猪HOXA1基因的两个CDS区及其检测方法与流程

本发明属于生物遗传学领域，涉及猪HOXA1基因的两个CDS区及其检测方法。

背景技术：

HOXA1基因是HOX同源异型盒基因家族中的一员。HOX基因高度保守，在染色体上成簇排列，是脊椎动物生长发育和细胞分化的主控基因。其中，HOXA1基因在基因簇中的位置靠近染色体的3’端，是最早表达的HOX基因，主要调控体轴近端的发育。近年来研究发现此基因与癌症的发生密切相关。

人和小鼠的HOXA1基因均具有一个可变CDS区，而猪仅有一个预测的可变CDS区。在小鼠的参考基因组（GRCm38.p4）上，该基因的CDS区和可变CDS区分别有1011 bp和417 bp碱基，分别编码336和138个氨基酸；在人的参考基因组（GRCh38.p5）上，该基因的CDS区和可变CDS区分别有1008 bp和414 bp碱基，分别编码335和137个氨基酸；而在猪的基因组（Sscrofa10.2）上，该基因的CDS区含有1011 bp碱基，编码336个氨基酸，预测的CDS区含有417 bp碱基，编码138个氨基酸。

利用小鼠在体外进行HOXA1可变CDS区的研究发现，可变CDS区编码的短蛋白可以通过影响正常HOXA1与pbx的结合能力，从而最终影响正常HOXA1的功能。同样，人的HOXA1可变CDS区编码的蛋白可导致人罹患BSA和ABDS综合征。BSAS综合征患者表现为眼睛水平凝视障碍和智力发育迟缓等，ABDS综合征的患者常出现肺换气不足，这一疾病若不经过医学干预，对人将是致命的。

技术实现要素：

本发明的目的在于为研究HOXA1基因提供新的可变CDS区，进而用于HOXA1基因对生长发育和癌症发生的机理研究。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

猪的两个CDS区，第一个CDS区的序列如SEQ ID NO：2所示，共372bp，与猪HOXA1基因的CDS区，如SEQ ID NO：1所示的序列相比：第一个CDS区5’端第213-238位碱基缺失，缺失了26个碱基；5’端第253-271位碱基缺失，缺失了19个碱基；5’端第358-560位碱基缺失，缺失了203个碱基，共缺失248个碱基；第二个CDS区的序列如SEQ ID NO：3所示，共183bp，与猪HOXA1基因的CDS区如SEQ ID NO：1所示的序列相比：第二个CDS区5’端的第124-560位碱基缺失，共缺失437个碱基。

所述第一个CDS区翻译的蛋白序列如SEQ ID NO：5所示，与猪HOXA1蛋白质序列如SEQ ID NO：4所示相比，SEQ ID NO：5编码122个氨基酸，且只有前71个氨基酸与SEQ ID NO：4相同，从第72位氨基酸开始发生改变，第72-122位氨基酸变为如SEQ ID NO：9所示蛋白序列；第二个CDS区翻译的蛋白序列如SEQ ID NO：6所示，编码60个氨基酸，与猪HOXA1蛋白质序列如SEQ ID NO：4所示的序列相比，SEQ ID NO：6编码60个氨基酸，且只有前41个氨基酸与SEQ ID NO：4相同，从第42位氨基酸开始发生改变，第42-60位氨基酸变为SEQ ID NO：10。

猪HOXA1基因的两个CDS区的检测方法，所述检测方法为PCR反应，反应体系：300 ng猪基因组cDNA，2×Taq PCR Mix 7.5μL，正向引物40 pmol，反向引物40 pmol，加水补足15μL；反应程序：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，68-54 ℃每个循环降1℃ 40s，72 ℃ 1 min，14个循环；94 ℃ 30 s，55 ℃ 40 s，72 ℃ 1 min，共25个循环；最后在72 ℃延伸8 min。

所述检测方法中采用的正向引物如SEQ ID NO：7所示、反向引物如SEQ ID NO：8所示。

本发明的有益效果在于：本发明对猪肾脏组织cDNA的扩增HOXA1基因全长转录本时发现，存在除已预测过的CDS区之外的两种新的CDS区域。这两个新的CDS区可通过降低已有HOXA1蛋白与其辅因子pbx1的结合能力，从而降低HOXA1的靶基因HOXB1的转录水平，最终影响有机体的体轴骨骼、神经和内脏器官原基的分化发育和癌细胞的增生。即，这两个新的CDS区可在分子和细胞水平上，用于挖掘影响生长发育及癌症发生的基因网络，探究该网络内基因间的互作。

附图说明

图1为肾脏组织RNA电泳图；其中1-6泳道分别表示6个个体，M代表DNA ladder。

图2为肾脏cDNA的内参基因GAPDH的PCR扩增电泳图；其中PCR扩增的产物大小为205bp，1-2泳道分别表示2个个体，M表示DNA ladder。

图3为HOXA1基因的PCR凝胶电泳图。

图4为HOXA1基因第一种新的CDS区的测序图。

图5为HOXA1基因第二种新的CDS区的测序图。

具体实施方式

下面结合具体实施例，对本发明进行解释说明：

首先，利用Trizol提取猪肾脏组织的总RNA，提取结果如图1所示。取1ug RNA，利用Takara反转录试剂盒PrimeScript® 1st Strand cDNA Synthesis Kit，将RNA反转录为cDNA。利用内参基因GAPDH进行PCR扩增，检验cDNA的质量，扩增产物大小为205bp，扩增结果如图2所示。

其次，登陆网站Ensembl（http://asia.ensembl.org/index.html），下载猪HOXA1基因的全长转录本。利用软件Primer 3.0进行引物设计，正向引物如SEQ ID NO：7所示、反向引物如SEQ ID NO：8所示。15 μL的聚合酶链式反应（PCR）体系包括300 ng猪基因组cDNA，2×Taq PCR Mix 7.5μL，正反向引物各40 pmol，水5μL。引物的扩增条件为94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，68 ℃（每个循环减1 ℃）40s，72 ℃ 1 min，14个循环；94 ℃ 30 s，55 ℃ 40 s，72 ℃ 1 min，共25个循环；最后在72 ℃延伸8 min。PCR产物见图3，与正常HOXA1相比，含有已预测的CDS区、两种新CDS区的cDNA，分别比含有全长CDS区的cDNA短293bp和248bp、437bp。猪的两个CDS区，第一个CDS区的序列如SEQ ID NO：2所示，共372bp，与猪HOXA1基因的CDS区，如SEQ ID NO：1所示的序列相比：第一个CDS区5’端第213-238位碱基缺失，缺失了26个碱基；5’端第253-271位碱基缺失，缺失了19个碱基；5’端第358-560位碱基缺失，缺失了203个碱基，共缺失248个碱基；第二个CDS区的序列如SEQ ID NO：3所示，共183bp，与猪HOXA1基因的CDS区如SEQ ID NO：1所示的序列相比：第二个CDS区5’端的第124-560位碱基缺失，共缺失437个碱基。

所述第一个CDS区翻译的蛋白序列如SEQ ID NO：5所示，与猪HOXA1蛋白质序列如SEQ ID NO：4所示相比，SEQ ID NO：5编码122个氨基酸，且只有前71个氨基酸与SEQ ID NO：4相同，从第72位氨基酸开始发生改变，第72-122位氨基酸变为如SEQ ID NO：9所示蛋白序列；第二个CDS区翻译的蛋白序列如SEQ ID NO：6所示，编码60个氨基酸，与猪HOXA1蛋白质序列如SEQ ID NO：4所示的序列相比，SEQ ID NO：6编码60个氨基酸，且只有前41个氨基酸与SEQ ID NO：4相同，从第42位氨基酸开始发生改变，第42-60位氨基酸变为SEQ ID NO：10。

将PCR扩增的每条产物带分别进行割胶回收，回收后，连接质粒，进行克隆测序，。

第一种新CDS区的测序结果见图3。图3（A）的测序结果显示，与家猪基因组（Sscrofa10.2）上HOXA1的CDS区（1011个bp，如SEQ ID NO：1所示）相比，在5’端第213-238位碱基缺失、第253-271位碱基缺失；图3（B）的测序结果显示第358-560位碱基缺失，共缺失248个碱基。

第二种新CDS区的测序结果见图4。测序结果显示，与家猪基因组（Sscrofa10.2）上HOXA1的CDS区（1011 bp，如SEQ ID NO：1所示）相比，在5’端第124-560位碱基缺失，共缺失437个碱基。