一种沙门氏菌及其血清型一体检测的方法与流程

技术特征：

1.一种用于沙门氏菌及其血清型检测的引物对，其特征在于，所述引物对为S9和S69；其中，

引物对S9为：S9-F：5’-GAGGTCACGCACCATCACAAT-3’和S9-R：5’-ATACGGCACCACCGCATAG-3’；

引物对S69为：S69-F：5’-CACAGGAGGAGCAGGATAA-3’和S69-R：5’-CCAGTACAGCAAGGGACAT-3’。

2.根据权利要求1所述引物对，其特征在于，所述引物对S9和S69对应的扩增基因分别是：bcfC，ssaQ。

3.根据权利要求1或2所述引物对，其特征在于，引物对S9和S69的筛选方法包括如下步骤：

步骤一：基于公布的26株沙门氏菌全基因组序列和2180株非沙门氏菌的其他细菌的全基因组序列，采用比较基因组的方法，从生物信息学的角度，筛选获得沙门氏菌属内保守且相对非沙门氏菌属间特异的361个候选检测靶点；

步骤二：以步骤一得到的候选检测靶点为模板，设计200对引物对；

步骤三：对上述200对引物对进行合成，进行特异性初步评价，筛选出PCR产物电泳带型亮且均一的特异性较好的28对引物对；

步骤四：对上述28对引物对进行灵敏度评价，筛选得到17对特异性和灵敏度均好的引物对；

步骤五：将上述17对引物对通过151株沙门氏菌与34株非沙门氏菌的检测分析，最终获得对所有的沙门氏菌均能扩增出单一的目标条带、对所有的非沙门氏菌均无任何扩增条带的15对引物对；

步骤六：对步骤五中的15对引物对进行试验验证，得到对沙门氏菌及其血清型的检测均具有较强特异性的两对引物对——S9和S69。

4.一种沙门氏菌及其血清型一体检测方法，其特征在于，包含权利要求1所述引物对。

5.根据权利要求4所述检测方法，其特征在于，步骤包括：

步骤一：提取待测菌株的DNA；

步骤二：将步骤一中提取的DNA作为模板，使用引物对S9或S69进行PCR扩增；

步骤三：通过凝胶电泳，检测步骤二中得到的PCR扩增产物，定性判断菌株是否为沙门氏菌；

所述判断标准为：如果凝胶电泳结果中出现对应明显亮色条带，则表明该条带对应的菌株为沙门氏菌菌株，否则为非沙门氏菌菌株；

步骤四：将步骤三中有明显亮色条带的PCR产物进行序列测定；

步骤五：将步骤四中测出的序列与沙门氏菌血清型的标准序列进行比对，序列完全一致方认定为同一血清型。

6.根据权利要求5所述检测方法，其特征在于，

所述步骤一中，待测菌株可以经过待测样品的增菌培养后获得的；所述待测样品为食品，选自畜禽制品、蛋类或蛋类制品、乳类或乳类制品、其他食品样品。

7.根据权利要求5所述检测方法，其特征在于，

所述步骤二中PCR扩增的反应体系为：(NH4)₂SO₄缓冲液：2.5μL；50mmol/L的MgCl₂溶液：1.5μL；2.5mmol/L的dNTP：1.5μL；10μmol/L的上下游引物：0.5μL+0.5μL；1U/μL的Taq DNA聚合酶：1.0μL；模板：2.5μL；无菌去离子水：15μL；总体积：25μL；

所述步骤二中PCR扩增的条件为：以S9引导的PCR的扩增条件为：94℃预变性5min；接着作35个循环，每个循环包括94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸40s；循环结束后72℃延伸10min；降温至12℃，取出产物；以S69引导的PCR的扩增条件为：95℃预变性10min；接着作35个循环，每个循环包括94℃变性30s，58℃退火45s，72℃延伸45s；循环结束后72℃延伸10min；降温至12℃，取出产物。

8.根据权利要求5所述检测方法，其特征在于，

所述步骤三中，凝胶电泳检测PCR扩增产物的方法为：取3μL的PCR产物，与加样缓冲液混匀，混合物加到含有稀释10000倍的核酸染料的1.5％琼脂糖凝胶点样孔中，同时在第一个点样孔中加入5μL的100bp的DNA ladder marker，接通电源，凝胶电泳电压控制160～170V，时间20～30min。

9.一种沙门氏菌及其血清型一体检测试剂盒，其特征在于，包含权利要求1所述引物对。

10.根据权利要求4或9所述检测方法或试剂盒，其特征在于，提供了38种沙门氏菌血清型的标准序列作为参比表，如下表所示：