本发明涉及疾病的基因诊断
技术领域：
，特别是一种与结直肠癌相关的基因septin9甲基化的检测。
背景技术：
：结直肠癌是世界第三大高发癌症，每年因结直肠癌死亡的患者可达60万。早期结直肠癌患者的5年生存率约为80％，由于结直肠癌早期往往无特殊症状，容易延误治疗时机，至晚期时生存率仅为10％左右。2000年以前，欧美一些国家就已在全国推广结直肠癌高危人群的筛查。2006年，美国50岁至75岁的人群中，60％的人至少参加过一次结直肠癌的筛查。近年来，我国恶性肿瘤中结直肠癌发病率位列第三，高达31/10万，直追欧美国家。然而，患者的早诊率远落后于国外，确诊时约60％的患者是中晚期。如果大肠癌在早期能够准确检测到，这样就能够尽早进行预防和治疗，提高治愈率，并且能够降低治疗成本。目前来讲，结直肠癌早期诊断主要有以下三种方式：1、粪便潜血试验(gFOBT)或免疫法粪便潜血试验(FIT)；2、进行结肠镜检查；3、CT结肠成像。现在，粪便潜血首推的是FIT，这与gFOBT存在很大不同。2008年一项对比gFOBT和FIT的研究显示，在做大规模筛查时，FIT的依从性较好为60％，gFOBT为47％；FIT的敏感性为5.5％，而gFOBT为2.4％；CRC和进展期腺癌的发生率FIT为1.4％，高于gFOBT的0.6％。对于结肠镜检测，2009年一项研究显示，全结肠镜检查可以降低左半的CRC死亡风险，但是在右半，全结肠镜检查并不能对死亡率有较大改善。对于左右半结果不同的原因目前存在争议。有观点认为，左右半结果不同是因为很多结肠镜检测并没有评估所有右半的结肠，最重要的是左右两侧的结肠具有不同的生物学特性，右半结肠息肉较少，呈扁平状，很容易漏检。粪便潜血检查的灵敏度相对较低，而结肠镜检查具有很大的创伤性。所以需一种同时具备检测灵敏度高、创伤性小的结直肠癌早期筛查的方法。Septin9基因位于常染色体17q25.3，作为高度保守的GTP结合蛋白广泛存在于人类细胞，研究显示Septin9基因甲基化在CRC及部分癌前病变患者外周血中有较高的检出率，由于仅需要抽取外周静脉血，故其患者依从性较高。利用分子检测手段，对结直肠癌的早期筛查具有无创性，检测灵敏度高。DNA异常甲基化是人类肿瘤常见的改变。发生在启动子区以及基因内部的CpG岛异常甲基化是基因失活的最常见机制。目前检测DNA甲基化检测方法有：甲基化特异性的PCR(Methylation-specificPCR，MSP)、亚硫酸氢盐测序法(BisulfitesequencingPCR，BSP)、高分辨率熔解曲线法(HighResolutionMelting，HRM)和高通量测序方法等。相对于其他的检测方法而言，亚硫酸氢盐测序法(BisulfitesequencingPCR，BSP)是DNA甲基化检测中的“金标准”，检测较为精准，但其检测灵敏度相对较低，且操作较繁琐、成本高。高分辨率熔解曲线法(HighResolutionMelting，HRM)在PCR扩增中通过观察熔解曲线的变化来判断DNA是否发生甲基化，此类方法结果分析相对复杂。高通量测序检测方法主要是涉及到的成本太高，不利于临床上的推广。对于甲基化特异性的PCR(Methylation-specificPCR，MSP)检测方法，操作简便、耗时较短，结果易于分析。专利公开号CN104164516A(公开日2014.11.26)公开了一种基于人结直肠癌特异性甲基化检测的引物及试剂盒，是针对SEPTIN9基因的启动子区域设计了一对用于人结直肠癌特异性甲基化检测的PCR引物，对辅助诊断结直肠癌有一定作用，但其特异性和灵敏度仍然有待提高。技术实现要素：为了解决现有技术对于结直肠癌相关基因septin9基因的甲基化情况检测灵敏度和特异性不高的问题，本发明提供了一对新的检测引物，另外基于该引物对，本发明还提供了一种简单方便的检测试剂盒。本发明提供的检测septin9基因甲基化的引物，包括目的基因引物对，其核苷酸序列如下所示：Septin9正向引物F：5'-CCGAAATAATCCCATCCAAC-3'(SEQIDNO.1)，Septin9反向引物R：5'-GCGATTCGTTGTTTATTAGTTATTAT-3'(SEQIDNO.2)。本发明基于甲基化特异性的PCR(Methylation-specificPCR，MSP)方法，设计了一对针对septin9基因-1200bp到-1500bp这一片段甲基化位点的引物。研究表明，这一位点的甲基化程度相对较高，具备重要的临床检测意义。本发明还提供了一种检测septin9基因甲基化的试剂盒，包括以上所述的引物。制备成试剂盒，更加方便携带使用。优选地，上述检测septin9基因甲基化的试剂盒，还包括内参基因引物对，其核苷酸序列如下：内参基因(β-actin)正向引物F：5'-GTGATGGAGGAGGTTTAG-3'(SEQIDNO.3)，内参基因(β-actin)反向引物R：5'-AAATTACAAAAACCACAA-3'(SEQIDNO.4)。其一，增加内参基因的检测，对样本基因组检测起到对照作用，排除内源因素的干扰；其二，增加内参的检测，结合靶基因对样本结果进行判读，提高检测的准确性。优选地，上述检测septin9基因甲基化的试剂盒，还包括两个TaqMan-MGB探针，分别为septin9基因探针和内参基因(β-actin)探针，其核苷酸序列如下：septin9基因探针：5'-TTATGTCGGATTTCGCGGTTAA-3'(SEQIDNO.5)，内参基因(β-actin)探针：5'-CACCACCCAACACACAATAACAAAC-3'(SEQIDNO.6)；两个探针的5'端标记荧光报告基团，3'端标记淬灭基团，且两个探针的荧光报告基团显示的颜色不同。在选取特异性探针序列的同时，相比普通的taqman探针，利用MGB探针进行检测，能够增加检测的灵敏度和特异性，提高检测结果的准确性。优选地，上述检测septin9基因甲基化的试剂盒，septin9基因探针核苷酸序列5'端标记FAM，3'端标记BHQ1；内参基因(β-actin)探针核苷酸序列5'端标记VIC，3'端标记BHQ1。通过利用不同荧光基团标记的方式，能够更好的将靶基因与内参基因区分开来，对结果的判读一目了然，更加清楚。优选地，上述检测septin9基因甲基化的试剂盒，还包括两个Blocker引物，核苷酸序列如下：Blocker1引物：5'-ACCCGCTGCCCACCAGCCATCATG-CY3-3'(SEQIDNO.7)，Blocker2引物：5'-TATGTTGGATTTTGTGGTTAATGTGTA-CY3-3'(SEQIDNO.8)；两个Blocker引物的3’端均标记有荧光染料CY3，以阻止Blocker引物的扩增过程。在PCR扩增过程中，目的片段的引物容易与未发生甲基化的基因片段以及未发生重亚硫酸盐转化的基因片段结合，出现突破扩增，进而产生非特异性扩增条带，影响最终的判读结果。因此，本试剂盒在扩增体系中额外增加了多条Blocker引物，目的是让这条引物特异性与除了甲基化片段之外的其他基因片段结合，进而摒弃上述基因片段的突破扩增，使目的引物只与甲基化片段结合，进一步提高PCR扩增灵敏度以及扩增特异性。优选地，上述检测septin9基因甲基化的试剂盒，还包括PCR反应液，所述PCR反应液包括DNA聚合酶、dNTPs、Mg2+。添加PCR反应液后，试剂盒能够一步完成荧光定量PCR，减少污染风险，使检测结果更加准确。优选地，上述检测septin9基因甲基化的试剂盒，检测对象为人的血浆提取的DNA。以血浆DNA作为检测对象，不会对人体组织造成床上，患者依从性更好，同时也更加方便检测。本发明提供的检测septin9基因甲基化的引物及试剂盒，具有如下有益效果：本发明针对septin9基因的-1200bp到-1500bp片段设计甲基化检测引物，特异性强，能够有效检出septin9基因的甲基化情况。本发明提供的试剂盒，操作简便、易于判读，对仪器的要求不高，并且整个PCR过程采用全封闭形式，避免了交叉污染的可能，使结果更加精准。另外附加内参基因的检测引物以及相应探针，采用Taqman-MGB探针检测的手段，通过探针与甲基化序列特异性结合，进而将甲基化位点进一步精确检测。对比于用PCR特异性引物进行检测的方法，利用探针对甲基化位点进行识别，具有更高的灵敏度、精准性。而且还增加了两个Blocker引物以去除非甲基化基因的干扰，严格控制非特异性条带的扩增，使这个试剂盒检测灵敏度更高、特异性更好。试剂盒检测的高灵敏性适用于结直肠癌血浆游离DNA的早期筛查。附图说明图1为实施例2中一个阳性样本的septin9甲基化检测情况。图2上图表示的是阳性样本进行8次重复；下图表示的是阴性样本进行8次重复。具体实施方式为了使本
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的人员更好地理解本发明方案，下面结合具体实施方式对本发明作进一步的详细说明。实施例中，除特殊说明外，所使用的生物材料和试剂均为本领域常规使用，可通过商业途径获得。实施例1试剂盒制备试剂盒内含有的引物及探针序列：Septin9正向引物F：5'-CCGAAATAATCCCATCCAAC-3'，Septin9反向引物R：5'-GCGATTCGTTGTTTATTAGTTATTAT-3'；内参基因正向引物F：5'-GTGATGGAGGAGGTTTAG-3'，内参基因反向引物R：5'-AAATTACAAAAACCACAA-3'；septin9基因探针：FAM-TTATGTCGGATTTCGCGGTTAA-MGB-BHQ1；内参基因探针：VIC-CACCACCCAACACACAATAACAAAC-BHQ1；Blocker1引物：5'-ACCCGCTGCCCACCAGCCATCATG-CY3-3'；Blocker2引物：5'-TATGTTGGATTTTGTGGTTAATGTGTA-CY3-3'。(1)预混好的检测septin9基因甲基化的引物探针混合液：(2)DNAPCR扩增MIX：实施例2试剂盒检测septin9基因甲基化1)取10例血浆样本进行游离DNA提取，游离DNA提取试剂盒来自天根生化科技有限公司；2)游离DNA提取完成，对提取好的DNA进行重亚硫酸盐转化，得到纯化好的DNA，转化试剂盒来自天根生化科技有限公司；3)配制PCR扩增反应体系：4)PCR扩增程序如下：第一扩增阶段：37℃UDG酶反应2min；第二扩增阶段：95℃预变性3min；第三扩增阶段：94℃变性15s，60℃退火延伸35s，45个循环；信号收集，第三阶段60℃收集FAM，VIC信号。5)检测结果分析利用上述反应体系对10例样本进行检测，能够准确检出5例阳性样本，目的基因Ct值与内参基因Ct值之差均小于11，说明septin9发生甲基化。对剩下的5例阴性样本没有扩增曲线，目的基因Ct值与内参基因Ct值之差均大于11，说明septin9没有发生甲基化。判读方法，如表1。表1结果判读参考样品和对照品的Ct值结果结果△Ct(Ct目的基因-Ct内参基因)≤11septin9发生甲基化△Ct(Ct目的基因-Ct内参基因)>11septin9未发生甲基化6)成品试剂盒的性能验证利用配制完成的成品试剂盒进行产品精密度、稳定性的检测，根据上述设置的条件进行产品性能验证，使用上述提取的样本，若目的基因Ct值与内参基因Ct值之差均小于11，说明septin9发生甲基化。若目的基因Ct值与内参基因Ct值之差均大于11，说明septin9没有发生甲基化。图2中，上图表示的是阳性样本进行8次重复，目的基因Ct值与内参基因Ct值之差均小于11，说明septin9发生甲基化；下图表示的是阴性样本进行8次重复，目的基因Ct值与内参基因Ct值之差均小于11，说明septin9发生甲基化。以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的核心思想。应当指出，对于本
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的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。SEQUENCELISTING<110>北京鑫诺美迪基因检测技术有限公司<120>检测septin9基因甲基化的引物及试剂盒<130>P20160144<160>8<170>PatentInversion3.5<210>1<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>1ccgaaataatcccatccaac20<210>2<211>26<212>DNA<213>人工序列<400>2gcgattcgttgtttattagttattat26<210>3<211>18<212>DNA<213>人工序列<400>3gtgatggaggaggtttag18<210>4<211>18<212>DNA<213>人工序列<400>4aaattacaaaaaccacaa18<210>5<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>5ttatgtcggatttcgcggttaa22<210>6<211>25<212>DNA<213>人工序列<400>6caccacccaacacacaataacaaac25<210>7<211>24<212>DNA<213>人工序列<400>7acccgctgcccaccagccatcatg24<210>8<211>27<212>DNA<213>人工序列<400>8tatgttggattttgtggttaatgtgta27当前第1页1 2 3