本发明属于生物检测
技术领域：
，具体涉及一种用于检测和鉴定沙门氏菌及其血清型的引物对以及检测和鉴定沙门氏菌及其血清型的方法。
背景技术：
：沙门氏菌是引发食物中毒最主要食源性致病菌之一，能够在人和动物之间进行传播。食物产品中含有多种丰富的营养成分，非常适宜沙门氏菌的生长繁殖，人们一旦摄入了含有大量沙门氏菌的动物性产品，就会引起细菌性感染，进而在毒素的作用下发生食物中毒。沙门氏菌不仅危害人类健康，还会给畜牧业带来巨大的经济损失。由沙门氏菌引起的疾病主要分为两大类：一类是伤寒和副伤寒，另一类是急性肠胃炎。感染沙门氏菌的人或带菌者的粪便污染食品，可使人发生食物中毒。据统计在世界各国的种类细菌性食物中毒中，沙门氏菌引起的食物中毒常列榜首。我国内陆地区得的食物中毒也以沙门氏菌为首位。沙门氏菌在自然界有广泛的宿主，少数沙门氏菌对宿主有选择性，绝大多数对人和动物均适应，可寄居在哺乳类、爬行类、鸟类、昆虫及人的胃肠道中，种类繁多的家养和野生动物的感染率在1％～20％以上。故各种家禽、家畜在喂养、屠宰、运输、包装等加工处理过程中均有污染的机会。如家禽、家畜屠宰时的卫生条件差，肠腔的沙门氏菌就可污染肉类。此外，肉类等也可在贮藏、市场出售、厨房加工等过程中通过各种用具或直接互相污染，其中在零售市场购买的生肉有1％～58％污染了沙门菌。蛋类或蛋制品的污染来源，可以是禽类卵巢或输尿管，也可以由粪便、肥料、泥土中的沙门氏菌穿过完整蛋壳进入蛋内。一般在许多由蛋混合制成的蛋粉或其他制品中，感染率相当高；乳类及其制品如冰淇淋、袋装熟食等也会受到沙门氏菌的污染。以上各种动物源性食物是引起沙门氏菌感染的最常见媒介物。以动物脏器为原料的某些生物制剂，如酶、激素、胆盐、食用染料等偶尔也会引起感染。发展中国家常常有水源污染造成的暴发流行，污水灌溉、生熟不分是散发或家庭集团内流行最常见的原因。人与人的直接传播常以护理人员的手、医疗器械为媒介，为医院内感染或幼托机构中暴发流行的主要原因。沙门氏菌感染的临床表现多种多样，按其主要症候群，可分为肠炎型、伤寒型、败血症型和局部化脓性感染四型。其中，肠炎型(食物中毒)是沙门氏菌感染最常见的形式，潜伏期一般为8～24小时。起病急骤，常伴有恶寒、发热，但热度一般不甚高，同时出现腹绞痛、气胀、恶心、呕吐等症状。继而发生腹泻，一天数次至十数次或更多，如水样，深黄色或带绿色，有些有恶臭。粪便中常混有未消化食物及少量粘液，偶带脓血，当炎症蔓延至结肠下段时，可有里急后重。病程大多为2～4天，有时持续时间较长。鼠伤寒沙门氏菌感染时，以腹泻、高热为主，脓血便多见；成人高热较少，热程较短，腹痛及里急后重较多，而儿童高热较久，呕吐及脱水较多。偶有呈霍乱样暴发性胃肠炎型者，病人呕吐和腹泻均剧烈，体温在病初时升高，立即下降，脉弱而速，可出现严重脱水、电解质紊乱、肌肉痉挛、尿少或尿闭，如抢救不及时，可于短期内因急性肾功能衰竭或周围循环衰竭而死亡。另外，虽然在免疫功能正常的宿主中，沙门氏菌感染引起败血症的机会不到10％，但新生儿、婴儿免疫功能还不完善，其脑膜易受沙门氏菌感染侵犯从而引发败血症型，其病死率可高达80％以上。综合上述沙门氏菌特点，沙门氏菌经口进入人体后，与机体抵抗力、吞噬细菌的数量、感染的血清型有关。不同血清型细菌的侵袭力与致病力显著不同，所以在临床上不仅急需对病原菌进行快速的定性诊断，更重要的，需要快速明确诊断受感染沙门氏菌的血清型，才能更好的指导临床确诊以及治疗方案。目前全世界已分离出沙门氏菌的血清型多达2600种，46个血清组，我国约有300种血清型，37个血清组。当前世界各国的国家标准和ISO标准以及国内外各公共卫生机构对沙门氏菌的检测方法均采用传统的细菌学培养检测方法分离鉴定沙门氏菌并测定其血清型。此方法一般需要经过预增菌、选择性增菌、选择性平板划线分离、生物化学鉴定和血清学分型验证等5个步骤。上述细菌学培养检测方法的缺点是：(1)增菌需要经过漫长的培养过程，最终得到阳性结果至少需要4天，确认为阴性结果则需要7天，重复确认验证则需要更长的时间，所以导致检测周期长，工作量大。(2)成本较高，耗费人力和物力。(3)在测定沙门氏菌的血清型时，血清型的判读流程繁琐，且需要操作人员的主观判断，误差较大，重复性差。整个检测方法过程复杂繁琐、耗时耗力，越来越成为相关检测部门的沉重负担。在面对日益复杂的食品安全形势和不断提高的食品安全控制要求，以及临床对沙门氏菌及其血清型的快速准确的检测的需求上，传统的细菌学培养检测方法已远远不能满足当今对沙门氏菌及其血清型的快速准确检测的需求。因此，开发快速方便的检测沙门氏菌及其血清型的方法，成为当前的迫切需要。而且准确划分沙门氏菌血清型对于研究沙门氏菌流行病学特征具有重要意义，对于监测疾病传播与暴发以及疾病控制都有着不可或缺的作用。PCR(PolymeraseChainReaction)扩增技术具有操作简便、快速、灵敏度高、特异性强等优点，已被广泛应用于微生物检测，尤其是在难于培养的细菌检测和抗原结构复杂的细菌鉴定方面具有其他方法无可比拟的优势。同时随着基因测序工作的进一步深入，越来越多的物种基因组序列已经测定完成并被收录在数据库中。沙门氏菌是较早开展基因组测序的食源性致病菌之一，测序技术的不断革新与进步，加快了我们揭示沙门氏菌的基因序列信息的速度。到目前已经有报道采用PCR扩增技术用于定性检测沙门氏菌，但在实际应用中用于扩增的引物对的灵敏性和特异性仍然不尽人意，而且，至今还未有使用现有引物进行PCR扩增后能直接用于基因序列的检测来快速确定沙门氏菌血清型的报道。所以，开发快速方便的检测沙门氏菌及其血清型一体检测的方法仍然是本领域迫切需要的。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种可用于沙门氏菌及其血清型检测的引物对、利用该引物对检测沙门氏菌及血清型的方法以及试剂盒。本发明所提供的用于对沙门氏菌及其血清型进行检测的引物对S9和S69，如下所示：S9对应的引物为：S9-F：5’-GAGGTCACGCACCATCACAAT-3’和S9-R：5’-ATACGGCACCACCGCATAG-3’；S69对应的引物为：S69-F：5’-CACAGGAGGAGCAGGATAA-3’和S69-R：5’-CCAGTACAGCAAGGGACAT-3’。所述引物对S9和S69对沙门氏菌及其血清型均具有较强的特异性，能对沙门氏菌及其血清型进行特异性定性检测。所述引物对S9和S69其对应的扩增基因分别是：bcfC，ssaQ(bcfC是编码鞭毛引导蛋白的相关基因，而ssaQ是编码三型分泌系统蛋白的相关基因)，这两个基因在沙门氏菌属内保守。本发明的第二个目的是提供一种沙门氏菌及血清型的一体检测方法。本发明所提供的沙门氏菌及血清型的一体检测方法，可包括以下步骤：步骤一：提取待测菌株的DNA；步骤二：将步骤一中提取的DNA作为模板，在上述引物对的引导下进行PCR扩增；步骤三：通过凝胶电泳，检测步骤二中的PCR扩增产物，定性判断实验菌株是否为沙门氏菌；所述判断标准为：如果凝胶电泳结果中出现对应明显亮色条带，则表明该条带对应的菌株为沙门氏菌菌株，否则为非沙门氏菌菌株；步骤四：将步骤三中有明显亮色条带(定性判断为沙门氏菌)的PCR产物进行序列测定；步骤五：将步骤四中的测定序列与提供的国内常见38种沙门氏菌血清型的标准序列差异比对表(表3)进行比对，序列完全一致方认定为同一血清型。本发明的第三个目的是提供一种用于对沙门氏菌及其血清型进行检测的试剂盒。本发明所提供的试剂盒，包括上述用于对沙门氏菌及其血清型进行检测的引物对。为方便检测，所述试剂盒中还可包括阳性对照和阴性对照，所述阳性对照为沙门氏菌的DNA，所述阴性对照为不含DNA的扩增体系(如双蒸水)。采用以上方案，本发明具有以下优点：本发明所述引物对S9和S69在沙门氏菌属内保守，对沙门氏菌血清型具有较强的特异性，在应用于检测沙门氏菌及血清型时，在功能上不仅可以快速、准确的检测鉴定未知菌株是否为沙门氏菌菌株，还能在确认是沙门氏菌菌株的基础上，进一步快速、准确的检测确认该菌株所对应的沙门氏菌血清型。本发明的引物对应用范围广泛，可用于超过国内常见的至少38种沙门氏菌血清型菌株，具有较高灵敏度，易于操作，检测速度快，成本低廉。本发明所述沙门氏菌及血清型的一体检测方法，具有检测方法快速、有效、低成本、操作简单、灵敏度高等优点。选取更少的靶点，建立新型沙门氏菌及血清型的一体检测方法对国内常见的38种沙门氏菌病原菌进行快速有效的检测，同时检测鉴定其血清型。使得从沙门氏菌的定性检测鉴定以其血清型的检测鉴定可一体同时完成，因此，本发明的沙门氏菌及血清型的一体检测方法更简单，时间短，成本低，结果判定方便准确，误判率低，更加具有实用性。综上所述，本发明的技术方案为沙门氏菌及其血清型的一体检测提供了新的技术平台，可用于畜牧业生产单位、基层医疗卫生单位和各疾病预防控制中心筛查和检测沙门氏菌，具有广阔的市场前景和较大的经济、社会效益，适于大范围推广应用。为了方便使用与理解，下面结合具体实施方式和实施例以及附图对本发明技术方案做进一步详细说明。(特别指出：这些描述仅仅是示例性的描述，并不构成对本发明范围的限制)附图说明图1为本发明引物筛选及验证流程图；图2为本发明引物对S9引导下PCR扩增的凝胶电泳图；其中，M：100bpDNAladdermarker；1、2、3、5、7、8、9：沙门氏菌菌株；4、6：非沙门氏菌菌株；阴：阴性对照；图3为本发明引物对S69引导下PCR扩增的凝胶电泳图；其中，M：100bpDNAladdermarker；1、2、3、6、7、8、9：沙门氏菌菌株；4、5：非沙门氏菌菌株；阴：阴性对照。具体实施方式本发明中使用的国内常见38种沙门氏菌血清型的菌株信息如表4所示。本发明所提供的用于对沙门氏菌及其血清型进行检测的引物对S9和S69，如下所示：S9对应的引物为：S9-F：5’-GAGGTCACGCACCATCACAAT-3’和S9-R：5’-ATACGGCACCACCGCATAG-3’；S69对应的引物为：S69-F：5’-CACAGGAGGAGCAGGATAA-3’和S69-R：5’-CCAGTACAGCAAGGGACAT-3’。S9对应的沙门氏菌标准序列如SEQIDNo.7所示，S69对应的沙门氏菌标准序列如SEQIDNo.8所示。所述引物对S9和S69对沙门氏菌及其血清型均具有较强的特异性，对沙门氏菌及其血清型进行特异性定性检测。所述引物对S9和S69其对应的扩增基因分别是：bcfC和ssaQ(bcfC是编码鞭毛引导蛋白的相关基因，而ssaQ是编码三型分泌系统蛋白的相关基因)，这两个基因在沙门氏菌属内保守。所述用于对沙门氏菌及其血清型进行检测的引物对S9和S69的筛选方法包括如下步骤：步骤一：基于NCBI上公布的26株沙门氏菌全基因组序列和2180株非沙门氏菌的其他细菌的全基因组序列，采用比较基因组的方法，从生物信息学的角度，筛选获得沙门氏菌属内保守且相对非沙门氏菌属间特异的361个候选检测靶点；步骤二：以步骤一得到的候选检测靶点为模板，设计200对引物对；步骤三：对上述200对引物对进行合成，进行特异性初步评价，筛选出PCR产物电泳带型亮且均一的特异性较好的28对引物对；步骤四：对上述28对引物对进行灵敏度评价，筛选得到17对特异性和灵敏度均好的对引物对；步骤五：将上述17对引物对通过151株沙门氏菌与34株非沙门氏菌的检测分析，最终获得对所有的沙门氏菌均能扩增出了单一的目标条带、对所有的非沙门氏菌均无任何扩增条带出现的15对引物对；步骤六：对步骤五中的15对引物对进行大量的试验验证，得到对沙门氏菌及其血清型的检测均具有较强特异性的两对引物对——S9和S69。(筛选方法流程见图1)本发明所提供的沙门氏菌及血清型的一体检测方法，包括以下步骤：步骤一：提取待测菌株的DNA；步骤二：将步骤一中提取的DNA作为模板，在上述引物对的引导下进行PCR扩增；其中，PCR检测的靶点目标为沙门氏菌的特异性引物S9或S69；步骤三：通过凝胶电泳，检测步骤二中得到的PCR扩增产物，定性判断菌株是否为沙门氏菌。所述判断标准为：如果凝胶电泳结果中出现对应明显亮色条带，则表明该条带对应的菌株为沙门氏菌菌株，否则为非沙门氏菌菌株；步骤四：将步骤三中有明显亮色条带的PCR产物进行序列测定；步骤五：将步骤四中的测定序列与提供的国内常见38种沙门氏菌血清型的标准序列差异比对表(表3)进行比对，序列完全一致方认定为同一血清型；任选地，步骤六：将上述步骤未能区分血清型的待测菌株使用另一引物对S69或S6重复上述步骤二至步骤五进行沙门氏菌及其血清型的定性鉴定。所述步骤一中，待测菌株任选经过待测样品的增菌培养后获得的；所述待测样品为食品，选自畜禽制品、蛋类或蛋类制品、乳类或乳类制品、其他食品样品。所述步骤一中，DNA的提取可采用CTAB法、商用DNA提取试剂盒等方法。所述步骤二或步骤六中，S9对应的引物为：S9-F：5’-GAGGTCACGCACCATCACAAT-3’和S9-R：5’-ATACGGCACCACCGCATAG-3’；S69对应的引物为：S69-F：5’-CACAGGAGGAGCAGGATAA-3’和S69-R：5’-CCAGTACAGCAAGGGACAT-3’。所述步骤二中PCR扩增的反应体系为：(NH4)2SO4缓冲液(10x)：2.5μL；MgCl2溶液(50mmol/L)：1.5μL；dNTP(2.5mmol/L)：1.5μL；上下游引物(各10μmol/L)：0.5μL+0.5μL；TaqDNA聚合酶(1U/μL)：1.0μL；模板：2.5μL；无菌去离子水：15μL；总体积：25μL。所述步骤二中PCR扩增的条件为：以S9引导的PCR的扩增条件为：94℃预变性5min；接着作35个循环，每个循环包括94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸40s；循环结束后72℃延伸10min；降温至12℃，取出产物；以S69引导的PCR的扩增条件为：95℃预变性10min；接着作35个循环，每个循环包括94℃变性30s，58℃退火45s，72℃延伸45s；循环结束后72℃延伸10min；降温至12℃，取出产物。所述步骤三中，凝胶电泳的检测PCR扩增产物的方法为：取3μLPCR产物，与加样缓冲液混匀，混合物加到含有稀释10000倍的核酸染料的1.5％琼脂糖凝胶点样孔中，同时在第一个点样孔中加入5μL100bpDNAladdermarker，接通电源，凝胶电泳电压控制160～170V，时间20～30min。以下以具体实施例对本发明做进一步说明，这些实施例为示例性描述，不对本发明的定义范围进行限制。如若有未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，如相关说明书或者实验室正规教材或手册进行实施。实施例1：沙门氏菌及其血清型一步鉴定的方法，包括以下步骤：首选进行样品的采样分菌：在上海闵行区欧尚超市采集3份肉类食品样品，进行增菌和培养，获得待测菌株9株。步骤一：对上述获得的9株待测菌株采用CTAB法提取DNA，以伤寒沙门氏菌为阳性对照，去离子纯净水为阴性对照。步骤二：将步骤一中提取的DNA作为模板，在引物对S9的引导下进行PCR扩增；PCR扩增的反应体系为：(NH4)2SO4缓冲液(10x)：2.5μL；MgCl2溶液(50mmol/L)：1.5μL；dNTP(2.5mmol/L)：1.5μL；上下游引物(各10μmol/L)：0.5μL+0.5μL；TaqDNA聚合酶(1U/μL)：1.0μL；模板：2.5μL；无菌去离子水：15μL；总体积：25μL；PCR扩增的反应条件为：94℃预变性5min；接着作35个循环，每个循环包括94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸40s；循环结束后72℃延伸10min；降温至12℃，然后取出产物；扩增后结果请见下表1表1：S9所对应的引物序列及PCR扩增片段步骤三：取3μL上述步骤二的PCR产物，与1μL加样缓冲液混匀，混合物加到含有稀释10000倍的核酸染料的1.5％琼脂糖凝胶点样孔中，同时在第一个点样孔中加入5μL100bpDNAladdermarker，接通电源，160V电泳20～30min，待条带跑到大约三分之二的位置时，取出琼脂糖凝胶，放在凝胶成像仪中成像。结果如图2所示，凝胶板在1号、2号、3号、5号、7号、8号、9号的对应位置出现7条明显亮条带，说明该条带对应的1号、2号、3号、5号、7号、8号、9号菌株是沙门氏菌菌株，其余4号和6号菌株是非沙门氏菌菌株；步骤四：将判断为沙门氏菌的1号、2号、3号、5号、7号、8号、9号菌株的PCR产物进行序列测定；步骤五：将步骤四中的测定序列结果与国内常见38种沙门氏菌血清型的标准序列差异比对表(表3)进行比对；比对鉴定结果如下：其中1号、2号、7号、9号沙门氏菌的血清型为SalmonellaEnteritidis；3号沙门氏菌的血清型为SalmonellaCholeraesuis；5号和8号沙门氏菌用S9引物扩增序列完全一致，不能确定其血清型。步骤六：将上述步骤五中不能确定血清型的5号和8号沙门氏菌的DNA在引物对S69的引导下进行PCR扩增，重复上述步骤二至步骤五的类似操作进行检测鉴定。结果为5号沙门氏菌的血清型为SalmonellaInfantis，8号沙门氏菌的血清型为SalmonellaTyphimurium。通过与国内常见38种沙门氏菌血清型的菌株信息表(表4)对比，最终结果为：1号、2号、7号、9号沙门氏菌的血清型为肠炎沙门氏菌(ATCC13076)；3号沙门氏菌的血清型为猪霍乱沙门氏菌(ATCC7001)；5号沙门氏菌的血清型为婴儿沙门氏菌(CMCC50204)；8号沙门氏菌的血清型为鼠伤寒沙门氏菌(ATCC19585)。实施例2：沙门氏菌及其血清型一步鉴定的方法，包括以下步骤：首选进行样品的采样分菌：在上海闵行区欧尚超市采集2份乳类和2份蛋类食品样品，进行增菌和培养，获得待测菌株9株。步骤一：对上述获得的9株待测菌株采用CTAB法提取DNA，以伤寒沙门氏菌为阳性对照，去离子纯净水为阴性对照。步骤二：将步骤一中提取的DNA作为模板，在引物对S69的引导下进行PCR扩增；PCR扩增的反应体系为：(NH4)2SO4缓冲液(10x)：2.5μL；MgCl2溶液(50mmol/L)：1.5μL；dNTP(2.5mmol/L)：1.5μL；上下游引物(各10μmol/L)：0.5μL+0.5μL；TaqDNA聚合酶(1U/μL)：1.0μL；模板：2.5μL；无菌去离子水：15μL；总体积：25μL；PCR的扩增条件为：95℃预变性10min；接着作35个循环，每个循环包括94℃变性30s，58℃退火45s，72℃延伸45s；循环结束后72℃延伸10min；降温至12℃，取出产物；扩增后结果请见表2表2：S69所对应的引物序列及PCR扩增片段步骤三：取3μL上述步骤二的PCR产物，与1μL加样缓冲液混匀，混合物加到含有稀释10000倍的核酸染料的1.5％琼脂糖凝胶点样孔中，同时在第一个点样孔中加入5μL100bpDNAladdermarker，接通电源，160V电泳20～30min，待条带跑到大约三分之二的位置时，取出琼脂糖凝胶，放在凝胶成像仪中成像。结果如图3所示，凝胶板在1号、2号、3号、6号、7号、8号、9号的对应位置出现7条明显亮条带，说明该条带对应的1号、2号、3号、6号、7号、8号、9号菌株是沙门氏菌菌株，其余4号和5号菌株是非沙门氏菌菌株；步骤四：将判断为沙门氏菌的1号、2号、3号、6号、7号、8号、9号菌株的PCR产物进行序列测定；步骤五：将步骤四中的测定序列结果与国内常见38种沙门氏菌血清型的标准序列差异比对表(表3)进行比对；比对鉴定结果如下：1号、2号、6号沙门氏菌的血清型为SalmonellaTyphimurium；3号和7号沙门氏菌的血清型为SalmonellaInfantis；8号和9号沙门氏菌的血清型为SalmonellaHadar。通过与国内常见38种沙门氏菌血清型的菌株信息表(表4)对比，最终结果为：1号、2号、6号沙门氏菌的血清型为鼠伤寒沙门氏菌(ATCC19585)；3号和7号沙门氏菌的血清型为婴儿沙门氏菌(CMCC50204)；8号和9号沙门氏菌的血清型为哈达尔沙门氏菌(ATCC51956)。表3.国内常见38种沙门氏菌血清型的标准序列参比表续表3.国内常见38种沙门氏菌血清型的标准序列参比表续表3.国内常见38种沙门氏菌血清型的标准序列参比表S69突变位点17217795161179209227236242245249274340Typhi(参比)ATATCTCATCAGGTSaintpaulTAGKottbusTTAGAATyphimuriumTCAGNewportTCAGInfantisTTAGAMuenchenTTACAGAAberdeenTTAGBareillyTTGAGBovismorbificansTAGGLondonTAGHvittingfossTGTCGAGAGHadarTTCAGAPotsdamTAGGGallinarumTGTAGAC表4国内常见38种沙门氏菌血清型的菌株信息表当前第1页1 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