本发明涉及微生物活性物开发利用领域，具体涉及一株芽孢杆菌菌株的活性，以及发酵制备生物活性组分的工艺方法，及其产物在新药开发方面的应用。
背景技术：
微生物代谢产物的多样性使其成为新药发现的重要来源。临床上应用的药物约有30％来源于微生物，如广泛应用于临床的紫杉醇、放线菌素d、丝裂霉素c、喷司他汀等。目前世界药物市场上的抗生素产品主要来源于微生物。芽孢杆菌属是芽孢杆菌目芽孢杆菌科最大的一属，也是产生医用抗生素的三个主要来源之一。外界环境对微生物次生代谢产物的产生有很大的影响，不同的发酵培养条件可以产生不同结构，不同生物活性的化合物。为了得到更有价值的的活性物，必须对菌株和发酵条件进行摸索和研究。
因此，如何提供一种新的芽孢杆菌以及如何利用该芽孢杆菌生产细胞毒活性化合物是本领域技术人员亟待解决的技术问题。
技术实现要素：
本发明首次证明了该株芽孢杆菌代谢产物的细胞毒活性，并对其产生较强活性的发酵条件进行研究。利用生物质资源的可再生、易获得、成本低、无污染等特点，开展生物制药的研发。为实现上述目的，本发明的活性物制备方法包括以下步骤：
本发明一方面涉及一株能够产细胞毒活性物的芽孢杆菌，所述的芽孢杆菌保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)，保藏编号为cgmccno.12406。
本发明另一方面还涉及使用上述芽孢杆菌制备细胞毒活性物的应用，优选的，所述的细胞毒活性物对卤虫具有致死作用。
本发明另一方面涉及从芽孢杆菌hz16制备细胞毒活性物的方法，所述的方法包括如下步骤：
将纯化得到的芽孢杆菌hz16接种到培养基上，发酵后获得固体培养菌落，接种到摇瓶培养基发酵获得发酵液，将发酵获得的产物冷冻干燥除掉水分，用有机溶剂提取获得粗提物。
在本发明的一个优选实施方式中，所述培养基ph值为4-8或者为4、5、6、7、8。
在本发明的一个优选实施方式中，所述培养基为lb、复合培养基、pda、查氏、m2、m250％sw、高氏，优选为lb培养基。
在本发明的一个优选实施方式中，所述培养基配方为：
复合培养基(g/l)：氯化钙0.5，磷酸二氢钾(kh2po4)0.1，氯化钾(kcl)0.05，硫酸镁(mgso4)0.1，葡萄糖20.0，蛋白胨15。
pda培养基(g/l)：土豆200，葡萄糖200，1.1％琼脂。
查氏培养基(g/l):蔗糖30，nano33，k2hpo41，feso40.01，kcl0.5，mgso4·7h2o0.5。
m2培养基：麦芽提取物10，葡萄糖4，酵母提取物4。
m250％sw培养基：麦芽提取物10，葡萄糖4，酵母提取物4，柠檬酸铁0.05，nacl9.725，mgcl2·6h2o4.4，na2so41.72，cacl20.9，磷酸氢钠0.01，sio20.0075。
高氏培养基(g/l)：淀粉20，kno31，k2hpo40.5，mgso4·7h200.5，nacl0.5，feso4·7h2o0.01。
lb培养基(g/l)：胰蛋白胨10，酵母提取物5，nacl10。
在本发明的一个优选实施方式中，发酵温度为25、28、30、32摄氏度。
在本发明的一个优选实施方式中，发酵时间为1～5天。
在本发明的一个优选实施方式中，摇瓶培养静置、转速100、180、230r/min。
在本发明的一个优选实施方式中，有机溶剂使用二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇中的一种或者多种的组合，优选为乙酸乙酯。
本发明提供了一株具有卤虫致死活性的芽孢杆菌菌株以及通过该菌株发酵制备卤虫致死活性物的方法。利用生物质资源的可再生、易获得、成本低、无污染等特点，为开展生物制药的研发提供科学依据。
具体实施方式
为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明的优选实施方案进行详细说明。但是应当理解，这些描述只是为进一步说明本发明的特征和优点，而不是对本发明权利要求的限制。
微生物信息
芽孢杆菌hz16是由实验室中污染的军团菌平板上分离纯化得来，显示出特有的针对军团菌属的高选择活性，对所有被检测军团菌(l.pneumophilaphil.ljr32；l.pneumophilacorby；l.gormanii；l.dumoffii；l.micdadei；l.israelensis；l.jordanis；l.hackeliae；l.longbeachae)均显示出抑制活性，而军团菌属以外的其他革兰氏阳性菌(listeriamonocytogenes；bacillusmegaterium；streptococcuspneumoniae；staphylococcusaureus；mycobacteriumavium)及阴性菌(klebsiellaaerogenes；escherichiacolihb101；yersiniapseudotuberculosisypiii；pseudomonasaeruginosapao1；ralstoniaeutrophajmp134；burkholderiacepacialc21-3b；erwiniacarotovora；agrobacteriumtumefaciens；xanthomonascampestris；acinetobactersp.)的抑制活性太弱或未检出。
芽孢杆菌hz16保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为cgmccno.12406，保藏日期为2016年4月28日，分类命名为芽孢杆菌bacillussp.。
实施例1：
芽孢杆菌hz16中细胞毒活性物的制备方法按照如下步骤制备：
步骤一、在无菌条件下将纯化得到的芽孢杆菌hz16接种到ph为5的lb固体培养基上，在28摄氏度下培养1天培养获得白色的固体菌落；
步骤二、将固体菌种接种到装有150毫升ph为5的lb培养基的300毫升锥形瓶中；
步骤三、将接种好的摇瓶放置在生物培养箱中，在28摄氏度，180r/min的条件下培养1天基发酵获得发酵液；
步骤四、利用冷冻干燥技术除掉水分，对获得的固体干重进行比较；
步骤五、用有机溶剂乙酸乙酯提取获得粗提物，浓缩备用；
步骤六、将粗提物用dmso溶解制成0.1mg/ml的溶液进行卤虫致死实验评估细胞毒活性，其24小时致死率为100％，阳性对照100％，空白对照0％。
细胞毒活性测试(卤虫致死实验)
在浓度为2％的氯化钠溶液(ph8)中加入少量卤虫(artemiasalina)的休眠卵。在光照28℃条件下培养24h，得到孵化卤虫幼虫。将待测样品用dmso溶解并稀释到0.01，0.1，1mg/ml浓度进行卤虫致死试验。在24孔板的孔中放入人工孵化的游动的卤虫幼体约20个，加入990μl生理盐水，再加10μl样品的dmso溶液，控制总dmso浓度在1％以下。使用dmso溶液作为空白样品，放线菌素d(actinomycind)作为阳性对照进行活性检测。将24孔板放在28℃、光照条件下培养。分别在0h，4h，16h，24h后观察统计每个槽中死亡的卤虫个数，最后用以下公式计算致死率(m)，其中：m＝致死率；x＝24h时死亡总数；y＝24h时孔中的死亡总数；z＝在加入药剂之前的死亡数；n＝挑选用于测试的卤虫总数。
实施例2：
步骤一、在无菌条件下将纯化得到的芽孢杆菌hz16接种到ph为8的lb培养基上，在28摄氏度下培养1天培养获得白色的固体菌落；
步骤二、将固体菌丝接种到装有150毫升ph为8的m250％sw培养基的300毫升锥形瓶中；
步骤三、将接种好的摇瓶放置在生物培养箱中，在28摄氏度，200r/min的条件下培养4天基发酵获得发酵液；
步骤四、利用冷冻干燥技术除掉水分，对获得的固体干重进行比较；
步骤五、用有机溶剂乙酸乙酯提取获得粗提物，浓缩备用；
步骤六、将粗提物用dmso溶解制成0.1mg/ml的溶液进行卤虫致死实验评估细胞毒活性，其24小时致死率为66.7％，阳性对照100％，空白对照0％。
实施例3：
步骤一、在无菌条件下将纯化得到的芽孢杆菌hz16接种到ph为8的高氏培养基上，在28摄氏度下培养4天培养获得白色的固体菌落；
步骤二、将固体菌丝接种到装有150毫升ph为8的高氏培养基的300毫升锥形瓶中；
步骤三、将接种好的摇瓶放置在生物培养箱中，在28摄氏度，200r/min的条件下培养4天基发酵获得发酵液；
步骤四、利用冷冻干燥技术除掉水分，对获得的固体干重进行比较；
步骤五、用有机溶剂乙酸乙酯提取获得粗提物，浓缩备用；
步骤六、将粗提物用dmso溶解制成0.1mg/ml的溶液进行卤虫致死实验评估细胞毒活性，其24小时致死率为53％，阳性对照100％，空白对照0％。
实施例4：
步骤一、在无菌条件下将纯化得到的芽孢杆菌hz16接种到ph为8的高氏培养基上，在28摄氏度下培养4天培养获得白色的固体菌落；
步骤二、将固体菌丝接种到装有150毫升ph为8的高氏培养基的300毫升锥形瓶中；
步骤三、将接种好的摇瓶放置在生物培养箱中，在28摄氏度，200r/min的条件下培养4天基发酵获得发酵液；
步骤四、利用冷冻干燥技术除掉水分，对获得的固体干重进行比较；
步骤五、用有机溶剂乙酸乙酯提取获得粗提物，浓缩备用；
步骤六、将粗提物用dmso溶解制成0.1mg/ml的溶液进行卤虫致死实验评估细胞毒活性，其24小时致死率为88％，阳性对照100％，空白对照0％。
实施例5：
步骤一、在无菌条件下将纯化得到的芽孢杆菌hz16接种到ph为8的查氏培养基上，在28摄氏度下培养4天培养获得白色的固体菌落；
步骤二、将固体菌丝接种到装有150毫升ph为8的查氏培养基的300毫升锥形瓶中；
步骤三、将接种好的摇瓶放置在生物培养箱中，在28摄氏度，200r/min的条件下培养4天基发酵获得发酵液；
步骤四、利用冷冻干燥技术除掉水分，对获得的固体干重进行比较；
步骤五、用有机溶剂乙酸乙酯提取获得粗提物，浓缩备用；
步骤六、将粗提物用dmso溶解制成0.1mg/ml的溶液进行卤虫致死实验评估细胞毒活性，其24小时致死率为56.7％，阳性对照100％，空白对照0％。
实施例6：
步骤一、在无菌条件下将纯化得到的芽孢杆菌hz16接种到ph为8的lb培养基上，在28摄氏度下培养4天培养获得白色的固体菌落；
步骤二、将固体菌丝接种到装有150毫升ph为8的lb培养基的300毫升锥形瓶中；
步骤三、将接种好的摇瓶放置在生物培养箱中，在28摄氏度，200r/min的条件下培养4天基发酵获得发酵液；
步骤四、利用冷冻干燥技术除掉水分，对获得的固体干重进行比较；
步骤五、用有机溶剂乙酸乙酯提取获得粗提物，浓缩备用；
步骤六、将粗提物用dmso溶解制成0.1mg/ml的溶液进行卤虫致死实验评估细胞毒活性，其24小时致死率为81.7％，阳性对照100％，空白对照0％。
实施例7：
步骤一、在无菌条件下将纯化得到的芽孢杆菌hz16接种到ph为8的m2培养基上，在28摄氏度下培养4天培养获得白色的固体菌落；
步骤二、将固体菌丝接种到装有7升ph为8的m2培养基的发酵罐中；
步骤三、在28摄氏度，200r/min的条件下培养6天基发酵获得发酵液；
步骤四、每24小时取样一次，利用冷冻干燥技术除掉水分，对获得的固体干重进行比较；
步骤五、用有机溶剂乙酸乙酯提取获得粗提物，浓缩备用；
步骤六、将粗提物用dmso溶解制成0.01mg/ml的溶液进行卤虫致死实验评估细胞毒活性，其24小时卤虫致死率为24小时发酵产物10％；48小时产物13.3％；72小时产物11.7％；96小时产物16.7％；117小时产物25％；137小时产物25％，阳性对照100％，空白对照0％。
实施例8：
步骤一、在无菌条件下将纯化得到的芽孢杆菌hz16接种到ph为6的lb培养基上，在28摄氏度下培养2天培养获得白色的固体菌落；
步骤二、将固体菌丝接种到装有7升ph为6的lb培养基的发酵罐中；
步骤三、在28摄氏度，200r/min的条件下培养5天基发酵获得发酵液；
步骤四、每24小时取样一次，利用冷冻干燥技术除掉水分，对获得的固体干重进行比较；
步骤五、用有机溶剂乙酸乙酯提取获得粗提物，浓缩备用；
步骤六、将粗提物用dmso溶解制成0.1mg/ml的溶液进行卤虫致死实验评估细胞毒活性，其24小时卤虫致死率为24小时发酵产物100％；48小时产物100％；72小时产物97％；96小时产物88％；117小时产物77％，阳性对照100％，空白对照0％。
实施例9：
步骤一、在无菌条件下将纯化得到的芽孢杆菌hz16接种到ph为5的m2培养基上，在28摄氏度下培养1天培养获得白色的固体菌落；
步骤二、将固体菌丝接种到装有7升ph为8的m2培养基的发酵罐中；
步骤三、在28摄氏度，100r/min、200r/min、300r/min的转速下培养1天发酵获得发酵液；
步骤四、利用冷冻干燥技术除掉水分，对获得的固体干重进行比较；
步骤五、用有机溶剂乙酸乙酯提取获得粗提物，浓缩备用；
步骤六、将粗提物用dmso溶解制成0.1mg/ml的溶液进行卤虫致死实验评估细胞毒活性，其24小时致死率为100r/min55％；200r/min97％；300r/min78％，阳性对照100％，空白对照0％。
实施例10：
步骤一、在无菌条件下将纯化得到的芽孢杆菌hz16接种到ph为5的m2培养基上，在28摄氏度下培养1天培养获得白色的固体菌落；
步骤二、将固体菌丝接种到装有7升ph为8的m2培养基的发酵罐中；
步骤三、在28摄氏度，100r/min、200r/min、300r/min的转速下培养5天发酵获得发酵液；
步骤四、利用冷冻干燥技术除掉水分，对获得的固体干重进行比较；
步骤五、用有机溶剂乙酸乙酯提取获得粗提物，浓缩备用；
步骤六、将粗提物用dmso溶解制成0.1mg/ml的溶液进行卤虫致死实验评估细胞毒活性，其16小时致死率为100r/min48.3％；200r/min86.7％；300r/min80％，阳性对照100％，空白对照0％。
实施例11：
步骤一、在无菌条件下将纯化得到的芽孢杆菌hz16接种到ph为4、5、6、7、8的lb培养基上，在28摄氏度下培养1天培养获得白色的固体菌落；
步骤二、将固体菌丝接种到装有150毫升ph为6的lb培养基的300毫升锥形瓶中；
步骤三、将接种好的摇瓶放置在生物培养箱中，在28摄氏度，200r/min的条件下培养5天基发酵获得发酵液；
步骤四、利用冷冻干燥技术除掉水分，对获得的固体干重进行比较；
步骤五、用有机溶剂乙酸乙酯提取获得粗提物，浓缩备用；
步骤六、将粗提物用dmso溶解制成0.1mg/ml的溶液进行卤虫致死实验评估细胞毒活性，其24小时致死率为ph493.3％；ph583.3％；ph693.3％；ph783.3％；ph893.2％，阳性对照100％，空白对照0％。
实施例12：
步骤一、在无菌条件下将纯化得到的芽孢杆菌hz16接种到ph为5的lb培养基上，在28摄氏度下培养1天培养获得白色的固体菌落；
步骤二、将固体菌丝接种到装有150毫升ph为8的m2培养基的300毫升锥形瓶中；
步骤三、将接种好的摇瓶放置在生物培养箱中，在25、28、32摄氏度，200r/min的条件下培养2天基发酵获得发酵液；
步骤四、利用冷冻干燥技术除掉水分，对获得的固体干重进行比较；
步骤五、用有机溶剂乙酸乙酯提取获得粗提物，浓缩备用；
步骤六、将粗提物用dmso溶解制成0.1mg/ml的溶液进行卤虫致死实验评估细胞毒活性，其24小时致死率为25摄氏度65％；28摄氏度98.3％；32摄氏度71.7％，阳性对照100％，空白对照0％。
以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。