检测网状内皮增生症病毒的PCR引物及其试剂盒的制作方法

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种采用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术对网状内皮增生症病毒进行快速检测的通用PCR引物、通用RT-PCR方法及其检测试剂盒。

背景技术：

网状内皮增生症病毒(Reticuloendotheliosis virus，REV)属于反转录病毒科、禽类C型反转录病毒属中的网状内皮组织增生症病毒群。本病为免疫抑制性疾病，能侵害机体的免疫系统，可导致机体免疫机能下降，易于继发其它疾病。患病家禽是本病的主要传染源，可通过口、眼分泌物及粪便水平传播，亦可通过种蛋垂直传播，对养殖业以及相关产业造成巨大经济损失。REV病毒粒子呈球形，直径为100nm，有囊膜，外表面突起。REV病毒群可分为完全复制型(A株)和不完全复制型(T株)。通过REV特异性单抗介导的IFA实验，REV被分为三种不同亚型：I、II和III型，各型代表分别是：170A、SNV和CSV。

REV全基因组有两个开放阅读框，编码3个蛋白(gag、pol和env)，两侧是长末端序列(long terminal region，LTR)。其中env蛋白是囊膜蛋白，能被进一步裂解为gp90和gp20，较小的gp20贯穿病毒的囊膜，称为穿膜蛋白(TM)，较大的gp90通过二硫键和氢键与TM相连，暴露于囊膜之外，称之为表面蛋白，TM和SU是env基因编码的前体蛋白经水解后产生的，其中gp90具有型特异性抗原，是REV的免疫显性蛋白。

传统的REV抗体检测方法包括琼脂免疫扩散试验、间接免疫荧光试验、间接ELISA等方法。但是当抗体水平较低时，容易造成假阴性，因此需进行病原检测确诊。最经典、最准确的病原检测方法是采集病料接种鸡胚成纤维细胞(CEF)进行病毒分离培养，多次消化传代后用REV特异性抗血清通过间接免疫荧光试验(IFA)、免疫过氧化物酶染色、补体结合试验或ELISA来检测REV进行验证，但是这一过程至少需要数天的时间，耗时较长。也可通过病理组织学观察来诊断REV，将病理切片与IFA以及免疫组化等技术相结合，可作为区分REV、MDV和ALV的有效方法。此方法虽能清晰地显现REV抗原的存在位置及组织病理变化，但是操作繁琐，不适合大批量样本检测分析。

近几年随着分子生物学技术的发展，REV的诊断技术也有了很大进步。PCR技术具有快速、准确、特异和敏感的特点，可以作为REV检测的一种方法，其应用范围广，同时可以进行REV的确诊。该方法基于REV前病毒DNA可插入到宿主DNA中这个特点，直接使用组织DNA为模板进行扩增检测。REV的基因组较为稳定，LTR、env、pol、gag等基因均可作为PCR扩增的靶点，RT-PCR诊断方法简便、准确，适合于基层使用，有利于REV快速诊断。

公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种检测网状内皮增生症病毒的通用PCR引物，以及使用了该引物的PCR扩增反应体系、RT-PCR检测方法和检测试剂盒，该PCR扩增反应体系、RT-PCR检测方法和检测试剂盒操作简便，通用性好，特异性强，灵敏度高，成本低，可以同时进行大批量样本分析。

为了实现本发明目的，本发明提供了一对检测网状内皮增生症病毒的PCR引物，包括上游引物5’-GAAGAATGGACTGTCTCACC-3’(如序列表SEQ ID No.1所示)和下游引物5’-CGTCTTCATACGARCCTGGC-3’(如序列表SEQ ID No.2所示)。其中下游引物中的R为简并引物，R＝A/G。

本发明还提供了一种包含上游引物：5’-GAAGAATGGACTGTCTCACC-3’和下游引物：5’-CGTCTTCATACGARCCTGGC-3’的检测试剂盒。

本发明还提供了一种检测网状内皮增生症病毒的PCR扩增的反应体系，包括以下组分：

其中：上游引物：5’-GAAGAATGGACTGTCTCACC-3’，下游引物：5’-CGTCTTCATACGARCCTGGC-3’。20μM的上下游引物是指引物自身的浓度，而非其在PCR扩增的反应体系中的终浓度。

在上述反应体系另外一种可能的实现方式中，所述反应体系进行PCR扩增的反应程序为：预变性94℃5min；30个循环，每个循环为94℃45s，57℃45s，72℃30s；最后经过72℃10min延伸。

在上述反应体系另外一种可能的实现方式中，所述样本取自待测菌悬液或家禽临床病料，如：鸡、鸭、鹅的临床病料。

在上述反应体系另外一种可能的实现方式中，当样本取自家禽临床病料时，样本总RNA提取前还包括样本预处理的步骤，所述样本预处理的方式为：取脏器组织样本、泄殖腔拭子样本或口咽拭子样本，将样本在灭菌生理盐水中研磨均匀并混悬，离心取上清。

在上述反应体系另外一种可能的实现方式中，样本总RNA进行反转录的方式为：加入总RNA 4μl和随机引物1μl轻轻混匀，70℃水浴5min，冰浴2min，然后依次加入下列成分：5×反应缓冲液4μl，dNTP混合物2μl，核酸酶抑制剂1μl，反转录酶0.5μl和DEPC处理水7.5μl，之后轻轻混匀，在37℃作用1h，得到样本总RNA对应的cDNA。

本发明还提供了一种检测网状内皮增生症病毒的RT-PCR方法，包括如下步骤：

1)样本总RNA的提取；

2)对步骤1)的总RNA进行反转录，得到样本cDNA；

3)利用上游引物5’-GAAGAATGGACTGTCTCACC-3’和下游引物：5’-CGTCTTCATACGARCCTGGC-3’，对步骤2)所得cDNA进行PCR扩增；

4)分析步骤3)所得PCR产物，如果扩增产物包含474bp的片段，则样本为网状内皮增生症病毒检测阳性，否则为检测阴性。对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，根据电泳结果确定样本中能否扩增出目的条带，目的条带即为474bp。

以NCBI数据库中REV-HLJR0901(GenBank登录号为GQ415646)基因组序列作为参考，设计和筛选新型引物，上游引物在env基因的5947nt-5966nt之间，下游引物在6401nt-6420nt之间。以该新型引物扩增REV的env基因的保守区序列，长度约474bp，整体思路为：提取样本总RNA并进行反转录(RT)合成cDNA后，利用上述引物进行聚合酶链式反应(PCR)，采用下列反应程序：预变性94℃5min，30个循环(94℃45s，57℃45s，72℃30s)，最后经过72℃10min延伸，对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，利用紫外凝胶成像仪检测目的条带，如果扩增出目的条带则证明为REV检测阳性，否则为检测阴性。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

1)扩增的目的片段位于REV的envelope蛋白的高度保守区，目的片段长度为474bp，敏感性好、操作方便、对不同REV分离株均有较好检出，即通用性好；

2)将REV病毒样本cDNA进行10倍系列稀释后，发现10000倍稀释后利用本方法仍能检测到REV特异性条带，表明使用本申请引物的PCR扩增反应体系、RT-PCR检测方法和检测试剂盒具有较高的灵敏度；

3)该方法对其它常见禽病病原，如禽流感病毒、新城疫病毒、传染性支气管炎病毒、传染性法氏囊病毒、禽呼肠孤病毒、禽腺病毒、传染性喉气管炎病毒、禽白血病A/B/J亚群、马立克氏病病毒及禽传染性贫血病病毒的检测结果皆为阴性，没有交叉反应，表明该方法亦具有良好的特异性；

4)本发明适用于对REV进行快速检测，适合大批量临床样本的检测与分析。临床试验证明此方法具有高特异性、高灵敏度、高效率、低成本的特点，可在5h内对临床病料进行快速鉴别诊断，克服了传统检测方法耗时较长、操作繁琐等缺点，为REV的早期快速诊断提供可靠技术手段。

附图说明

图1是对网状内皮增生症病毒进行检测的电泳结果。点样顺序为M：DNA Maker II；P：阳性对照；N：阴性对照；1：样本(2015年河北分离株)；2：样本(2016年山东分离株)；3：样本(2015年河北分离株)；4：样本(2016辽宁分离株)；

图2是对该引物检测网状内皮增生症病毒的灵敏度电泳结果。点样顺序为M：DNA maker II；P：阳性对照；N：阴性对照；1：cDNA稀释10倍；2：cDNA稀释10²倍；3：cDNA稀释10³倍；4：cDNA稀释10⁴倍；5：cDNA稀释10⁵倍；

图3是对其它常见禽病病原进行检测的电泳结果。其中M：DNA Maker II；P：阳性对照；N：阴性对照；1：H5亚型禽流感病毒；2：H7亚型禽流感病毒；3：H9亚型禽流感病毒；4：新城疫病毒(NDV)；5：传染性支气管炎病毒(IBV)；6：传染性法氏囊病毒(IBDV)；7：禽呼肠孤病毒(REOV)；8：禽腺病毒(FAdV)；9：传染性喉气管炎病毒(ILTV)；10：禽白血病A亚群(ALV-A)；11：禽白血病B亚群(ALV-B)；12：禽白血病J亚群(ALV-J)；13：马立克氏病毒(MDV)；14：禽传染性贫血病病毒(CAV)。

具体实施方式

下面结合附图，对本发明的具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。

下列实施例中常规的实验方法，参见Sambrook等编写的分子克隆。仪器的使用参照仪器操作说明。本申请中实施例中所使用的各个毒株和菌株均由中国农业大学畜禽疫病诊断中心保藏和提供。

实施例1家禽临床病料样本的预处理

1、实验试剂和主要仪器

主要试剂：灭菌生理盐水

主要仪器：LEGEND MICRO 17R低温台式离心机，为Thermo公司产品；VS-1涡旋振荡器购自鼎昊源科技有限公司；TL-2010S组织研磨震荡器购自鼎昊源科技有限公司。

2、实验步骤

(1)组织样本处理：取100mg脏器组织样本加入0.5ml灭菌生理盐水并用研磨器进行研磨混悬，组织悬液3000rpm离心30min后取上清用于检测。

(2)泄殖腔或口咽拭子样本处理：将拭子样本加入0.5ml灭菌生理盐水并用涡旋振荡器振荡混悬，样本悬液3000rpm离心30min后取上清用于检测。

实施例2样本总RNA的提取

1、实验试剂和主要仪器

主要试剂：Trizol RNA提取试剂，为Invitrogen产品，购北京索莱宝科技有限公司；DEPC处理水，购自北京明豪至远有限公司；氯仿、异丙醇、无水乙醇和75％乙醇购自北京华美智博科技有限公司；Rnase-free的离心管与枪头北京购自华夏远洋科技有限公司。

主要仪器：LEGEND MICRO 17R低温台式离心机，为Thermo公司产品；1300SEVIES A2生物安全柜，为Thermo公司产品。

2、实验步骤

(1)取实施例1预处理所得家禽临床病料样本悬液250μl，加入750μl Trizol，加入200μl氯仿，手动颠倒混匀30s，室温静置5min；

(3)混合液以12000rpm，4℃离心15min，混合液分为三相，即上层水相，中间相和下层有机相。

(4)吸取上层水相加入另一离心管内，加入等体积的异丙醇，轻轻颠倒混匀，室温放置10min；

(5)混合液13500rpm，4℃离心10min，沉淀RNA；

(6)小心尽弃上清，用DEPC水配制的75％乙醇1ml轻轻漂洗沉淀，轻轻颠倒混匀1次；

(7)将混合液13500rpm，4℃离心5min,弃去上清，再用200μl枪头吸取剩余液体底层沉淀即为洗净的RNA；

(8)将RNA沉淀置超净台内风干，约10min；

(9)用DEPC水处理的灭菌水9μl溶解沉淀，再加入1μl RNasin；

(10)提取的RNA直接用于cDNA的合成或分装后-80℃保存备用。

实施例3反转录生成cDNA

1、实验试剂和主要仪器

主要试剂：反转录酶(Reverse Transcriptase)200U/μl(Promega)、核酸酶抑制剂(Rnase Inhibitor)50U/μl(Takara)、5倍体积的反应缓冲液(5×Reaction Buffer)、dNTP混合物2.5mM和随机引物(Random Primer)500μg/ml(Promega)，购自北京爱普锐晟科技有限公司；DEPC处理水，购自北京明豪至远有限公司。

主要仪器：Veriti 96-Well Thermal Cycler PCR扩增仪为Applied Biosystems公司产品，购自北京诚茂兴业科技发展有限公司；MINI-Smart小型台式离心机为HERO公司产品；HW·SYII-KP3型电热恒温水槽(北京长风仪器仪表公司)。

2、实验步骤

(1)在0.2ml离心管内加入下列成分：

RNA溶液 4μl

随机引物 1μl

轻轻混匀，70℃水浴5min，冰浴2min，然后依次加入下列成分：

轻轻混匀，37℃作用1h，得到样本cDNA。

实施例4目的片段的PCR扩增

1、实验试剂和主要仪器

主要试剂：cDNA溶液；2×Taq PCR master mix，购自中科瑞泰(北京)生物科技有限公司；dd H2O；特异性引物(上游引物5’-GAAGAATGGACTGTCTCACC-3’和下游引物：5’-CGTCTTCATACGARCCTGGC-3’。)；Marker II DNA Ladder购自中科瑞泰(北京)生物科技有限公司。

主要仪器：Veriti 96-Well Thermal Cycler PCR扩增仪为Applied Biosystems公司产品，购自北京诚茂兴业科技发展有限公司；MINI-Smart小型台式离心机为HERO公司产品；DYY-8C电泳仪购自北京市六一仪器厂；α凝胶成像仪购自鼎昊源科技有限公司。

2、实验步骤

在0.2ml离心管中加入下列成分：

轻轻混匀后，进行如下反应：94℃预变性5min；94℃45s，57℃45s，72℃30s，进行30个循环；循环结束72℃延伸10min。

PCR反应结束后，用1×TAE电泳缓冲液制备1％琼脂糖凝胶并按照参考比例混入荧光染料Gelsafe。取7μl PCR产物加入凝胶孔中，选择合适的电压(4V/cm-10V/cm)进行电泳，电泳时间为20-30min，电泳结束后将凝胶块置于凝胶成像仪上观察并拍照，根据电泳结果确定样本中能否扩增出目的条带，如果扩增出目的条带则证明为REV检测阳性，否则为检测阴性。

利用上述方法分别对分离自不同地点和时间的REV进行检测，结果均有较好的检出，电泳结果如图1所示，表明本方法具有良好的通用性。

实施例5敏感性检测

1、实验试剂和主要仪器

主要试剂：cDNA溶液；2×Taq PCR master mix，购自中科瑞泰(北京)生物科技有限公司；dd H2O；特异性引物(上游引物5’-GAAGAATGGACTGTCTCACC-3’和下游引物：5’-CGTCTTCATACGARCCTGGC-3’)；Marker II DNA Ladder购自中科瑞泰(北京)生物科技有限公司。

主要仪器：Veriti 96-Well Thermal Cycler PCR扩增仪为Applied Biosystems公司产品，购自北京诚茂兴业科技发展有限公司；MINI-Smart小型台式离心机为HERO公司产品；DYY-8C电泳仪购自北京市六一仪器厂；α凝胶成像仪购自鼎昊源科技有限公司。

2、实验步骤

将cDNA溶液进行10倍系列稀释，稀释度为10、10²、10³、10⁴和10⁵倍，分别以稀释后的模板按如下体系进行PCR反应。

在0.2ml离心管中加入下列成分：

轻轻混匀后，进行如下反应：94℃预变性5min；94℃45s，57℃45s，72℃30s，进行30个循环；循环结束72℃延伸10min。

PCR反应结束后，用1×TAE电泳缓冲液制备1％琼脂糖凝胶并按照参考比例混入荧光染料Gelsafe。取7μl PCR产物加入凝胶孔中，选择合适的电压(4V/cm-10V/cm)进行电泳，电泳时间为25-35min，电泳结束后将凝胶块置于凝胶成像仪上观察并拍照，根据电泳结果确定样本中能否扩增出目的条带，如果扩增出目的条带则证明为REV检测阳性，否则为阴性。

利用上述方法对REV进行检测，对反转录的REV cDNA稀释10⁴后，仍能检测到病毒cDNA，如图2所示，表明本方法具有良好的敏感性。

实施例6特异性检测

1、实验试剂和主要仪器

主要试剂：cDNA溶液；2×Taq PCR master mix，购自中科瑞泰(北京)生物科技有限公司；dd H2O；特异性引物(上游引物5’-GAAGAATGGACTGTCTCACC-3’和下游引物：5’-CGTCTTCATACGARCCTGGC-3’)；Marker II DNA Ladder购自中科瑞泰(北京)生物科技有限公司。

主要仪器：Veriti 96-Well Thermal Cycler PCR扩增仪为Applied Biosystems公司产品，购自北京诚茂兴业科技发展有限公司；MINI-Smart型台式离心机为HERO公司产品；DYY-8C电泳仪购自北京市六一仪器厂；α凝胶成像仪购自鼎昊源科技有限公司。

2、实验步骤

在0.2ml离心管中加入下列成分：

轻轻混匀后，进行如下反应：94℃预变性5min；94℃45s，57℃45s，72℃30s，进行30个循环；循环结束72℃延伸10min。

PCR反应结束后，用1×TAE电泳缓冲液制备1％琼脂糖凝胶并按照参考比例混入荧光染料Gelsafe。取7μl PCR产物加入凝胶孔中，选择合适的电压(4V/cm-10V/cm)进行电泳，电泳时间为25-35min，电泳结束后将凝胶块置于凝胶成像仪上观察并拍照，根据电泳结果确定样本中能否扩增出目的条带，如果扩增出目的条带则证明为REV检测阳性，否则为阴性。

利用上述方法对其它常见的禽病病原，如禽流感病毒、新城疫病毒、传染性支气管炎病毒、传染性法氏囊病毒、禽呼肠孤病毒、禽腺病毒、传染性喉气管炎病毒、禽白血病A/B/J亚群、马立克氏病病毒及禽传染性贫血病病毒进行检测，其结果如图3所示，结果皆为阴性，表明本方法具有良好的特异性。

实施例7对临床样本的检测

表1RT-PCR检测方法对临床病料检测的应用

由表1可以看出，本申请建立网状内皮增生症病毒的PCR方法与病毒分离结果或测序结果均符合，准确性高，同时对来自不同采样时间和地点的病料样本均适用。

前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。