本发明涉及一种提取三孢酸的方法。
背景技术：
三孢酸是1,1,3-三甲基-2-(3-甲基辛基)环己烷氧化的不饱和衍生物，呈油状、淡黄色固体，是二菇类或类胡萝卜素降解中形成的,为三抱布拉氏霉菌、Mucedo等毛曲霉目的性激素。它是3种物质的混合物:三孢酸A、B、C,也称β1、β2、β3因子，因为它们刺激β-胡萝卜素的合成，而且只有在三孢布拉氏(十)(一)菌株混合培养时才会产生。本方法提供一种三孢酸的提取方法，及其后续检测方法。本发明利用的是β－胡萝卜素发酵液作为原料提取三孢酸，其中三孢酸作为β-胡萝卜素发酵过程中三孢布拉氏霉菌的的副产物，能够刺激β-胡萝卜素的合成，因此从发酵液中提取三孢酸加入到发酵过程中能够极大的促进β-胡萝卜素的积累。
技术实现要素：
本发明利用的是β－胡萝卜素发酵液作为原料提取三孢酸，其中三孢酸作为β－胡萝卜素发酵过程中三孢布拉氏霉菌的的副产物，能够刺激β-胡萝卜素的合成，因此从发酵液中提取三孢酸加入到发酵过程中能够极大的促进β-胡萝卜素的积累。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案是：一种提取三孢酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）种子液培养：将三孢布拉氏霉正负菌分别活化后转接到500mL三角瓶中，种子培养基装液量100mL，培养温度为27℃，摇床转速220rpm，培养时间为48h；
（2）发酵培养：将步骤（1）得到的正负菌种子液按比例接种到发酵培养基中，接入500mL三角瓶中，培养基装液量100mL，培养温度为27℃，摇床转速220rpm，发酵生产β-胡萝卜素，在发酵培养24h后，48h前，加入抗生素；
（3）三孢酸的提取：取步骤（2）中1L发酵液放入离心机，5000 rpm、20min离心，取上清，量取500mL，加稀盐酸调节pH至1.0-2.0，加入500mL分析纯三氯甲烷纯萃取，静置5min，然后溶液分层，收集溶液下层-三氯甲烷相，并向三氯甲烷相内加入等体积的质量分数为3-4%碳酸氢钠，萃取静置5min，然后溶液分层；收集溶液上层-水相，利用盐酸调节溶液至pH 1.0- 2.0；再加入等体积三氯甲烷萃取静置5min，分层收集下层-三氯甲烷相，利用旋转蒸发仪，真空浓缩至黄色油状残留物，利用乙醇定容于5ml棕色容量瓶，并闭光保存留作后续分析。
进一步，所述种子培养基组成为：玉米淀粉3.5%、黄豆饼粉 2.3%、KH2PO4 0.15%、MgSO4∙7H2O 0.01%、工业玉米浆 1%、豆油 0.5%。
进一步，所述发酵培养基组成为：玉米淀粉3.0%、黄豆饼粉2.0%、KH2PO4 0.25%、MgSO4∙7H2O 0.02%、豆油3.0%、工业玉米浆2.0%、维生素B1 0.005%、柠檬酸三钠 0.3%、曲拉通 0.1%、BHT 0.05%、pH为7.0-8.0。
进一步，以10%的体积比将正负菌按1:4的比例接入500mL三角瓶中。
进一步，所述抗生素加入方式是一次性加入、分批加入或流加。
一种检测三孢酸的方法，其特征在于：将上述任意方法所得的三孢酸用乙醇稀释后，利用高效液相色谱方法进行三孢酸含量的检测，流动相：A :0.1% TFA超纯水， B 100%甲醇，并梯度洗脱，35min内从50%线性升至70%；流速：1.0 mL/min，温度：30℃，检测器：UV 325 nm 进样量为10uL。
本发明的优点在于：本发明利用的是β－胡萝卜素发酵液作为原料提取三孢酸，通过调整三孢布拉氏霉正负菌的接种比例控制三孢酸A、B、C的比例，同时采用高效液相色谱，将三种混合物有效的分离，得出三孢酸的出峰时间。本发明的提取方法简便、高效，并且提升了三孢酸的纯度。
附图说明
图1为本发明提取的三孢酸的液相色谱图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明的技术方案进行清楚、完整的描述，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
一、三孢酸的发酵液的获取
1 种子培养基
将三孢布拉氏霉正负菌分别活化后转接到500mL三角瓶中，培养基装液量100mL，培养温度为27℃，摇床转速220rpm，培养时间为48h；
种子培养基组成为：玉米淀粉3.5%、黄豆饼粉 2.3%、KH2PO4 0.15%、MgSO4∙7H2O 0.01%、工业玉米浆 1%、豆油 0.5%。
2 发酵培养
将上述正负菌种子液按比例接种到发酵培养基，发酵生产β-胡萝卜素，其特征在于，在发酵培养24h后，48h前，加入不同浓度、不同种类的抗生素，抗生素加入的方式是一次性加入、分批加入或流加。
发酵培养基组成为：玉米淀粉3.0%、黄豆饼粉2.0%、KH2PO4 0.25%、MgSO4∙7H2O 0.02%、豆油3.0%、工业玉米浆2.0%、维生素B1 0.005%、柠檬酸三钠 0.3%、曲拉通 0.1%、BHT 0.05%、pH为7.0-8.0。以10%的体积比正负菌1:4的比例接入500mL三角瓶中，培养基装液量100mL，培养温度为27℃，摇床转速220rpm。
二、三孢酸的提取
1取1L发酵液 5000 rpm 20min离心，取上清，量取500mL
2利用稀盐酸调节pH至1.0
3 500mL分析纯三氯甲烷分析纯萃取静置5min，然后溶液分层，
4收集溶液下层-三氯甲烷相，并加入等体积的3-4%的碳酸氢钠 萃取静置5min，然后溶液分层
5 收集溶液上层-水相，利用盐酸调节溶液至pH 1.0
6 再加入等体积三氯甲烷静置5min并混匀。
7 利用旋转蒸发仪 真空浓缩至黄色油状残留物，利用乙醇定容于5ml棕色容量瓶，并闭光保存留作后续分析。
三、三孢酸的的检测
利用HPLC（高效液相色谱）方法进行三孢酸含量的检测
用Agilent chemstation进行数据的采集，
检测方法： 流动相：A :0.1% TFA超纯水， B 100%甲醇，并梯度洗脱，35min内从50% 35min内线性升至70%；流速：1.0 mL/min，温度：30℃，检测器：UV 325 nm 进样量为10uL。
实施例2
一、三孢酸的发酵液的获取
1 种子培养基
将三孢布拉氏霉正负菌分别活化后转接到500mL三角瓶中，培养基装液量100mL，培养温度为27℃，摇床转速220rpm，培养时间为48h；
种子培养基组成为：玉米淀粉3.5%、黄豆饼粉 2.3%、KH2PO4 0.15%、MgSO4∙7H2O 0.01%、工业玉米浆 1%、豆油 0.5%。
2 发酵培养
将上述正负菌种子液按比例接种到发酵培养基，发酵生产β-胡萝卜素，其特征在于，在发酵培养24h后，48h前，加入不同浓度、不同种类的抗生素，抗生素加入的方式是一次性加入、分批加入或流加。
发酵培养基组成为：玉米淀粉3.0%、黄豆饼粉2.0%、KH2PO4 0.25%、MgSO4∙7H2O 0.02%、豆油3.0%、工业玉米浆2.0%、维生素B1 0.005%、柠檬酸三钠 0.3%、曲拉通 0.1%、BHT 0.05%、pH为7.0-8.0。以10%的体积比正负菌1:4的比例接入500mL三角瓶中，培养基装液量100mL，培养温度为27℃，摇床转速220rpm。
二、三孢酸的提取
1取1L发酵液 5000 rpm 20min离心，取上清，量取500mL
2利用稀盐酸调节pH至1.5
3 500mL分析纯三氯甲烷分析纯萃取静置5min，然后溶液分层，
4收集溶液下层-三氯甲烷相，并加入等体积的3-4%的碳酸氢钠 萃取静置5min，然后溶液分层
5 收集溶液上层-水相，利用盐酸调节溶液至pH 1.5
6 再加入等体积三氯甲烷静置5min并混匀。
7 利用旋转蒸发仪 真空浓缩至黄色油状残留物，利用乙醇定容于5ml棕色容量瓶，并闭光保存留作后续分析。
三、三孢酸的的检测
利用HPLC（高效液相色谱）方法进行三孢酸含量的检测
用Agilent chemstation进行数据的采集，
检测方法： 流动相：A :0.1% TFA超纯水， B 100%甲醇，并梯度洗脱，35min内从50% 35min内线性升至70%；流速：1.0 mL/min，温度：30℃，检测器：UV 325 nm 进样量为10uL。
实施例3
一、三孢酸的发酵液的获取
1 种子培养基
将三孢布拉氏霉正负菌分别活化后转接到500mL三角瓶中，培养基装液量100mL，培养温度为27℃，摇床转速220rpm，培养时间为48h；
种子培养基组成为：玉米淀粉3.5%、黄豆饼粉 2.3%、KH2PO4 0.15%、MgSO4∙7H2O 0.01%、工业玉米浆 1%、豆油 0.5%。
2 发酵培养
将上述正负菌种子液按比例接种到发酵培养基，发酵生产β-胡萝卜素，其特征在于，在发酵培养24h后，48h前，加入不同浓度、不同种类的抗生素，抗生素加入的方式是一次性加入、分批加入或流加。
发酵培养基组成为：玉米淀粉3.0%、黄豆饼粉2.0%、KH2PO4 0.25%、MgSO4∙7H2O 0.02%、豆油3.0%、工业玉米浆2.0%、维生素B1 0.005%、柠檬酸三钠 0.3%、曲拉通 0.1%、BHT 0.05%、pH为7.0-8.0。以10%的体积比正负菌1:4的比例接入500mL三角瓶中，培养基装液量100mL，培养温度为27℃，摇床转速220rpm。
二、三孢酸的提取
1取1L发酵液 5000 rpm 20min离心，取上清，量取500mL
2利用稀盐酸调节pH至2.0
3 500mL分析纯三氯甲烷分析纯萃取静置5min，然后溶液分层，
4收集溶液下层-三氯甲烷相，并加入等体积的3-4%的碳酸氢钠 萃取静置5min，然后溶液分层
5 收集溶液上层-水相，利用盐酸调节溶液至pH 2.0
6 再加入等体积三氯甲烷静置5min并混匀。
7 利用旋转蒸发仪 真空浓缩至黄色油状残留物，利用乙醇定容于5ml棕色容量瓶，并闭光保存留作后续分析。
三、三孢酸的的检测
利用HPLC（高效液相色谱）方法进行三孢酸含量的检测
用Agilent chemstation进行数据的采集，
检测方法： 流动相：A :0.1% TFA超纯水， B 100%甲醇，并梯度洗脱，35min内从50% 35min内线性升至70%；流速：1.0 mL/min，温度：30℃，检测器：UV 325 nm 进样量为10uL。
最后的液相检测结果： 通过相关文献对比，最后确定三孢峰出峰时间：19.131min。
以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。