本发明属于酶学
技术领域：
：，具体涉及一种β-葡萄糖苷酶的突变体W233D及其应用。
背景技术：
：：化石燃料的加速消耗及其对全球经济和环境的影响加速了人们对可替代燃料(如纤维素乙醇)的研究。纤维素乙醇是主要以木质纤维素类生物质为原料生产的燃料乙醇。木质纤维素是不同植物或作物中最丰富的成分，主要有由纤维素、半纤维素和木质素组成(SorensenA,LubeckM,LubeckPS,etal.Fungalbeta-glucosidases:abottleneckinindustrialuseoflignocellulosicmaterials.Biomolecules,2013,3(3):612-631.)，其中纤维素占组成成分的50％左右。纤维素是一种有1000-10000个葡萄糖单体以β-1,4糖苷键连接的直链多糖，多个分子平行紧密排列成丝状不溶性微小纤维，其基本组成单位是纤维二糖，它是地球上最丰富的聚合体。目前，主要有三种分解纤维素的方法：(1)化学法：酸解法、碱处理法和离子液处理法(李建华，张越，刘仲齐。化学处理方法对木质纤维素降解效率的影响评述。生物技术进展，2011，06：421-425.)。但是这些方法成本比较高，处理过程复杂而且含有较多对下一步发酵有影响的物质。(2)物理法：常用的为热裂解法与蒸汽爆破法。这些方法能源消耗高，对设备要求严格限制了其推广以及应用。(3)酶解法：酶解法具有反应条件温和、不污染环境，能源消耗少，反应产物单一等优点，符合环保经济的特征，值得作为分解纤维素生产燃料乙醇的推广方法。而纤维素彻底降解为葡萄糖需要纤维素酶系的协同作用纤维素酶系包括：①外切-1,4-β-D-葡聚糖酶(exo-1,4-β-Dglucanase或1,4-β-D-glucancellobiohydrolase，EC3.2.1.91，简称CBH)能够水解纤维素两端(还原端和非还原端)，每次切下一个纤维二糖，使紧密结合的纤维素晶体逐渐分解为单一的纤维素分子。②内切-1,4-β-D-葡聚糖酶(1,4-D-glucanohydrolase或endo-1,4-β-D-glucanase，EC3.2.1.4，简称EG)能够随机水解单条纤维素中的β-1,4-糖苷键，将长链纤维素分子截断，形成纤维素小分子，如：纤维二糖、纤维寡糖。③β-葡萄糖苷酶(β-D-glucosidase，EC3.2.1.21，简称GE)能够将纤维素外切酶以及纤维素内切酶作用形成的纤维二糖和纤维寡糖水解，最终形成葡萄糖。然而，在纤维素降解的过程中，β-葡萄糖苷酶虽然能够将纤维二糖水解为葡萄糖从而解除了纤维二糖对外切葡聚糖酶和内切葡聚糖酶的抑制作用，但葡萄糖的积累又可以通过阻断活性位点或阻止产物离开引起反馈抑制，从而降低了纤维素生物质水解过程的速率。在工业上用来消除葡萄糖的抑制的方法主要有：提高酶的使用浓度和用超滤方法转移累积的葡萄糖。这两种方法不可避免的会使生产成本提升，所以寻找一种提高β-葡萄糖苷酶的葡萄糖耐受性的方法是目前研究β-葡葡萄糖苷酶应用的热点之一。提高β-葡萄糖苷酶的葡萄糖耐受性的方法就是寻找高葡萄糖耐受性的β-葡萄糖苷酶。如LeiChen等从李子种子中纯化出的β-葡萄糖苷酶具有一定的葡萄糖耐受性，其Ki值为468mM(ChenLei，LiNing，ZongMinHua.Aglucose-tolerantβ-glucosidasefromPrunusdomesticaseeds:purificationandcharacterization.ProcessBiochemistry,2012,47(1):127-32.)。ZhimaoMai等从Streptomycete获得的糖基水解酶家族1的β-葡萄糖苷酶的葡萄糖抑制常数也达到了600mM(MaiZhimao，YangJian，TianXinpen，etal.GeneCloningandCharacterizationofaNovelSalt-TolerantandGlucose-Enhancedβ-GlucosidasefromaMarineStreptomycete.AppliedBiochemistryandBiotechnology，2013，169(5):1512-1522.)。ShivangiChanmoli等从枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)分泌表达的一个糖基水解酶家族1的β-葡萄糖苷酶其Ki值为1.9M(ChamoliS,KumarP,NavaniNK,etal.Secretoryexpression,characterizationanddockingstudyofglucose-tolerantbeta-glucosidasefromB.subtilis.InternationalJournalofBiologicalMacromolecules,2016,85:425-433.)。GangLi等从红树林土壤的宏基因组中筛选获得的糖基水解酶家族1的β-葡萄糖苷酶的葡萄糖抑制常数Ki值达到了4.28M(LiGang，JiangYang，FanXin-jiong，etal.Molecularcloningandcharacterizationofanovelβ-glucosidasewithhighhydrolyzingabilityforsoybeanisoflavoneglycosidesandglucose-tolerancefromsoilmetagenomiclibrary.BioresourceTechnology，2012，123(0):15-22.)。目前研究发现，属于糖基水解酶家族3的β-葡萄糖苷酶的葡萄糖耐受性通常是非常低的，普遍比糖基水解酶家族1的要低。KroghKristianB.R.M等从Penicilliumbrasilianum中获得的糖基水解酶家族3的β-葡萄糖苷酶的葡萄糖的抑制常数Ki为2.3mM(KroghKristianB.R.M.，HarrisPaulV.，OlsenCarstenL.，etal.CharacterizationandkineticanalysisofathermostableGH3β-glucosidasefromPenicilliumbrasilianum.AppliedMicrobiologyandBiotechnology，2010，86(1):143-154.)。XinzhuoYang等从NeosartoryafischeriP1获得糖基水解酶家族3的β-葡萄糖苷酶，其葡萄糖抑制常数Ki是13.4mM(YangX,MaR,ShiP,etal.Molecularcharacterizationofahighly-activethermophilicbeta-glucosidasefromNeosartoryafischeriP1anditsapplicationinthehydrolysisofsoybeanisoflavoneglycosides.PlosOne,2014,9(9):e106785.)。KarnaouriAnthi等从Myceliophthorathermophila获得的糖基水解酶家族3的β-葡萄糖苷酶的葡萄糖抑制常数Ki是282μM(KarnaouriAnthi，TopakasEvangelos，PaschosThomas，etal.Cloning，expressionandcharacterizationofanethanoltolerantGH3β-glucosidasefromMyceliophthorathermophila.PeerJ,2013,1:e46.)。但是糖基水解酶家族3的β-葡萄糖苷酶具有很多糖基水解酶家族1的β-葡萄糖苷酶没有的优点，由于它们的高Kcat/Km值(可超过100mM-1S-1)而常常被用于纤维素的水解，所以通过分子改造糖基水解酶家族3的β-葡萄糖苷酶提高是葡萄糖耐受性目前的研究热点之一。HeatherF等对来自Aspergillusniger的GH3的β-葡萄糖苷酶进行分子改造，利用定点突变技术对262-Trp进行突变，当色氨酸转变为亮氨酸时，其突变酶的葡萄糖抑制常数Ki比野生酶提高了162倍(SeidleHF,MckenzieK,MartenI,etal.Trp-262isakeyresidueforthehydrolyticandtransglucosidicreactivityoftheAspergillusnigerfamily3beta-glucosidase:substitutionresultsinenzymeswithmainlytransglucosidicactivity.ArchivesofBiochemistryandBiophysics,2005,444(1):66-75.)。以β-葡萄糖苷酶为发明名称查找国家知识产权局专利检索数据库，共出现111个发明专利。在这111个发明专利中，关于β-葡萄糖苷酶的制备、固定化及产酶菌株筛选方法的发明专利有25个；关于β-葡萄糖苷酶基因及应用的发明专利有46个；关于β-葡萄糖苷酶产生菌株及应用的发明专利有12个；关于β-葡萄糖苷酶在合成红景天苷、制备甜菊醇、白藜芦醇等方面应用的发明专利有16个；关于β-葡萄糖苷酶突变体的专利有12个。以β-葡萄糖苷酶突变体为检索要素查找国家知识产权局专利检索数据库，共出现13个发明名专利。在这13个发明名专利中，关于突变体耐热性提高的发明专利有5个；关于突变体活性提高的发明专利有2个；关于突变体在制备牛蒡子苷元和白藜芦醇应用的专利有2个；关于突变体乙醇耐受性提高的发明专利有1个；关于葡萄糖耐受性的专利有3个：分别是一种β-木糖苷酶突变体及其应用、β-葡萄糖苷酶的突变体Pbgl-W386C及其应用和一种β-葡萄糖苷酶突变体、其重组表达质粒及转化的工程菌株，它们的葡萄糖耐受性分别提高了2.31、10.88和13倍。寻找和克隆高葡萄糖耐受性的β-葡萄糖苷酶的途径有2个：一是筛选新型酶的微生物；二是对已有的酶资源进行适当的分子改造。微生物菌种选育是工业生产和学术研究中最常用和最简单的手段之一，但是工作量大、随机性强，因此往往很难筛选到理想菌株。分子改造是新兴的、利用分子生物学和生物信息学的方法对蛋白质进行定向突变和理性改造，从而获得理想蛋白或酶的方法，其优点在于工作量相对较小和成功概率较大，但是多数突变体蛋白质的酶学性质没有改变或者变得更差。因此，获得葡萄糖耐受性效果更好的β-葡萄糖苷酶突变体一直是本领域的研究热点。技术实现要素：本发明为了提高β-葡萄糖苷酶S-bgl6的葡萄糖耐受性，通过对S-bgl6进行蛋白质工程改造，从而获得一种高耐葡萄糖的β-葡萄糖苷酶突变体。为了实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案：一种β-葡萄糖苷酶突变体W233D，由772个氨基酸组成，其氨基酸序列如SEQIDNO:1所示，该突变体是通过对专利ZL201310049606.X中的β-葡萄糖苷酶S-bgl6进行改造而得到的，具体是通过分子改造β-葡萄糖苷酶基因S-bgl6，将S-bgl6分子上的233位色氨酸W突变成天冬氨酸D而得到的。该β-葡萄糖苷酶突变体和突变前相比，葡萄糖的耐受性提高了208.9倍。本发明提供了所述的β-葡萄糖苷酶突变体W233D的制备方法，包括以下步骤：(1)克隆获得β-葡萄糖苷酶基因S-bgl6；(2)将步骤(1)所获得的基因改造得到β-葡萄糖苷酶突变体基因；(3)将步骤(2)所获得的β-葡萄糖苷酶突变体基因进行表达和纯化，得到β-葡萄糖苷酶突变体的纯化产物。另外，本发明还提供一种宿主细胞，其是所述的β-葡萄糖苷酶突变体W233D的原核细胞或真核细胞。本发明还提供了所述的β-葡萄糖苷酶突变体W233D在降解纤维二糖中的应用。与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：(1)本发明通过分子改造的方法对β-葡萄糖苷酶S-bgl6进行了定向改造，具体是通过分子改造β-葡萄糖苷酶基因S-bgl6，将S-bgl6分子上的233位色氨酸W突变成天冬氨酸D而得到的。该β-葡萄糖苷酶突变体和突变前相比，葡萄糖的耐受性提高了208.9倍。(2)本发明提供的β-葡萄糖苷酶突变体W233D能够在降解纤维二糖中应用。附图说明图1为本发明的β-葡萄糖苷酶突变体W233D纯化物的SDS-PAGE图；图2为本发明的β-葡萄糖苷酶突变体W233D和β-葡萄糖苷酶S-bgl6的葡萄糖抑制常数Ki值分析图。具体实施方式下面结合具体实施例，对本发明作进一步详细的阐述，但本发明的实施方式并不局限于实施例表示的范围。这些实施例仅用于说明本发明，而非用于限制本发明的范围。此外，在阅读本发明的内容后，本领域的技术人员可以对本发明作各种修改，这些等价变化同样落于本发明所附权利要求书所限定的范围。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例1：在本发明的实施例中所用到的材料包括：购自Stratagene公司的大肠杆菌(Escherichiacoli)株系XL10-Gold；购自Intrivogen公司的Ni-NTA蛋白质组氨酸纯化介质；购自TaKaRa、MBI公司的限制性内切酶、修饰酶；纤维二糖和葡萄糖购自Sigma公司。下面将通过实施例对本发明作详细描述，所提供的实施例是为了更好的解释本发明，而不应该被解释为限制本发明的目的。(1)β-葡萄糖苷酶基因S-bgl6的克隆使用S-bgl6的上游引物和下游引物如下：上游引物5′-CACTCATGATGCACCACCACCACCACCACACCGCGACCGAAGAAGACGCCG-3′下游引物5′-CATAAGCTTTCAGCTCACCTGCCGACCGCTC-3′其中，上游引物包含一个PagI酶切位点和一个6个组氨酸标签，下游引物包含一个HindIII酶切位点。以链霉菌GXT6的基因组DNA为模板通过聚合酶链式反应PCR扩增β-葡萄糖苷基因S-bgl6，用限制性内切酶PagI和HindIII酶切β-葡萄糖苷酶基因S-bgl6后，插入到经NcoI和HindIII酶切的表达载体pSE380进行连接。获得的重组质粒命名为pSE-S-bgl6。(2)β-葡萄糖苷酶突变体基因W233D的获得W233D突变基因是将基因S-bgl6的233位的色氨酸突变成天冬氨酸来进行改造的。以步骤(1)中构建的pSE-S-bgl6为模板，使用上游引物W233D1和下游引物W233D2进行反向PCR反应。使用的上游引物W233D1和下游引物W233D2如下：上游引物W233D15′-TCGGACGACGGTGCGGTGCGCGACCGG-3′下游引物W233D25′-CGCACCGTCGTCCGACATCACGATGCC-3′PCR反应程序：第一步95℃3分钟；第二步进行30个循环，循环为98℃10秒，60℃15秒，68℃7分钟；第三步72℃10分钟。PCR产物使用1μLDpnI在37℃作用一个小时消解模板，然后使用氯化钙化学法转化到E.coliXL10-Gold感受态细胞中。转化产物克隆送交上海生物工程有限公司进行DNA测序分析确定正确的转化子。(3)β-葡萄糖苷酶突变体基因W233D的表达和纯化将含有W233D质粒的重组大肠杆菌XL10-Gold菌株接种到100mL含100μg/mL氨苄青霉素的LB培养基中，30℃振荡培养，待OD600为0.4-0.6时，加入终浓度为1mmol/L的IPTG，30℃诱导8小时。8000转离心10分钟，收集菌体，用8mL裂解缓冲液(50mmol/LNaH2PO4，300mmol/LNaCl，10mmol/L咪唑，pH8.0)重悬菌体，超声波破胞16分钟。12000转离心25分钟，取上清进行后面的蛋白质纯化。将上清与用1mL裂解缓冲液重悬的镍亲和填料混合放于灭菌的直形瓶内，封口膜封口，放于冰内在脱色摇床作用1小时。平衡后，将混合物灌入柱子中，排空溶液。加入预冷的洗涤缓冲液(pH8.0，20mmol/L咪唑，300mmol/LNaCl，50mmol/LNaH2PO4)洗涤，至液体排空。最后用500μL预冷的洗脱缓冲液(pH8.0，250mmol/L咪唑，300mmol/LNaCl，50mmol/LNaH2PO4)进行洗脱，收集洗脱液，进行SDS-PAGE分析，发现有一条明显的目的蛋白质条带。由图1可知，β-葡萄糖苷酶S-bgl6突变体W233D纯化物的分子量为82.5kDa。(4)β-葡萄糖苷酶突变体W233D的葡萄糖抑制常数Ki值的测定在最适反应条件下，分别测定在0、500、800mmol/L葡萄糖的条件下在0.8-10mmol/L之间不同浓度的pNPG为底物时W223D的酶活力。根据GraphPadprism5.0软件的竞争性抑制的方法计算W223D的葡萄糖抑制常数。突变前的β-葡萄糖苷酶S-bgl6也按照上述方法测定它的葡萄糖抑制常数Ki值。将获得的突变前的S-bgl6和突变后的W233D的葡萄糖抑制常数Ki值进行比较分析。结果如图2所示，β-葡萄糖苷酶S-bgl6的葡萄糖抑制常数Ki值是1.888mM，而突变体W233D的葡萄糖抑制常数Ki值是396.4mM，即β-葡萄糖苷酶突变体W233D的Ki是突变前S-bgl6的209.9倍，葡萄糖耐受性提高了208.9倍。当前第1页1 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