境、吸烟或饮酒等生活习惯、平均工作时间等因素无关地选定，药物服用者除外。在实验之前，本研究方法经IRB委员会评价并获得认证(批准号CUMC10U066)，在实验前，所有参加者阅读同意书并签名。

【表1】

对血液试料(n＝26)的乙苯对象产物(ethyl-sum)分析结果

<1-2>研究募集团是否暴露于被检化合物的确认

根据Biological Exposure Index(BEI)对对象产物进行分析，用作乙苯的活体指标。截止目前，国内生物学暴露指标(BEI)基准尚不明确，因而把国际上较多通用的美国政府工业卫生专家协会(ACGIH,American conference of Governmental Industrial Hygienists)的基准BEI作为对象产物测定基准。对于乙苯，把尿中扁桃酸与苯乙醛酸之和(sum of mandelic and phenylglyoxylic acid)当作活体指标进行了分析，为了尿中扁桃酸与苯乙醛酸之和的分析而采集的小便，为了选择适合的试料而分析了尿中肌酸酐，进行了如下校正(参照表1)。

[数学式1]

尿中扁桃酸与苯乙醛酸暴露浓度(g/g MHA)＝测定浓度(g)/肌酸酐浓度(g creatinine)

<1-3>血液试料

获得所述实施例<1-1>的同意书后，血液试料由研究护士使用PAXgene Blood RNA tube收得，在-20℃下保管24小时后，在-80℃下保管。

<实施例2>微阵列实验

<2-1>标的微RNA的分离及荧光物质标记

从乙苯暴露组与非暴露组血液试料提取RNA，使用Human blood micro RNA kit(Qiagen，美国)进行提纯。基因组DNA在RNA提纯期间，使用RNase-free DNase set(Qiagen，美国)去除。各总RNA试料的浓度利用作为分光光度计的NanoDrop ND 1000 spectrophotometer(NanoDrop技术公司，美国)进行测定，纯度利用Experion(全自动电泳工作站，伯乐公司)进行确认。

<2-2>制造被标记的微RNA

为了进行低聚核苷酸微阵列分析，在从所述实施例<2-1>中收得的乙苯暴露组总RNA中标记荧光物质。荧光标记使用安捷伦公司的miRNA complete labeling and Hybridization kit，按制造商的方法执行。在所述收得的总RNA(100ng)中，加入0.4ul的10X CIP缓冲液、的无核酸酶水(nuclease-free water)、的小牛肠磷酸酶(Calf Intestinal Phosphatase)，在37℃下反应30分钟后，添加的100％DMSO，在100％下反应5～10分钟，立即放到ice上。为了携带Dye，加入的10X T4RNA连接酶缓冲液、的Cyanine3-pCp、的T4RNA连接酶，在16℃下反应2小时。所述标记的试料使用Micro Bio-Spin 6column进行提纯。提纯的RNA在55℃的真空浓缩器中完全干燥，用的无核酸酶水(nuclease-free water)溶解后，加入的10X GE封闭剂，加入的2X Hi-RPM杂交缓冲液，使准备的样本在100℃下反应5分钟，立即放到ice上，反应5分钟后，用于杂交反应。

<2-3>杂交反应

杂交及洗涤过程根据genocheck(株)的指示方法执行。杂交在55℃烘箱中执行20小时。DNA微阵列芯片使用8×60k human miRNA array v14.0(安捷伦,美国)。

<2-4>获得荧光图像

载玻片上的杂交图像利用Agilent C scanner(安捷伦科技公司，美国)进行扫描，提取的数据利用Agilent GeneSpring GX 11(安捷伦科技公司)，经过标准化，分析各微RNA的表达形态。

结果，如图1所示，在低聚核苷酸芯片上存在的大致887个微RNA中，针对与非暴露组相比，乙苯暴露组组中有意义地显示出表达变异的微RNA，通过unpaired Welch’t-test、Multiple Test Correction-Benjamini and Hochberg False Discovery Rate，筛选了p-value<0.05有意义地显示出表达的微RNA 695种(参照图1)。

另外，使用GeneSpring GX 11软件，比较暴露组与非暴露组的微RNA表达形态，对其进行了验证(参照图3)。其分析结果，表达增加1.5倍以上的微RNA为91种，减少的微RNA为111种，共202种(表2至表4，图2)，没有报告指出这些微RNA在人体暴露于乙苯时与毒性相关联。

【表2】

因暴露于乙苯而发生表达变化的微RNA-1

【表3】

因暴露于乙苯而发生表达变化的微RNA-2

【表4】

因暴露于乙苯而发生表达变化的微RNA-3