一种Purα基因片段P4及其应用的制作方法

本发明属于生物技术领域，本发明公开了一种Purα基因片段P4及其应用。

背景技术：

Purα具有模体结构，它的中心部位为DNA结合区，含有三个1级重复序列和两个2级重复序列。其它比较显著的结构特征还包括N-端的富含甘氨酸区，一个“Psycho”模体区和C-端的富含谷氨酰胺和谷氨酸区。在整个进化过程中，Purα的DNA结合区域的序列是极其保守的。Purα几乎在所有后生动物组织中表达，它是一种多功能蛋白质，既能与DNA结合，也可以与RNA结合，在DNA复制起始、mRNA转录和蛋白质翻译等过程中都发挥着不同程度的作用。在神经元中，Purα可以转运并结合在mRNA上。Purα与病毒和细胞复制起始位点的DNA序列有着很密切的关系，由于复制和转录的起始需要双链DNA的解链，这比较符合Purα作为一种单链核酸结合蛋白，具有使DNA螺旋失稳的特点。此外，近来研究还发现，Purα在DNA损伤修复方面也发挥着一定的作用，这在维持神经系统基因组的稳定性方面有着一定的意义。

目前，现有技术中，构建与GFP蛋白融合表达的Purα突变体方面的研究还较少见。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服上述技术存在的缺陷，提供一种Purα基因片段P4及其应用，本发明在研究Purα蛋白不同结构域在功能发挥过程中的作用提供了有效模型。

其具体技术方案为：

一种Purα基因片段P4，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

本发明所述Purα基因片段P4在构建与GFP蛋白融合表达的Purα突变体过程中的应用。

进一步，所述Purα基因片段P4在构建与GFP蛋白融合表达的Purα突变体过程中的应用，包括以下步骤：

1.1引物的设计

根据Purα基因序列特点，利用基因重组技术，分别对这些Purα基因结构进行突变，将目的片段分别亚克隆到pEGFP-C1载体中，根据P4结构特点设计Purα缺失突变体，并设计相应的引物，在上游加入BamHI内切酶位点，下游加入EcoR I酶切位点，引物如下：

P4-F 5’-CGC GGA TCC ATG CTG AAG ATC GCC GAG GTG GGC GCG-3’

P4-R 5’-CCG GAA TTC TCA GCG CTT GTT GTC CAC AGT CAA GGA-3’

1.2扩增Purα突变体基因片段

根据下面的反应体系，对Purα突变体进行扩增，模板为实验室所保存的pEGFP-Purα质粒，PCR反应条件为：预变性阶段，温度95℃，时间5min；变性阶段，温度95℃，时间30s；退火阶段，温度69℃，时间45s，循环35次；延伸阶段，温度72℃，时间45s；总延伸阶段，温度72℃，时间10min；4℃下保存；反应体系具体为：

1.3PCR产物末端加A

向PCR扩增产物中加入1μl taq酶、1μl dATP和2μl Reaction buffer，72℃延伸30min；1.4PCR产物电泳

首先，配置1％琼脂糖凝胶，称取2g琼脂糖，将琼脂糖加入到200ml的1×TAE中，在微波炉中煮沸琼脂糖溶溶液，使液体变得澄清。室温下摇晃直至液体温度降到60℃左右，随后加入5μlEB，混匀后将液体倒到凝胶槽中，插上梳子，液体凝固后，轻轻地垂直拔出梳子并将凝胶放到电泳槽中，用微量移液器将PCR产物加到加样孔中，随后，100V电泳30min。电泳结束后，在紫外灯下切下目的片段并置于无DNA酶的EP管中；

1.5核酸凝胶产物回收

1)柱平衡：向CB2中加入500μl平衡液BL，12000rpm离心1min，弃流出液；

2)称量凝胶的净重量，向其中加入等倍体积溶液PC，0.1g加入100μl PC，充分混匀，50℃水浴锅中孵育30分钟，期间不断得摇动试管，直到凝胶块完全溶解；

3)将上一步所得溶液加入CB2结合柱中，室温静置2min后，以12000rpm离心1min，弃流出液；

4)向CB2中加入600μl漂洗液PW，12000rpm离心1min，弃流出液；

5)重复步骤4)；

6)将CB2放回收集管中，12000rpm空离2min，将吸附柱CB2置于室温下放置下5分钟，彻底晾干；

7)向CB2中加入不少于30μl EB，室温放置2min。12000rpm离心2min收集DNA溶液；1.6将纯化的目的片段连接到pEASY-T1克隆载体中

将纯化的PCR产物各4μl分别与1μl pEASY-T1mix试剂轻轻混合，16℃水浴反应过夜；1.7转化

(1)将过夜的连接产物加入到冰上融化的50μl DH5α感受态细胞中，轻弹混匀并置于冰上30min。42℃热激45秒，立即置于冰上冷却5分钟，使细胞周围的质粒被细胞包裹进去；(2)加入200μl室温下的LB液体培养基，37℃、200rpm振荡培养细菌1小时；

(3)取8μl，500mM IPTG、40μl，20mg/ml X-gal和50μl液体的LB培养基混合，用涂菌棒均匀地涂布于LB固体培养基上，室温下放置直至液体被固体培养基完全吸收，用于蓝斑筛选；

(4)待IPTG和X-gal被吸收后，取200μl菌液涂板，在37℃培养箱中倒置培养过夜。

(5)挑取白色单克隆菌斑到5ml液体LB培养基中，37℃摇床上培养过夜，用于提取质粒；1.8提取质粒

依据康为世纪公司的质粒快速提取试剂盒提取质粒；

1.9酶切鉴定

建立酶切体系，酶切体系的总体积20μl，酶切体系具体为：

小型离心机上瞬间离心，随后，37℃恒温水浴锅中孵育30min，酶切反应结束后进行琼脂糖凝胶电泳，并在紫外灯下用刀片切下目的片段，放在EP管中用于后续实验；

1.10切胶回收

(1)称取凝胶块的净重量，1g加入1ml Binding buffer，55-60℃水浴至胶完全溶解；

(2)将HiBind DNA柱子放入2ml收集管中；

(3)把DNA/凝胶混合液转入HiBind DNA柱子中，10000×g离心1min；

(4)重复步骤3直至混合液完全通过HiBind DNA柱子；

(5)向HiBind DNA柱子中加入300μl Binding buffer，10000×g离心1min；

(6)向HiBind DNA柱子中加入700μl SPW Wash buffer，10000×g离心1min；

(7)重复步骤(6)；

(8)弃去流出液，将HiBind DNA柱重新放回收集管中，10000×g离心2分钟，倒掉废液，将吸附柱置于室温下数分钟，以彻底晾干；

(9)将HiBind DNA柱置于一个新的离心管中，向吸附膜的中间部位加入30-50μl 65℃预热的Elution Buffer，室温放置2-5分钟，以>13000×g离心2分钟来洗脱DNA；

1.11连接

将纯化的Purα突变体分别与双酶切的pEGFP-C1载体进行连接重组，16℃水浴连接过夜，连接反应体系具体为：

1.12转化

将5μl连接产物加入50μl DH5α感受态细胞中，轻弹混匀，冰浴30min，42℃热激60秒，立即置于冰上5分钟，加入500μl平衡到室温的LB液体培养基，200rpm、37℃摇床上孵育1小时，将培养液300rpm离心5s，弃去部分上清，余下200μl菌液用微量移液器吹打重悬，涂在含卡那霉素的LB固体培养基上，37℃培养箱中先正置培养20min，然后倒置培养过夜，第二天，挑取白色单克隆菌斑到5ml含抗生素的LB液体培养基中，37℃摇床上培养过夜，培养的菌液用于质粒提取；

1.13质粒提取

(1)从培养板上挑取单克隆并放入10-15ml含卡那霉素的LB液体培养基中，37℃恒温摇床200rpm培养12-16h；

(2)取10-15ml菌液以5000×g，室温下离心10min，弃去上清；

(3)向沉淀中加入500μl Solution I/RNase A混合液，涡旋振荡重悬细菌；

(4)将悬液转移到一个2ml离心管中并加入500μl Solution II，轻轻颠倒试管数次以得到澄清的裂解液；

(5)再向离心管中加入700μl Solution III并立即轻轻颠倒试管数次，直至形成白色絮状沉淀；

(6)室温下，以>13000×g离心10min；

(7)将Miniprep Column II柱子放入2ml收集管中，将步骤(6)得到的上清轻轻转移到HiBand DNA柱中，室温下，以10000×g离心1min；

(8)弃去流出液，并向Miniprep Column II柱子中加入700μl DNA Wash Buffer。室温下，以10000×g离心1min；

(9)弃去流出液，将Miniprep Column II柱子放入2ml收集管中，室温下，以≥13000×g离心2-3min来干燥柱子；

(10)将Miniprep Column II柱子放入一个干净的1.5ml离心管中，加入80-100μlElution Buffer。室温下静置1-2min，室温下，以≥13000×g离心1min来洗脱质粒；

1.14酶切鉴定

提取质粒后，用NanodroP4000/2000C分光光度计测量质粒浓度，然后取1μg进行酶切鉴定，酶切鉴定体系具体为：

将酶切鉴定为阳性克隆质粒送上海金唯智公司测序，测序引物为pEGFP-5’。

进一步，所述EB在65-70℃水浴预热。

进一步，所述液体LB培养基中含抗生素。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

本发明真核表达pCDNA3.0载体上的Purα的基因片段，可以转染该质粒到需要的研究细胞系中，通过蛋白免疫印迹实验来探讨Purα蛋白不同结构域对目的基因的作用。pEGFP-C1载体上的Purα基因片段与绿色荧光蛋白GFP融合表达，可以在荧光显微镜下观察Purα蛋白在细胞内的分布情况，同时也可以通过GFP蛋白的表达水平来量化Purα不同结构域蛋白在细胞内的表达水平。同时，原核表达载体pGEX上的Purα蛋白基因片段可以在体外研究Purα蛋白不同结构域对目的基因的作用。

附图说明

图1是Purα蛋白结构示意图；

图2是pCDNA3.0-P4的酶切鉴定图；

图3是pEGFP-P4的酶切鉴定图；

图4是GST-P4的酶切鉴定图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明的技术方案作进一步详细地说明。

一种Purα基因片段P4，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

本发明所述Purα基因片段P4在构建与GFP蛋白融合表达的Purα突变体过程中的应用。

进一步，所述Purα基因片段P4在构建与GFP蛋白融合表达的Purα突变体过程中的应用，包括以下步骤：

1.1引物的设计

Purα的蛋白质结构包括三大部分:N-端的富含甘氨酸区域；C-端的psycho模体和富含谷氨酰胺和谷氨酸区域以及中央的DNA结合区域。它的DNA结合区域包含3个class I和2个class II重复序列，分别位于66-88、102-131、148-170、188-120和224-246位氨基酸区域，如图1所示。

根据Purα基因序列特点，利用基因重组技术，分别对这些Purα基因结构进行突变，将目的片段分别亚克隆到pEGFP-C1载体中，根据P4结构特点设计Purα缺失突变体，如表1所示，并设计相应的引物，在上游加入BamHI内切酶位点，下游加入EcoR I酶切位点，引物如下：

P4-F 5’-CGC GGA TCC ATG CTG AAG ATC GCC GAG GTG GGC GCG-3’

P4-R 5’-CCG GAA TTC TCA GCG CTT GTT GTC CAC AGT CAA GGA-3’

表1 Purα缺失突变

1.2扩增Purα突变体基因片段

根据下面的反应体系，对Purα突变体进行扩增，模板为实验室所保存的pEGFP-Purα质粒，PCR反应条件为：预变性阶段，温度95℃，时间5min；变性阶段，温度95℃，时间30s；退火阶段，温度69℃，时间45s，循环35次；延伸阶段，温度72℃，时间45s；总延伸阶段，温度72℃，时间10min；4℃下保存；反应体系具体为：

1.3PCR产物末端加A

向PCR扩增产物中加入1μl taq酶、1μl dATP和2μl Reaction buffer，72℃延伸30min；

1.4PCR产物电泳

首先，配置1％琼脂糖凝胶，称取2g琼脂糖，将琼脂糖加入到200ml的1×TAE中，在微波炉中煮沸琼脂糖溶溶液，使液体变得澄清。室温下摇晃直至液体温度降到60℃左右，随后加入5μlEB，混匀后将液体倒到凝胶槽中，插上梳子，液体凝固后，轻轻地垂直拔出梳子并将凝胶放到电泳槽中，用微量移液器将PCR产物加到加样孔中，随后，100V电泳30min。电泳结束后，在紫外灯下切下目的片段并置于无DNA酶的EP管中；

1.5核酸凝胶产物回收

1)柱平衡：向CB2中加入500μl平衡液BL，12000rpm离心1min，弃流出液；

2)称量凝胶的净重量，向其中加入等倍体积溶液PC，0.1g加入100μl PC，充分混匀，50℃水浴锅中孵育30分钟，期间不断得摇动试管，直到凝胶块完全溶解；

3)将上一步所得溶液加入CB2结合柱中，室温静置2min后，以12000rpm离心1min，弃流出液；

4)向CB2中加入600μl漂洗液PW，12000rpm离心1min，弃流出液；

5)重复步骤4)；

6)将CB2放回收集管中，12000rpm空离2min，将吸附柱CB2置于室温下放置下5分钟，彻底晾干；

7)向CB2中加入不少于30μl EB，室温放置2min。12000rpm离心2min收集DNA溶液；

1.6将纯化的目的片段连接到pEASY-T1克隆载体中

将纯化的PCR产物各4μl分别与1μl pEASY-T1mix试剂轻轻混合，16℃水浴反应过夜；

1.7转化

(1)将过夜的连接产物加入到冰上融化的50μl DH5α感受态细胞中，轻弹混匀并置于冰上

30min。42℃热激45秒，立即置于冰上冷却5分钟，使细胞周围的质粒被细胞包裹进去；

(2)加入200μl室温下的LB液体培养基，37℃、200rpm振荡培养细菌1小时；

(3)取8μl，500mM IPTG、40μl，20mg/ml X-gal和50μl液体的LB培养基混合，用涂菌棒均匀地涂布于LB固体培养基上，室温下放置直至液体被固体培养基完全吸收，用于蓝斑筛选；

(4)待IPTG和X-gal被吸收后，取200μl菌液涂板，在37℃培养箱中倒置培养过夜。

(5)挑取白色单克隆菌斑到5ml液体LB培养基中，37℃摇床上培养过夜，用于提取质粒；

1.8提取质粒

依据康为世纪公司的质粒快速提取试剂盒提取质粒；

1.9酶切鉴定

建立酶切体系，酶切体系的总体积20μl，酶切体系具体为：

小型离心机上瞬间离心，随后，37℃恒温水浴锅中孵育30min，酶切反应结束后进行琼脂糖凝胶电泳，并在紫外灯下用刀片切下目的片段，放在EP管中用于后续实验；

1.10切胶回收

(1)称取凝胶块的净重量，1g加入1ml Binding buffer，55-60℃水浴至胶完全溶解；

(2)将HiBind DNA柱子放入2ml收集管中；

(3)把DNA/凝胶混合液转入HiBind DNA柱子中，10000×g离心1min；

(4)重复步骤3直至混合液完全通过HiBind DNA柱子；

(5)向HiBind DNA柱子中加入300μl Binding buffer，10000×g离心1min；

(6)向HiBind DNA柱子中加入700μl SPW Wash buffer，10000×g离心1min；

(7)重复步骤(6)；

(8)弃去流出液，将HiBind DNA柱重新放回收集管中，10000×g离心2分钟，倒掉废液，将吸附柱置于室温下数分钟，以彻底晾干；

(9)将HiBind DNA柱置于一个新的离心管中，向吸附膜的中间部位加入30-50μl 65℃预热的Elution Buffer，室温放置2-5分钟，以>13000×g离心2分钟来洗脱DNA；

1.11连接

将纯化的Purα突变体分别与双酶切的pEGFP-C1载体进行连接重组，16℃水浴连接过夜，连接反应体系具体为：

1.12转化

将5μl连接产物加入50μl DH5α感受态细胞中，轻弹混匀，冰浴30min，42℃热激60秒，立即置于冰上5分钟，加入500μl平衡到室温的LB液体培养基，200rpm、37℃摇床上孵育1小时，将培养液300rpm离心5s，弃去部分上清，余下200μl菌液用微量移液器吹打重悬，涂在含卡那霉素的LB固体培养基上，37℃培养箱中先正置培养20min，然后倒置培养过夜，第二天，挑取白色单克隆菌斑到5ml含抗生素的LB液体培养基中，37℃摇床上培养过夜，培养的菌液用于质粒提取；

1.13质粒提取

(1)从培养板上挑取单克隆并放入10-15ml含卡那霉素的LB液体培养基中，37℃恒温摇床200rpm培养12-16h；

(2)取10-15ml菌液以5000×g，室温下离心10min，弃去上清；

(3)向沉淀中加入500μl Solution I/RNase A混合液，涡旋振荡重悬细菌；

(4)将悬液转移到一个2ml离心管中并加入500μl Solution II，轻轻颠倒试管数次以得到澄清的裂解液；

(5)再向离心管中加入700μl Solution III并立即轻轻颠倒试管数次，直至形成白色絮状沉淀；

(6)室温下，以>13000×g离心10min；

(7)将Miniprep Column II柱子放入2ml收集管中，将步骤(6)得到的上清轻轻转移到HiBand DNA柱中，室温下，以10000×g离心1min；

(8)弃去流出液，并向Miniprep Column II柱子中加入700μl DNA Wash Buffer。室温下，以10000×g离心1min；

(9)弃去流出液，将Miniprep Column II柱子放入2ml收集管中，室温下，以≥13000×g离心2-3min来干燥柱子；

(10)将Miniprep Column II柱子放入一个干净的1.5ml离心管中，加入80-100μlElution Buffer。室温下静置1-2min，室温下，以≥13000×g离心1min来洗脱质粒；

1.14酶切鉴定

提取质粒后，用NanodroP4000/2000C分光光度计测量质粒浓度，然后取1μg进行酶切鉴定，酶切鉴定体系具体为：

将酶切鉴定为阳性克隆质粒送上海金唯智公司测序，测序引物为pEGFP-5’。

所述EB在65-70℃水浴预热。

所述液体LB培养基中含抗生素。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，本发明的保护范围不限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可显而易见地得到的技术方案的简单变化或等效替换均落入本发明的保护范围内。