一种高效介导Gα基因过表达的慢病毒载体和慢病毒及其构建方法与流程

本发明属于分子生物学
技术领域：
，具体涉及一种高效介导Gα基因过表达慢病毒载体和慢病毒及其构建方法。
背景技术：
：味觉功能学研究表明，甜味主要由味觉细胞的G蛋白偶联受体(Gproteincoupledreceptors，GPCRs)家族所介导，即味觉受体第1家族(tastereceptorfamily1members，T1Rs)。其中T1R2和T1R3是甜味受体，它们以T1R2+T1R3异二聚体的形式发挥作用，共同对甜味进行识别。甜味受体在结合配体后，下游G蛋白被激活，其α亚基与β、γ亚基分离，Gα亚基进入胞浆进而激活下游效应器，最终导致细胞内钙离子浓度升高。因此，通过构建共表达T1R2、T1R3和Gα基因的细胞系，可用钙流检测方法对甜味物质进行识别。构建共表达T1R2、T1R3和Gα基因的细胞系，需要使用到带有Gα基因的过表达载体。现有的方法采用的是将整合有Gα基因的质粒载体通过脂质体对宿主细胞进行转染，但是脂质体转染质粒载体的转染效率较低，要构建能稳定共表达T1R2、T1R3和Gα三种基因的细胞系成功率也较低。因此，如何提高Gα基因过表达载体的转染效率是目前亟需解决的问题。技术实现要素：本发明的目的是为了解决现有技术的不足，提供一种Gα基因过表达慢病毒载体、慢病毒及其构建方法。该方法所构建的慢病毒载体，转染效率高，并能将Gα基因整合到宿主细胞的基因组中，因此能特异、持续、高效地促进Gα基因在宿主细胞中的稳定表达。为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：一种高效介导Gα基因过表达慢病毒载体，以pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP慢病毒表达载体为基础进行构建，并整合有Gα基因，得到Gα基因过表达慢病毒载体pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP-Gα。本发明还提供上述pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP-Gα慢病毒表达载体的构建方法，包括如下步骤：步骤(1)，人工合成Gα基因；步骤(2)，以下列PCR扩增引物进行Gα基因的PCR扩增：所述的PCR扩增引物为：Gα-F：agattctagagctagcaccaccatggatggcccgctcgctg；Gα-R：agatccttgcggccgctcagaagagcccacagtc；步骤(3)，用限制性内切酶EcoRI和BamHI分别对Gα基因的PCR产物和慢病毒表达载体pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP进行双酶切；步骤(4)，用T4DNA连接酶将酶切的得到的线性化的Gα基因和酶切慢病毒表达载体得到的产物进行连接，将得到的连接液转化EcoliXL1-BLUEMRF’感受态细胞，并进行PCR鉴定，对PCR鉴定阳性的克隆进行测序和比对，比对正确的克隆即为构建成功的Gα基因过表达慢病毒载体pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP-Gα；其中，步骤(4)PCR鉴定采用的PCR扩增引物与步骤(2)所采用的PCR扩增引物相同。步骤(4)测序所用引物为：pCDH-CMV-F：cgcaaatgggcggtaggcgtg；EF13：ccaacttctcggggactgtg。本发明另外提供一种Gα慢病毒的构建方法，采用上述Gα基因过表达慢病毒载体，方法是：使用慢病毒包装质粒pLP/VSVG、pLP1和pLP2对Gα基因过表达慢病毒载体pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP-Gα进行包装，通过转染HEK293细胞，得到Gα基因过表达慢病毒。本发明还要求保护上述Gα慢病毒的构建方法构建得到的Gα慢病毒。本发明与现有技术相比，其有益效果为：本发明所构建的Gα基因过表达慢病毒载体对宿主细胞的转染效率高达80％～90％，比起现有的质粒转染法转染效率提高了1倍以上。此外由于慢病毒能将Gα基因整合到宿主细胞的基因组中，因此使用该方法能特异、持续、高效地促进基因Gα在宿主细胞中的稳定表达。过表达Gα基因的细胞可用于构建共表达T1R2、T1R3和Gα基因的细胞系，可用钙流检测方法对甜味物质进行识别。附图说明图1是pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP慢病毒表达载体图谱；图2是pLP/VSVG慢病毒包装质粒图谱；图3是pLP1慢病毒包装质粒图谱；图4是pLP2慢病毒包装质粒图谱。具体实施方式下面结合实施例对本发明作进一步的详细描述。本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过购买获得的常规产品。主要实验试剂及厂家：1)限制性内切酶(Thermoscientific)2)DNA连接酶(Thermoscientific)3)DNA回收试剂盒(美基生物)4)PrimeSTARMaxPremix(2X)(Takara)5)T4DNA连接酶(ThermoScientific)6)EcoliXL1-BLUEMRF’感受态细胞(Stratagene)7)FItran：慢病毒包装专用转染试剂(辉骏生物)8)DMEM完全培养基(含10％FBS、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素)(Gibco)9)TrizolReagent(Ambion)10)BestarTMqPCRRTKit(德国DBI)11)SybrGreenqPCRmastermix(德国DBI)pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP，以及慢病毒包装质粒pLP/VSVG、pLP1和pLP2均可商购于广州辉骏生物科技有限公司。实施例1：Gα基因过表达慢病毒载体构建。1、人工合成Gα基因，其DNA序列如SEQIDNO.1所示。2、使用PrimeSTAR高保真酶，以人工合成的Gα基因为模板，通过如表1所示引物进行的PCR扩增：表1引物名称引物序列(5’-3’)SEQIDNO.Gα-Fagattctagagctagcaccaccatggatggcccgctcgctg2Gα-Ragatccttgcggccgctcagaagagcccacagtc3PCR反应体系与条件如表2：表2试剂体积模板1μL上游引物(10μM)1μL下游引物(10μM)1μLPrimeSTARMax(2x)10μLddH2O7μL总体积20μLPCR程序如表3：表33、琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物大小是否与预期一致，切割在琼脂糖凝胶电泳胶中的目的片段条带，用DNA回收试剂盒回收纯化；4、用EcoRI和BamHI限制性内切酶分别对Gα基因的PCR产物和慢病毒载体pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP进行双酶切(于37℃酶切3h)，反应体系和反应条件如表4：表45、琼脂糖凝胶电泳检测酶切效果，切割在琼脂糖凝胶电泳胶中的Gα基因片段条带和线性化的慢病毒载体，用胶回收试剂盒回收DNA；6、用T4DNA连接酶于16℃水浴下，将两种酶切产物进行连接，过夜。反应如表5：表5试剂体积10XT4DNA连接酶buffer2μLT4DNA连接酶(400U/μL)1μLGα基因片段10μL线性化的慢病毒载体4μLddH2O3μL总体积20μL7、转化感受态细胞：从-80℃冰箱取出1管100μLEcoliXL1-BLUEMRF’感受态细胞，放冰上解冻(解冻至无冰状态)后，取10μL上述步骤6中的连接产物加到感受态细胞中混匀，静置30min，42℃水浴热激1min，冰上静置2min。加LB液体培养基500μL，37℃振荡培养1小时。3000rpm离心5min，留100μl左右上清液混匀细菌后涂到LB平板上，37℃倒置培养过夜。8、挑取数个菌落，做菌落PCR检测转化子，反应体系和条件见步骤2；9、将菌落PCR鉴定得到的阳性克隆进行测序验证，测序引物如表6：表6实施例2：Gα慢病毒包装1、给汇合度达80％以上的HEK293细胞换上无抗生素培养基DMEM+10％(v/v)FBS，37℃、5％(v/v)CO2培养箱培养2个小时。2、将包装质粒混合物(pLP/VSVG+pLP1+pLP2，各3μg)和4μgGα基因过表达慢病毒载体在400μL0.9％(w/v)生理盐水中混合，并加入50μL转染试剂Fitran，室温静置孵化20min后缓慢均匀滴入步骤1的含有HEK293细胞的培养皿中，适当摇匀；此时记为转染开始时间。3、转染4-6h后准备换液，倒掉旧的培养基后，吸取适量PBS轻轻漂洗细胞1-2次，换上含有2％(v/v)FBS的DMEM培养基。4、转染后72小时收集上清，将收集到的上清于3000rpm4℃离心10min，取上清用0.45um微孔滤器过滤。5、将滤液于40mL超速离心管中，4℃，25000r/min离心20min，弃上清液。6、而后以500ul冰PBS重旋病毒沉淀于4℃溶解过夜，得到慢病毒液，即Gα慢病毒。实施例3：细胞转染1、在6孔细胞培养板中培养HEK293细胞，待细胞完全贴壁汇合度为40％-50％后，即可进行细胞转染；转染前，每孔细胞换成500μL新鲜的DMEM完全培养基，并且每孔加入1μL的聚凝胺(polybrene)，放置于培养箱孵育1h。2、在上述6孔细胞培养板的2个孔中，分别加入5μL实施例2得到的Gα慢病毒液，其中一孔细胞加10μL的空载慢病毒液(空载慢病毒液与Gα慢病毒液的唯一区别是不含有Gα基因，其余制备方法都相同)，另一孔做空白细胞对照，充分的摇匀后放入37℃、5％(v/v)CO2、95％相对湿度的培养箱中培养。3、转染6小时后，吸走孔内的培养基，并用PBS洗两次；换成新鲜的DMEM完全培养基，放入37℃、5％(v/v)CO2、95％相对湿度的培养箱中培养。4、感染48小时后，与对照组相比较，于荧光显微镜下观察感染效果。若观察到明显的绿色荧光，说明已转染成功。此时将得到的HEK293-Gα细胞移至10cm细胞培养皿扩大培养。实施例4：使用实时荧光定量PCR进行Gα基因的表达检测。1、HEK293-Gα细胞总RNA提取：1)将10cm细胞培养皿中汇合度达80％的实施例3得到的HEK293-Gα细胞用预冷PBS缓冲液洗2遍，加1mlTrizol裂解液重悬。2)接着加入0.2ml三氯甲烷，剧烈摇动10s，室温放置3分钟。3)4℃，12000rpm离心20min。4)将上清水相转移至另一新的无RNA酶离心管中，并加入等体积的异丙醇，混匀，-80℃放置1h。5)4℃，12000rpm离心10min，去上清。6)加入1ml体积浓度为75％乙醇洗涤沉淀。7)4℃，5000rpm离心3min，去上清，室温晾干。8)加入40μLRNase-free水溶解RNA。2、去基因组DNA和cDNA的合成将RNA加入到gDNA吸附柱，室温10,000g离心1min，收集滤液即为去除基因组DNA的RNA。把RNA在65℃条件下热变性5分钟后，立即置于冰上冷却。使用BestarTMqPCRRTKit逆转录试剂盒进行逆转录反应，得到cDNA，反应体系如表7：表7反应条件：37℃,15min98℃,5min4℃,保持反应结束后，-20℃保存。3、cDNA的实时荧光定量PCR将Gα基因和内参基因18SrRNA的cDNA样本分别取样在荧光定量PCR仪上进行反应，每个样本设置3个平行实验。PCR反应体系为20μL，反应体系如表8：表8荧光定量PCR使用的引物如表9：表9反应条件为：循环结束后从60℃升高到98℃获取熔解曲线。本发明所构建的Gα基因过表达慢病毒载体对宿主细胞的转染效率高达80％～90％。实验以18SrRNA为内参基因，采用2-△ΔCt法进行分析，经所构建的pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP-Gα慢病毒载体转染的HEK293细胞中Gα基因的相对表达量是未转入Gα基因的HEK293细胞的63269倍。以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。序列表SEQIDNO.1当前第1页1 2 3