一种微生物快速检测方法与流程

本发明属于微生物检测领域，具体涉及一种微生物快速检测方法。
背景技术：
：在食品、药品和化妆品生产、卫生监督等领域，为了确保产品质量，从原材料的采购到成品出厂，都有相应的质控标准，其中微生物检测就是常规质控项目。使用最广泛的微生物检测方法主要是平板培养法，利用特异性培养基来分离培养样品中存活的微生物，使这些活的微生物能在平板上形成各种形态的菌落。这种方法灵敏、直观、准确，能同时提供被检样品中微生物的数量和种类。但是，平板培养法存在以下缺点：1、耗时长，从开始培养到形成肉眼可见的菌落需要1～5天的时间；2、操作繁琐，制备平板、培养、菌落计数、生化鉴定过程中需要进行大量的消毒灭菌和清洗工作，要耗费大量的人力和物力；对操作人员的技术水平要求高，容易出现人为误差；3、检测结果滞后，无法快速、实时提供检测信息，不利于生产和监督部门及时采取纠偏措施。虽然近年来平板培养法有所改进，但仍然无法实时获得检测结果，不能满足使用部门及时发现和控制污染、加速产品放行、减少仓储费用、加快资金周转、及时调整生产销售计划等需求。因此，亟需研发一种微生物快速检测方法。技术实现要素：为了解决现有技术的不足，本发明提供了一种微生物快速检测方法，该方法能有效缩短检测微生物所用的时间，还具有成本低廉、节省人力物力、检测结果可靠等优点。为解决上述技术问题，本发明提供一种微生物快速检测方法，在特异性液体培养基富集培养样品中目标微生物的整个过程中，使用一种由有机硅材料和颜色指示剂溶液组成的传感器来检测目标微生物生长时所代谢的小分子产物（例如二氧化碳、小分子酸），此类代谢产物渗透进入传感器中导致传感器的颜色发生变化，以此来判断样品中是否存在目标微生物。作为本发明优选的技术方案，所述的特异性液体培养基的作用是为目标微生物提供丰富的营养物质，促进其生长繁殖，同时抑制其它非目标微生物的生长，所述特异性液体培养基采用营养肉汤、胰蛋白胨大豆肉汤、麦芽汁液体培养基、煌绿乳糖胆盐肉汤、AC肉汤、布氏-哈斯肉汤、马铃薯葡萄糖肉汤、PA肉汤、RV肉汤以及其它对各种目标微生物具有促生长作用的培养液中的任意一种。作为本发明优选的技术方案，所述的有机硅材料包括基础聚合物、交联剂和催化剂，其中所述的基础聚合物是指含乙烯基的有机聚硅氧烷；所述交联剂是指含硅氢键的有机聚硅氧烷；所述催化剂是指有机锡类催化剂、铂系催化剂、或钛酸酯及其配合物催化剂；各组分的含量为：78wt%-99wt%基础聚合物，0.5wt%-20wt%交联剂，0.5wt%-2wt%催化剂；所述颜色指示剂溶液中颜色指示剂的含量为0.01wt%-1wt%；所述有机硅材料与颜色指示剂溶液的重量比为3:(0.15-0.5)。作为本发明优选的技术方案，所述基础聚合物为α,ω-二乙烯基聚二甲基硅油、或甲基乙烯基MQ硅树脂；所述交联剂为线性甲基氢聚硅氧烷、环状甲基氢聚硅氧烷、或甲基氢MQ硅树脂；所述催化剂是二羟酸二烷基锡、二羧酸亚锡、铂-乙烯基硅氧烷配合物、醇改性氯铂酸催化剂、铂-炔烃基配合物、或单烷氧基型钛酸酯；所述颜色指示剂选自溴甲酚绿、酚酞、酚红、甲酚红、石蕊、百里酚蓝、溴百里酚蓝、邻本二酚紫、石蕊精、醌喹亚胺、亮黄、中性红、玫红酸、大黄苷、2，2′-二羟基苯乙烯酮、α-萘酚酞、甲酚红紫、姜黄素、二甲苯酚蓝以及其它颜色指示剂中的一种或多种。作为本发明优选的技术方案，所述的传感器为不透明或半透明弹性固体，初始颜色为黑色、棕色、黑褐色、墨绿色以及其它深颜色，因有机硅材料具有高透气性并有选择性的只让某些气体和小分子物质通过，而其它液体、固体和微生物都不能进入，因此可大幅度的排除样品的干扰，只有微生物生长代谢产物中的小分子物质（例如二氧化碳、小分子酸）才能渗透进入到传感器中并导致传感器的颜色最终变为黄色、红色、橙红色或橙黄色，并使传感器的透光度或折光率增大。所述的传感器检测到的微生物代谢产物越多，它变色所用的时间就越短，传感器的透光度或折光率越大。作为本发明优选的技术方案，该方法包括制备一种快速检测微生物的装置，该装置包含上层、下层两部分，上层内置特异性液体培养基，下层内置传感器，传感器与特异性液体培养基直接接触。作为本发明优选的技术方案，所述的一种快速检测微生物的装置为圆柱体、正方体、长方体或其他合适形状的透明可密封容器。作为本发明优选的技术方案，包括以下使用步骤：⑴处理样品：用无菌稀释液将样品做适度稀释，液体样品也可不用稀释处理；⑵移取适量经步骤⑴处理后的样品到所述的快速检测微生物的装置中，密封后混合均匀；⑶培养：将步骤⑵的快速检测微生物的装置放在目标微生物适宜的温度下培养，细菌类的培养1-24h，真菌类的培养1-48h；⑷判断结果：肉眼观察步骤⑶的快速检测微生物的装置中的传感器初始颜色是否发生改变，初始颜色发生改变的则表明样品中有目标微生物存在，初始颜色没有发生改变的则表明样品中没有目标微生物存在。作为本发明的优选技术方案，所述步骤⑷可以采用自动化的实现途径，即：使用外部光源和光子探测技术对传感器因颜色变化导致的透光度或折光度的变化实时监测，通过计算机控制系统自动分析快速确定目标微生物含量。与现有技术相比，本发明具备以下技术效果：本发明相对平板培养方法而言，细菌检测只需1-24h，霉菌酵母菌检测只需1-48h，明显缩短了检测时间，微生物检测装置事先预制，即拿即用，省略了大量配置培养基、清洗玻璃仪器的工作。若结合新光源和光子探测技术，采用计算机控制系统监控传感器的透光度或折光率变化，可以实时获知检测结果。附图说明图1为本发明中一种快速检测微生物的装置的结构示意图。具体实施方式下面结合具体实施例进一步阐明本发明，但这些实施例只是用于说明本发明，而不是限制本发明的范围。实施例1如图1所示，本发明一种快速检测微生物的装置，包括瓶盖1和瓶身2，瓶身2分为上层、下层两个部分：上层为培养区21，内含特异性液体培养基；下层为检测区22，内置传感器。所述的特异性液体培养基，此处具体可以是营养肉汤，用来检测细菌总数。所述快速检测微生物的装置制备过程如下：1、制备传感器：（1）制备颜色指示剂溶液：0.5wt%溴百里酚蓝，0.05wt%二甲苯酚蓝，溶于20%乙醇溶液中；（2）混合有机硅材料与颜色指示剂溶液：首先依次称取含氢量为0.24%的线性甲基氢聚硅氧烷0.8g、α,ω-二乙烯基聚二甲基硅油28.5g和10ppm铂-乙烯基硅氧烷配合物0.7g于塑料杯中，然后按有机硅材料：颜色指示剂溶液=3:0.2的重量比称取颜色指示剂溶液于同一塑料杯中，混合均匀，使指示剂均匀分散在有机硅材料中，分装于带盖的小瓶底部，约1cm厚度，静置1-24小时后即凝固成型。2、灌装和灭菌液体培养基：A.将营养肉汤灌入传感器已凝固成型的小瓶中，营养肉汤的体积为小瓶容积的2/3；B.盖上瓶盖后，将小瓶放入高压灭菌锅按营养肉汤的灭菌要求灭菌；C.取出后即可得成品。应用：使用这种微生物检测装置时，首先将样品用无菌稀释液做一个合适比例的稀释，然后取1mL样品稀释匀液加入到该装置中，拧紧瓶盖混匀瓶中液体正置于36℃下培养1-24h。该装置底部的传感器变黄，表示加进去的样品稀释匀液中有细菌存在。加入该装置中的样品所含目标微生物的数量越多，传感器变色所用的时间越短。以下针对本发明与专利申请号PCT/US2010/003242所述装置进行了对比试验，主要对检测时间进行对比，具体结果见表1。表1本发明与专利申请号PCT/US2010/003242所述装置的数据对比表样品本发明检测所用时长PCT/US2010/003242发明检测所用时长GB4789.2-2010平板培养法检出来的菌落数和所用时长菌液11.8h2.0h4.0×108CFU/mL，48h菌液22.5h2.7h3.2×107CFU/mL，48h菌液33.8h4.0h3.8×106CFU/mL，48h菌液45.6h5.8h4.2×105CFU/mL，48h菌液56.9h7.0h3.6×104CFU/mL，48h菌液68.0h8.3h5.1×103CFU/mL，48h菌液710.5h11.3h4.5×102CFU/mL，48h菌液814.2h15.2h6.0×101CFU/mL，48h表1中的菌液是使用新鲜的平板计数琼脂平板上任意挑取的菌落用无菌生理盐水制成的10倍梯度稀释菌液，然后从每个梯度菌液分别取1mL各自加入PCT/US2010/003242所述装置和本发明所述装置，再同时放入带有发射光源和光子探测器自动微生物培养检测系统中培养检测，得到上述表1中的数据。另每个菌液同时采用GB4789.2-2010平板培养法来检测菌落数。如表1所示，与PCT/US2010/003242所述装置相比，本发明检测所用时间更短，可见本发明缩短了检测微生物所用的时间。实施例2如图1所示，本发明一种快速检测微生物的装置，包括瓶盖1和瓶身2，瓶身2分为上层、下层两个部分：上层为培养区21，内含特异性液体培养基；下层为检测区22，内置传感器。所述的特异性液体培养基，此处具体可以是麦芽汁液体培养基，用来检测霉菌酵母菌。所述快速检测微生物的装置制备过程如下：1、制备传感器：（1）制备颜色指示剂溶液：0.2wt%溴百里酚蓝钠盐，0.3wt%酚红钠盐，溶于蒸馏水中加热溶解；（2）混合有机硅材料与颜色指示剂溶液：首先依次称取含氢量为0.8%的线性甲基氢聚硅氧烷0.15g、α,ω-二乙烯基聚二甲基硅油29.7g和30ppm醇改性氯铂酸催化剂0.15g于塑料杯中，然后按有机硅材料：颜色指示剂溶液=3:0.3的质量比称取颜色指示剂溶液于同一塑料杯中混合均匀，使指示剂均匀分散在有机硅材料中，分装于带盖的小瓶底部，约1cm厚度，静置1-24小时后即凝固成型。2、灌装和灭菌液体培养基：A.将麦芽汁液体培养基灌入传感器已凝固成型的小瓶中，麦芽汁液体培养基的体积为小瓶容积的1/3；B.盖上瓶盖后，将小瓶放入高压灭菌锅按营养肉汤的灭菌要求灭菌；C.取出后即可得成品。应用：使用这种微生物检测装置时，首先将样品用无菌稀释液做一个合适比例的稀释，然后取1mL样品稀释匀液加入到该装置中，拧紧瓶盖混匀瓶中液体正置于28℃下培养1-48h。该装置底部的传感器变黄，表示加进去的样品稀释匀液中有霉菌酵母菌存在。加入该装置中的样品所含目标微生物的数量越多，传感器变色所使用的时间越短。实施例3如图1所示，本发明一种快速检测微生物的装置，包括瓶盖1和瓶身2，瓶身2分为上层、下层两个部分：上层为培养区21，内含特异性液体培养基；下层为检测区22，内置传感器。所述的特异性液体培养基，此处具体可以是煌绿乳糖胆盐肉汤，用来检测大肠菌群。所述快速检测微生物的装置制备过程如下：1、制备传感器：（1）制备颜色指示剂溶液：0.1wt%溴百里酚蓝，0.01wt%甲酚红，溶于20%乙醇溶液中；（2）混合有机硅材料与颜色指示剂溶液：首先依次称取含氢量为0.32%的环状甲基氢聚硅氧烷0.48g、甲基乙烯基MQ硅树脂29.25g和30ppm铂-炔烃基配合物0.27g于塑料杯中，然后按有机硅材料：颜色指示剂溶液=3:0.5的质量比称取颜色指示剂溶液于同一塑料杯中，混合均匀，使指示剂均匀分散在有机硅材料中，并分装于带盖的小瓶底部，约1cm厚度，静置1-24小时后即凝固成型。2、灌装和灭菌液体培养基：A.将煌绿乳糖胆盐肉汤灌入传感器已凝固成型的小瓶中，煌绿乳糖胆盐肉汤的体积为小瓶容积的9/10；B.盖上瓶盖后，将小瓶放入高压灭菌锅按营养肉汤的灭菌要求灭菌。C.取出后即可得成品。应用：使用这种微生物检测装置时，首先将样品用适量的液体培养基进行增菌，然后取0.1-1mL样品增菌液加入到该装置中，拧紧瓶盖混匀瓶中液体正置于36℃下培养1-24h。该装置底部的传感器变黄，表示加进去的样品稀释匀液中有大肠菌群的存在。加入该装置中的样品所含目标微生物的数量越多，传感器变色所使用的时间越短。实施例4如图1所示，本发明一种快速检测微生物的装置，包括瓶盖1和瓶身2，瓶身2分为上层、下层两个部分：上层为培养区21，内含特异性液体培养基；下层为检测区22，内置传感器。所述的特异性液体培养基，此处具体可以是RV肉汤，用来检测沙门氏菌。所述快速检测微生物的装置制备过程如下：1、传感器的制备：（1）制备颜色指示剂溶液：1wt%溴百里酚蓝，0.1wt%二甲苯酚蓝，溶于20%乙醇溶液中；（2）混合有机硅材料与颜色指示剂溶液：首先依次称取含氢量为0.02%的甲基氢MQ硅树脂6g、α,ω-二乙烯基聚二甲基硅油23.4g和30ppm铂-炔烃基配合物0.6g于塑料杯中，然后按有机硅材料：颜色指示剂溶液=3:0.15的质量比称取颜色指示剂溶液于同一塑料杯中，混合均匀，使指示剂均匀分散在有机硅材料中，并分装于带盖的小瓶底部，约1cm厚度，静置1-24小时后即凝固成型。2、灌装和灭菌液体培养基：A.将RV肉汤灌入传感器已凝固成型的小瓶中，RV肉汤的体积为小瓶容积的7/10；B.盖上瓶盖后，将小瓶放入高压灭菌锅按营养肉汤的灭菌要求灭菌；C.取出后即可得成品。应用：使用这种微生物检测装置时，首先将样品用适量的液体培养基进行增菌，然后取0.1-1mL样品增菌液加入到该装置中，拧紧瓶盖混匀瓶中液体正置于36℃下培养1-24h。该装置底部的传感器变黄，表示加进去的样品稀释匀液中有沙门氏菌的存在。加入该装置中的样品所含目标微生物的数量越多，传感器变色所使用的时间越短。实施例5如图1所示，本发明一种快速检测微生物的装置，包括瓶盖1和瓶身2，瓶身2分为上层、下层两个部分：上层为培养区21，内含特异性液体培养基；下层为检测区22，内置传感器。所述的特异性液体培养基，此处具体可以是煌绿乳糖胆盐肉汤，用来检测大肠菌群。所述快速检测微生物的装置制备过程如下：1、制备传感器：（1）制备颜色指示剂溶液：0.65wt%溴百里酚蓝，溶于20%乙醇溶液中；（2）混合有机硅材料与颜色指示剂溶液：首先依次称取含氢量为0.32%的线性甲基氢聚硅氧烷0.48g、α,ω-二乙烯基聚二甲基硅油29.25g和30ppm铂-炔烃基配合物0.27g于塑料杯中，然后按有机硅材料：颜色指示剂溶液=3:0.22的质量比称取颜色指示剂溶液于同一塑料杯中，混合均匀，使指示剂均匀分散在有机硅材料中，并分装于带盖的小瓶底部，约1cm厚度，静置1-24小时后即凝固成型。2、灌装和灭菌液体培养基：A.将煌绿乳糖胆盐肉汤灌入传感器已凝固成型的小瓶中，煌绿乳糖胆盐肉汤的体积为小瓶容积的4/5；B.盖上瓶盖后，将小瓶放入高压灭菌锅按营养肉汤的灭菌要求灭菌；C.取出后即可得成品。应用：使用这种微生物检测装置时，首先将样品用适量的液体培养基进行增菌，然后取0.1-1mL样品增菌液加入到该装置中，拧紧瓶盖混匀管中液体正置于36℃下培养1-24h。该装置底部的传感器变黄，表示加进去的样品稀释匀液中有大肠菌群的存在。加入该装置中的样品所含目标微生物的数量越多，传感器变色所使用的时间越短。实施例6此处所检样品为冰料类冷饮，限量要求菌落总数﹤100CFU/g，因此使用的微生物检测装置中的液体培养基是营养肉汤。检测步骤如下：⑴处理样品：用无菌生理盐水或磷酸盐缓冲液将原始样品进行稀释，制成1:10的样品匀液；⑵移取经步骤⑴处理后的样品0.1mL到实施例1制得的快速检测微生物的装置中，密封后混合均匀；⑶培养：将步骤⑵的快速检测微生物检的装置放在36℃下培养为1-24小时；⑷判断结果：肉眼观察步骤⑶的快速检测微生物的装置中的传感器初始颜色是否发生改变，初始颜色发生改变的则表明样品中有菌，原始样品中细菌总数﹥100CFU/g，样品不合格；初始颜色没有发生改变的则表明样品中没有菌，原始样品中细菌总数﹤100CFU/g，样品合格。表2表2中所用样品都购自超市，在保持包装完整的情况下30℃放置12h，本发明检测结果中的检测时长是开始培养后每间隔2～5h观察记录的时间,大体可知原始样品中菌含量越高，检测时长就越短，检测结果出来的越早。另外可使用新光源和光子探测技术，采用计算机控制系统来全程监控传感器的透光度或折光率变化，实时获得检测结果。实施例7此处所检样品为酸奶，限量要求霉菌酵母菌﹤10CFU/g，因此使用的微生物检测置中的液体培养基是麦芽汁液体培养基。检测步骤如下：⑴处理样品：用无菌生理盐水或磷酸盐缓冲液将原始样品进行稀释，制成1:10的样品匀液；⑵移取经步骤⑴处理后的样品1mL到实施例2制得的快速检测微生物的装置中，密封后混合均匀；⑶培养：将步骤⑵的快速检测微生物的装置放在28℃下培养为1-48小时；⑷判断结果：肉眼观察步骤⑶的快速检测微生物的装置中的传感器初始颜色是否发生改变，初始颜色发生改变的则表明样品中有菌，原始样品中细菌总数﹥10CFU/g，样品不合格；初始颜色没有发生改变的则表明样品中没有菌，原始样品中细菌总数﹤10CFU/g，样品合格。表3表3中所用样品都购自超市，在保持包装完整的情况下28℃放置4天。本发明检测结果中的检测时长是开始培养后每间隔2～5h观察记录的时间,大体可知原始样品中菌含量越高，检测时长就越短，检测结果出来的越早。另外可使用新光源和光子探测技术，采用计算机控制系统来全程监控传感器透光度或折光率变化，实时获得检测结果。实施例8此处所检样品为巴氏杀菌奶，限量要求为沙门氏菌﹤0/25g，因此使用的微生物检测置中的液体培养基是RV肉汤。检测步骤如下：⑴处理样品：取25g巴氏奶样品与225mL沙门氏菌一步增菌培养基混合置于42℃增菌培养18-24h；⑵移取经步骤⑴处理后的样品0.1-1mL到实施例4制得的快速检测微生物的装置中，密封后混合均匀；⑶培养：将步骤⑵的快速检测微生物的装置放在36℃下培养时间为1-24小时，⑷判断结果：肉眼观察步骤⑶的快速检测微生物的装置中的传感器初始颜色是否发生改变，初始颜色发生改变的则表明样品中有菌存在，需要对检测装置内的培养液进行下步的生化鉴定，以最终确定样品是否超标；初始颜色没有发生改变的则表明样品中没有菌存在，样品合格。表4表4中所用样品都购自超市，由于市面上的巴士杀菌奶中基本检不出沙门氏菌，找不到阳性样品，因此在25mL巴士杀菌奶3和25mL巴士杀菌奶4中添加0.1mL新鲜的沙门氏菌培养物，作为阳性样品。本发明检测结果中的检测时长是开始培养后每间隔2～5h观察记录的时间,大体可知原始样品中菌含量越高，检测时长就越短，检测结果出来的越早。另外可使用新光源和光子探测技术，采用计算机控制系统来全程监控传感器透光度或折光率变化，实时获得检测结果。当前第1页1 2 3