一种Gα基因过表达慢病毒载体、慢病毒及其构建方法与流程

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种Gα基因过表达慢病毒载体、Gα慢病毒及其构建方法。

背景技术：

味觉功能学研究表明，甜味主要由味觉细胞的G蛋白偶联受体(G protein coupled receptors，GPCRs)家族所介导，即味觉受体第1家族(taste receptor family 1 members，T1Rs)。其中T1R2和T1R3是甜味受体，它们以T1R2+ T1R3异二聚体的形式发挥作用，共同对甜味进行识别。甜味受体在结合配体后，下游G蛋白被激活，其α亚基与β、γ亚基分离，Gα亚基进入胞浆进而激活下游效应器，最终导致细胞内钙离子浓度升高。因此，通过构建共表达T1R2、T1R3和Gα基因的细胞系，可用钙流检测方法对甜味物质进行识别。

构建共表达人T1R2、T1R3和Gα基因的细胞系，需要使用到带有人Gα基因的过表达载体。现有的方法采用的是将整合有Gα基因的质粒载体通过脂质体对宿主细胞进行转染，但是脂质体转染质粒载体的转染效率较低，要构建能稳定共表达T1R2、T1R3和Gα三种基因的细胞系成功率也较低。因此，如何提高Gα基因过表达载体的转染效率是目前亟需解决的问题。

技术实现要素：

本发明的目的是为了解决现有技术的不足，提供一种Gα基因过表达慢病毒载体、Gα慢病毒及其构建方法，该方法所构建的慢病毒载体，转染效率高，并能将Gα基因整合到宿主细胞的基因组中，因此能特异、持续、高效地促进Gα基因在宿主细胞中的稳定表达。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

一种Gα基因过表达慢病毒载体，以慢病毒pLVX-IRES-mCherry慢病毒表达载体为基础进行构建，并整合有Gα基因，得到Gα基因过表达慢病毒载体pLVX-IRES-mCherry-Gα。

本发明还提供pLVX-IRES-mCherry-Gα慢病毒表达载体的构建方法，包括如下步骤：

步骤（1），人工合成Gα基因；

步骤（2），以下列PCR扩增引物进行Gα基因的PCR 扩增：

所述的PCR扩增引物为：

Gα-F：agattctagagctagcaccaccatggatggcccgctcgctg；

Gα-R：agatccttgcggccgctcagaagagcccacagtc；

步骤（3），用限制性内切酶EcoRI和BamHI分别对Gα基因的PCR 产物和慢病毒载体pLVX-IRES-mCherry进行双酶切；

步骤（4），用T4 DNA连接酶将酶切的得到的线性化的Gα基因和慢病毒载体连接，将得到的连接液转化DH5α感受态细胞，并进行PCR鉴定，对PCR鉴定阳性的克隆进行测序和比对，比对正确的克隆即为构建成功的Gα基因过表达慢病毒载体pLVX-IRES-mCherry-Gα；

其中，步骤（4）PCR鉴定采用的PCR扩增引物与步骤（2）所采用的PCR扩增引物相同。

步骤（4）测序所用引物为：

CMV-F：cgcaaatgggcggtaggcgtg；

IRES-R：cctcacattgccaaaagacg。

本发明另外提供一种Gα慢病毒的构建方法，采用上述Gα基因过表达慢病毒载体，方法是：使用慢病毒包装质粒pRSV-Rev、pMDLg-pRRE和pMD2.G对Gα基因过表达慢病毒载体pLVX-IRES-mCherry-Gα进行包装。，通过转染HEK293细胞，得到Gα慢病毒。

本发明还要求保护上述Gα慢病毒的构建方法构建得到的Gα慢病毒。

本发明与现有技术相比，其有益效果为：

本发明所构建的Gα基因过表达慢病毒载体对宿主细胞的转染效率高达80%~90%，比起现有的质粒转染法转染效率提高了1倍以上。此外由于慢病毒能将Gα基因整合到宿主细胞的基因组中，因此使用该方法能特异、持续、高效地促进基因Gα在宿主细胞中的稳定表达。过表达Gα基因的细胞可用于构建共表达T1R2、T1R3和Gα基因的细胞系，可用钙流检测方法对甜味物质进行识别。

附图说明

图1是pLVX-IRES-mCherry慢病毒表达载体图谱；

图2是pRSV-Rev慢病毒包装质粒图谱；

图3是pMDLg-pRRE慢病毒包装质粒图谱；

图4是pMD2.G慢病毒包装质粒图谱。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的详细描述。

本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过购买获得的常规产品。

主要实验试剂及厂家：

大肠杆菌菌株DH5α（Invitrogen）

胎牛血清FBS（Invitrogen）

胰蛋白酶（Invitrogen）

DMEM完全培养基（含10%FBS、100U/mL青霉素和100µg/mL链霉素）（Invitrogen）

限制性内切酶（Fermentas）

T4 DNA连接酶（NEB公司）

质粒DNA提取试剂盒（Axygen公司）

制备感受态试剂盒（BIOSCIENCES）

PrimeSTAR Max Premix(2X) （Takara）

逆转录酶MuLV（NEB）

RNase 抑制剂（NEB）

Maxima® SYBR Green qPCR Master Mix (2X) （Thermo Scientific）

pLVX-IRES-mCherry、pRSV-Rev、pMDLg-pRRE和pMD2.G，均可商购于上海比昂生物医药科技有限公司。

实施例1：Gα基因过表达慢病毒载体构建。

1、人工合成Gα基因，其DNA如SEQ ID NO.1所示。

2、使用PrimeSTAR高保真酶，以人工合成的Gα基因为模板，通过如表1所示引物进行的PCR 扩增：

表1

PCR反应体系与条件如表2：

表2

PCR程序如表3：

表3

3、琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物大小是否与预期一致，切割在琼脂糖凝胶电泳胶中的目的片段条带，用DNA回收试剂盒回收纯化；

4、用EcoRI和BamHI 限制性内切酶分别对Gα基因的PCR 产物和慢病毒表达载体pLVX-IRES-mCherry进行双酶切（于37℃酶切3h），反应体系和反应条件如表4：

表4

5、琼脂糖凝胶电泳检测酶切效果，切割在琼脂糖凝胶电泳胶中的Gα基因片段条带和线性化的慢病毒载体，用胶回收试剂盒回收DNA；

6、用T4 DNA连接酶于16℃水浴下，将两种酶切产物进行连接，过夜。反应如表5：

表5

7、转化感受态细胞：

从-80℃冰箱取出1管100μL DH5α感受态细胞，放冰上解冻（解冻至无冰状态）后取10μL 上述步骤6中的连接产物加到感受态细胞中混匀，静置30min，42℃水浴热激1min，冰上静置2min。加LB液体培养基500μL，37℃振荡培养1小时。3000rpm 离心5min，留100μl左右上清液混匀细菌后涂到LB平板上，37℃倒置培养过夜。

8、挑取数个菌落，做菌落PCR检测转化子，反应体系和条件见步骤2；

9、将菌落PCR鉴定得到的阳性克隆进行测序验证，测序引物如表6：

表6

实施例2：Gα慢病毒包装

1、用胰蛋白酶消化对数生长期的HEK293细胞，细胞密度为5×10⁶时；重新接种于含有25 mL 含10%（v/v）FBS的无抗生素DMEM培养基直径为15cm的细胞培养皿中，37℃，50 mL/L CO₂培养箱内培养；

2、制备慢病毒包装系统中四种质粒DNA溶液：

pRSV-Rev 10μg，

pMDLg-pRRE 15μg，

pMD2G 7.5μg，

pLVX-IRES-mCherry-Gα 20μg；

将以上质粒加入无菌水定容至1800μL，再加入CaCl₂(2.5mol/L)溶液200μL，混匀，加入2×PBS缓冲盐溶液2000μL，室温放置20～30 min；

3、当细胞密度达60%～70%时进行转染。此时将步骤2中制备的DNA溶液和磷酸钙混合液转移至步骤1得到的含单层细胞的细胞培养皿中，混匀，培养12 h后弃去培养液，细胞用15mL PBS溶液冲洗，共洗3次。

4、向上述细胞培养皿中加入含100 mL/L FBS的DMEM细胞培养液15 mL，继续培养48h；

5、收集转染72h的HEK293细胞上清液；

6、将收集的上清液于4℃，4000 g离心10 min，再次收集上清液；

7、将再次收集得到的上清液以0.45 μm滤器过滤；

8、将滤液于40 mL超速离心管中，4℃，25000 r/min离心20 min，弃上清液；

9、而后以冰500ul PBS重旋病毒沉淀于4℃溶解过夜，得到慢病毒液，即Gα慢病毒。

实施例3：细胞转染和筛选

1、在6孔细胞培养板中培养HEK293细胞，待细胞完全贴壁汇合度为40%-50%后，即可进行细胞转染；转染前，每孔细胞换成500μL新鲜的DMEM完全培养基，并且每孔加入1μL的聚凝胺（polybrene），放置于培养箱孵育1h。

2、在上述6孔细胞培养板的2个孔中，分别加入5μL 实施例2得到的Gα慢病毒液，其中一孔细胞加10μL的空载慢病毒液（空载慢病毒液与Gα慢病毒液的唯一区别是不含有Gα基因，其余制备方法都相同），另一孔做空白细胞对照，充分的摇匀后放入37℃、5％（v/v）CO₂、95%相对湿度的培养箱中培养

3、转染6小时后，吸走孔内的培养基，并用PBS洗两次；换成新鲜的DMEM完全培养基，放入37℃、5％（v/v）CO₂、95%相对湿度的培养箱中培养。

4、感染48小时后，与对照组相比较，于荧光显微镜下观察感染效果。若观察到明显的红色荧光，说明已转染成功。此时将得到的HEK293- Gα细胞移至10cm细胞培养皿扩大培养。

实施例4：使用实时荧光定量PCR进行Gα基因的表达检测。

1、HEK293-Gα细胞总RNA提取：

1）将10cm细胞培养皿中汇合度达80%的筛选得到的HEK293-Gα细胞用预冷PBS缓冲液洗2遍，加1ml Trizol裂解液重悬。

2）接着加入0.2ml三氯甲烷，剧烈摇动10s，室温放置3分钟。

3）4℃，12000 rpm离心20min。

4）将上清水相转移至另一新的无RNA酶离心管中，并加入等体积的异丙醇，混匀，-80℃放置1h。

5）4℃，12000rpm离心10min，去上清。

6）加入1ml体积浓度为75%乙醇洗涤沉淀。

7）4℃，5000rpm离心3min，去上清，室温晾干。

8）加入40μL RNase-free水溶解RNA。

2、去基因组DNA和cDNA的合成

将RNA加入到gDNA吸附柱，室温10,000g离心1min，收集滤液即为去除基因组DNA的RNA。

cDNA合成条件：

RNA 1μg

dNTP(10mM) 1μl

oligo dT（40μM）1μl

随机引物（40μM）1μl

加RNas-free水至34.5μl；

至于75℃ 5min，冰上5min。

向上述反应后的溶液中添加反转录试剂：

MuLV 1μl

10X buffer 4μl

RNase 抑制剂0.5ul

42℃反应1h，75℃灭活酶10min，备用

3、cDNA的实时荧光定量PCR

将Gα基因和内参基因actin的cDNA样本分别取样在荧光定量PCR仪上进行反应，每个样本设置3个平行实验。PCR反应体系为20μL，反应体系如表7：

表7

荧光定量PCR使用的引物如表8：

表8

反应条件为：

循环结束后从60℃升高到98℃获取熔解曲线。

本发明所构建的Gα基因过表达慢病毒载体对宿主细胞的转染效率高达80%~90%。

实验以actin为内参基因，采用2^-△△Ct法进行分析，经所构建的pLVX-IRES-mCherry-Gα慢病毒载体转染的HEK293细胞中Gα基因的相对表达量是未转入Gα基因的HEK293细胞的2.42倍。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

序列表

SEQ ID NO.1

atggcccgct cgctgacctg gcgctgctgc ccctggtgcc tgacggagga tgagaaggcc 60

gccgcccggg tggaccagga gatcaacagg atcctcttgg agcagaagaa gcaggaccgc 120

ggggagctga agctgctgct tttgggccca ggcgagagcg ggaagagcac cttcatcaag 180

cagatgcgga tcatccacgg cgccggctac tcggaggagg agcgcaaggg cttccggccc 240

ctggtctacc agaacatctt cgtgtccatg cgggccatga tcgaggccat ggagcggctg 300

cagattccat tcagcaggcc cgagagcaag caccacgcta gcctggtcat gagccaggac 360

ccctataaag tgaccacgtt tgagaagcgc tacgctgcgg ccatgcagtg gctgtggagg 420

gatgccggca tccgggcctg ctatgagcgt cggcgggaat tccacctgct cgattcagcc 480

gtgtactacc tgtcccacct ggagcgcatc accgaggagg gctacgtccc cacagctcag 540

gacgtgctcc gcagccgcat gcccaccact ggcatcaacg agtactgctt ctccgtgcag 600

aaaaccaacc tgcggatcgt ggacgtcggg ggccagaagt cagagcgtaa gaaatggatc 660

cattgtttcg agaacgtgat cgccctcatc tacctggcct cactgagtga atacgaccag 720

tgcctggagg agaacaacca ggagaaccgc atgaaggaga gcctcgcatt gtttgggact 780

atcctggaac taccctggtt caaaagcaca tccgtcatcc tctttctcaa caaaaccgac 840

atcctggagg agaaaatccc cacctcccac ctggctacct atttccccag tttccagggc 900

cctaagcagg atgctgaggc agccaagagg ttcatcctgg acatgtacac gaggatgtac 960

accgggtgcg tggatggccc cgagggcagc aacttaaaaa aagaagataa ggaaatctat 1020

tctcacatga cctgcgctac tgacacacaa aacgtcaaat tcgtgtttga tgccgtgaca 1080

gatataataa taaaagagaa cctcaaagac tgtgggctct tctga 1125

SEQ ID NO.2

agattctaga gctagcacca ccatggatgg cccgctcgct g 41

SEQ ID NO.3

agatccttgc ggccgctcag aagagcccac agtc 34

SEQ ID NO.4

cgcaaatggg cggtaggcgt g 21

SEQ ID NO.5

cctcacattg ccaaaagacg 20

SEQ ID NO.6

tgacgtggac atccgcaaag 20

SEQ ID NO.7

ctggaaggtg gacagcgagg 20

SEQ ID NO.8

gctcgattca gccgtgtact 20

SEQ ID NO.9

tttctgcacg gagaagcagt 20。