一种基于热诱导miR30‑shRNA敲低鱼类基因表达的方法与流程

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种基于热诱导miR30-shRNA敲低鱼类基因表达的方法。

背景技术：

DNA碱基切除修复(BER)通路主要监测并修复活性氧、烷化剂及电离辐射诱发的DNA碱基损伤。BER通路包含多步酶促反应，涉及多种DNA修复蛋白。该通路主要分为3个步骤：(1)DNA N-糖基化酶识别受损碱基，使异常嘌呤的N5和异常嘧啶的N3与脱氧核糖之间的化学键发生水解，在DNA链上形成脱嘌呤/脱嘧啶位点(AP)；(2)AP核酸内切酶(APEX1)在AP位点上游切开缺口，使一端成为5’-磷酸基，另一端成为3’-羟基；(3)DNA多聚酶重新合成正确的碱基，最后由连接酶将其连接。Apex1在BER通路中的作用是形成脱嘌呤/脱嘧啶位点，是BER的主要限速酶，对维护DNA碱基切除修复能力起关键作用。BER通路的破坏可能导致肿瘤的发生和神经退化紊乱，BER通路通过转化不同的损伤碱基为一种常见的中间体的脱嘌呤/嘧啶(AP)位点，然后Apex1基因通过特有的DNA修复通路发挥作用。

目前鱼类上有效敲低目的基因的技术主要依赖于反义Morpholino技术，但是由于注射Morpholino降解作用只能暂时性的抑制目的基因的表达，因此局限于鱼类早期胚胎发育研究。虽然有报道直接利用siRNA特异性敲低鱼类目的基因的表达，在实际应用中的有效敲除靶基因的成功率较少。

自20世纪末RNA干扰现象(RNA interference，RNAi)及其作用机制被发现以来，外源性siRNA干扰技术已被广泛应用于基础研究及临床实践的多个领域，如功能基因组学、信号通路分析、药物靶点筛选。同时，其在转基因斑马鱼的基因功能研究中也有很大潜力。例如，Dodd等设计了斑马鱼dystrophin基因的siRNA，成功地干扰了斑马鱼dystrophin基因的表达。该实验证明此技术可以应用在构建基因沉默的脊椎动物模型中(Dodd A,Chambers SP,Love DR.FEBS Lett.2004,561:89–93.)；Acosta等设计了斑马鱼myostatin基因的siRNA，并将其注入斑马鱼受精卵，也成功地干扰了myostatin的表达(Acosta J,Carpio Y,Borroto I,et al.J Biotechnol.2005,119:324-331.)。但是最近的研究表明，用于斑马鱼上的siRNA或shRNA敲低研究技术存在某些结果不能重复或效果不佳的问题(Kelly A, Hurlstone AF.Brief Funct Genomics.2011,10:189-196.)。

技术实现要素：

为了克服现有技术中所存在的问题，本发明的目的在于提供一种基于热诱导miR30-shRNA敲低鱼类基因表达的方法。

为了实现上述目的以及其他相关目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一方面，提供了一种利用miR30引导的干扰机制敲低鱼类基因表达的方法，所述方法包括：

(1)提供干扰载体，所述干扰载体包括：热激启动子HSP70和miR30干扰序列；

(2)构建重组载体：将目的基因干扰序列插入步骤(1)所得干扰载体，获得重组载体；

(3)将步骤(2)所得重组载体注射入鱼的受精卵，进行热诱导培养，以敲低目的基因表达。

优选地，步骤(1)中，所述热激启动子HSP70含有如SEQ ID NO.4所示的序列。

优选地，步骤(1)中，热激启动子HSP70和miR30干扰序列由5’端到3’端依次排布。

优选地，步骤(1)中，所述干扰载体还含有可被检测的标记物的核苷酸序列。

所述可被检测的标记物的核苷酸序列与目的基因干扰序列插入区相连。

较优的，所述可被检测的标记物如绿色荧光蛋白(eGFP)。

优选地，步骤(1)中，所述干扰载体含有如SEQ ID NO.5所示的序列。

优选地，步骤(2)中，所述目的基因为鱼类基因。

优选地，步骤(2)中，插入的目的基因干扰序列与miR30干扰序列连接。

更优选地，插入的目的基因干扰序列连接于miR30干扰序列的3’端。

优选地，步骤(2)中，所述目的基因干扰序列为shRNA，所述shRNA中含有能够在严紧条件下与目的基因杂交的核苷酸序列。

进一步的，所述shRNA包括正义链片段和反义链片段，以及连接所述正义链片段和反义链片段的茎环结构，所述正义链片段和所述反义链片段的序列互补，并且所述正义链片段的序列与目的基因中15-27个连续的核苷酸序列基本相同。所述shRNA经加工后可成为小干扰RNA(siRNA)进而起到特异性沉默目的基因表达的作用。

更一步的，所述shRNA包括正义链片段和反义链片段，以及连接所述正义链片段和反义链片段的茎环结构，所述正义链片段和所述反义链片段的序列互补，并且所述正义链片段的序列与目的基因中的靶序列基本相同。

较佳的，所述正义链片段与目的基因中19-23个连续的核苷酸序列基本相同；更佳的，所述正义链片段与目的基因中19、20或者21个连续的核苷酸序列基本相同。

进一步的，所述shRNA的茎环结构的序列可选自以下任一：UUCAAGAGA、AUG、CCC、UUCG、CCACC、CUCGAG、AAGCUU和CCACACC。

shRNA经酶切加工后可成为siRNA，进而起到敲低目的基因特异性表达的作用。

本发明的一优选实施例中，所述目的基因为Apex1基因。Apex1基因中的靶序列含有如SEQ ID NO:2所示的打靶序列。

本发明实施例具体列举了以pISceI-HSP70-eGFP为干扰载体构建的Apex1基因干扰重组载体，命名为pISceI-HSP70-miR30-Apex1-eGFP。

进一步地，所述Apex1基因来源于斑马鱼。

优选地，步骤(3)中，所述注射采用显微注射法。

优选地，步骤(3)中，所述热诱导培养包括：将注射完成的受精卵在26℃-29℃条件下孵育，然后再将受精卵在37℃条件下进行热激诱导，然后再将受精卵重新放入26℃-29℃条件下培育。

进一步优选地，将注射完成的受精卵在26℃-29℃条件下孵育24h。

进一步优选地，将受精卵在37℃条件下热激诱导1h。

进一步优选地，将受精卵重新放入26℃-29℃条件下培育6h。

本发明的第二方面，提供了一种用于敲低鱼类基因表达的干扰载体，所述干扰载体包括：热激启动子HSP70和miR30干扰序列。

优选地，所述热激启动子HSP70含有如SEQ ID NO.4所示的序列。

优选地，所述干扰载体还含有可被检测的标记物的核苷酸序列。较优的，所述可被检测的标记物如绿色荧光蛋白(eGFP)。

优选地，所述干扰载体含有如SEQ ID NO.5所示的序列。

本发明的第三方面提供一种用于敲低鱼类基因表达的试剂盒，所述试剂盒中包括：前述用于敲低鱼类基因表达的干扰载体。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

针对现有技术中，用于斑马鱼上的siRNA或shRNA敲低研究技术存在某些结果不能重复或效果不佳的问题，本发明采用miR30介导的shRNA基因敲低系统，构建相应的RNAi载体，通过引进热诱导调控技术，实现在热激诱导条件下控制靶基因的表达水平。结果表明，靶序如SEQ ID NO.1所示的miR30Apex1shRNA载体能够实现热激诱导性敲除Apex1基因表达，显著下调Apex1基因的表达。

附图说明

图1是表达载体质粒的结构示意图。

图2是热激后培育6h斑马鱼荧光情况，说明在培育6h后斑马鱼全身有明显荧光，在头部荧光最强。质粒含有可被检测的标记物如绿色荧光蛋白(eGFP)，理论上成功敲低斑马鱼胚胎Apex1基因后，标记荧光会在斑马鱼胚胎上显示。

具体实施方式

在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件，或者按照各制造商所建议的条件。

当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。

除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见Sambrook等MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，Second edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989and Third edition，2001；Ausubel等，CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY，John Wiley&Sons，New York，1987and periodic updates；the series METHODS IN ENZYMOLOGY，Academic Press，San Diego；Wolffe，CHROMATIN STRUCTURE AND FUNCTION，Third edition，Academic Press，San Diego，1998；METHODS IN ENZYMOLOGY，Vol.304，Chromatin(P.M.Wassarman and A.P.Wolffe，eds.)，Academic Press，San Diego，1999；和METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY，Vol.119，Chromatin Protocols(P.B.Becker，ed.)Humana Press，Totowa，1999等。

实施例

从数据库中调取斑马鱼Apex1基因信息，斑马鱼Apex1基因的ORF序列如SEQ ID NO.1。

设计针对Apex1基因的有效的siRNA靶点。靶向于Apex1基因的有效siRNA靶点序列含有如SEQ ID NO.2所示的序列。

如SEQ ID NO.2所示的序列具体为：GGAGAGGCTGACAATGGAA。

本实施例利用miR30干扰序列构建了以热激启动子HSP70调节下游基因表达的序列载体(pISceI-HSP70-miR30-Apex1-eGFP)。

首先，体外合成一段单链的部分miR30干扰序列和一条单链的shApex1，通过退火获得插入目的片段miR30-Apex1，目的片段两端带有BbsI酶切位点。所述插入目的片段miR30-Apex1含有如SEQ ID NO.3所示的序列。如SEQ ID NO.3所示的序列具体为：5-GGCTAGCATGACCAGGATTAGAAATCAGGAAACTCCTGGTGCACATGATGGAGGAGTTTCCTGATTTCTTCC TGGTCA-3。

制备载体片段：将质粒pISceI-HSP70-miR30-eGFP进行BbsI酶切。酶切体系：10xGreen Buffer 5μl、质粒DNA 0.7μl、BbsI2.5μl、加水补足至50μl。酶切完成后，将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳回收片段(HSP70-miR30-eGFP)得到质粒载体片段。

用T4DNA连接酶将所得质粒载体片段与目的片段37℃连接过夜，获得重组质粒(pISceI-HSP70-miR30-Apex1-eGFP)。反应体系：质粒载体片段0.7μl，目的片段3μl，10xBuffer 2μl，T4DNAligase 1μl，加水补足20μl。

重组质粒(pISceI-HSP70-miR30-Apex1-eGFP)中，热激启动子HSP70含有如SEQ ID NO.4所示的序列。

重组质粒(pISceI-HSP70-miR30-Apex1-eGFP)中，除目的基因干扰序列Apex1以外的序列含有如SEQ ID NO.5所示的序列。

斑马鱼受精卵的获取：数量2：1的亲本野生雌雄鱼放入交配盒中隔离培养，交配盒置于26～29℃恒温环境中进行黑暗过夜培养，光周期为白昼14h、黑暗10h。培养结束混合雌雄鱼，将底部有栅栏的内层交配盒倾斜放置在外层交配盒上并置于26℃-29℃恒温水域中， 待亲鱼产卵，亲鱼产卵25min～35min后，挑选收集交配盒底部的受精卵。

利用显微注射仪并参照显微注射法将得到的重组质粒注射入斑马鱼受精卵，将受精卵移入平铺琼脂糖的培养皿中；外源DNA的注射体积为0.5μL(0.4μg/μL)，I-SceⅠ酶0.6μL、酚红0.25μl，加水至总体积5μl，取0.6μl注入玻璃毛细管中，随即将其置入微型注射仪(Eppendorf AG Germany)中，注射后将受精卵放入装有恒温灭菌水的培养皿中，进行26℃-29℃恒温培养。

将注射完成的受精卵在26℃-29℃恒温灭菌水中培育24h后将受精卵收集装于无菌试管中，37℃恒温水浴锅热浴1h后，重新放入26℃-29℃恒温杀菌水中培育6h检测绿色荧光蛋白基因的表达效果，挑选有荧光的斑马鱼胚胎进行后续荧光定量PCR检测。

收集好的受精卵要及时冻藏以备提取RNA，进行逆转录时采用Takara逆转录试剂盒，反应条件为37℃ 15min，85℃ 5sec，4℃保存，获得的cDNA模板用于检测斑马鱼胚胎中Apex1基因是否被敲低。

结果表明，检测斑马鱼胚胎中Apex1基因被成功敲低，且敲除方法重复性好，效果佳。

以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，当可利用以上所揭示的技术内容而做出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对上述实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。