一种小菜蛾颗粒体病毒的定量检测方法与流程

本发明属于生物技术领域，涉及一种病毒的定量检测方法，具体地，本发明涉及小菜蛾颗粒体病毒的定量检测方法，更具体地，本发明所述的方法包括小菜蛾颗粒体病毒的样品处理和实时荧光定量检测，本发明还提供了用于所述小菜蛾颗粒体病毒定量检测的试剂盒及该试剂盒的用途。

背景技术：

小菜蛾颗粒体病毒(Plutella xylostella granulovirus，PxGV)隶属杆状病毒科颗粒体病毒属，对小菜蛾(Plutella xylostella(L.))具有较强的致病和杀灭作用。光学显微镜下观察，病毒包涵体呈强折光性的颗粒；电子显微镜观察，包涵体呈长椭圆形，大小为320×185nm，内部含有1个病毒粒子，由分子量为85kb的双链DNA和蛋白衣壳组成；病毒感染力主要由DNA和蛋白衣壳的完整性决定，病毒粒子外包裹了致密晶格的颗粒体蛋白，形成病毒的包涵体。病毒包涵体可以加工成环保安全的生物杀虫剂，用于防治小菜蛾。

小菜蛾是发生在十字花科蔬菜上最具破坏性的世界性害虫之一，因其生长周期短、发生代数多、防治次数频繁，是目前抗药性最为严重的害虫之一，在防治上难度很大。小菜蛾颗粒体病毒具有较强的专化性，害虫不易对其产生抗性；其病毒的后效作用明显，当环境条件适合时，患病虫体内扩增的病毒释放到小菜蛾种群中可以造成病毒病的流行。把小菜蛾颗粒体病毒制成生物农药用于防治小菜蛾，效果非常显著。目前，小菜蛾颗粒体病毒原药和制剂已取得农药登记许可，并在在国内外均已得到了广泛应用，但由于颗粒体病毒自身特点所限，其颗粒体病毒产品的病毒粒子的精确定量一直困扰着产品的标准化。目前仍然使用显微计数法用于原药的检测，由于小菜蛾颗粒体病毒粒子过小，仅0.5μm，即使原药也难以准确计数，而病毒制剂更无法直接检测，必须通过生物测定的方法确定。

迄今，国内外尚未制定出统一可行的小菜蛾颗粒体病毒的检测方法。目前亟需建立一种简便快捷、灵敏度高、重复性好的检测方法。

技术实现要素：

因此，本发明的目的是提供一种小菜蛾颗粒体病毒的定量检测方法，本发明的方法包括小菜蛾颗粒体病毒的样品处理以及实时荧光定量检测。本发明提供的方法区别于常规的病毒定量检测方法，不需要提取纯化的小菜蛾颗粒体病毒的DNA，而只需要将小菜蛾颗粒体病毒的包涵体使用本发明的碱裂解液裂解后，便可以直接用于测定。本发明提供的方法可以实现对小菜蛾颗粒体病毒的核酸进行定量无损耗的简易提取，同时本发明提供的方法还使用了小菜蛾颗粒体病毒质粒标准分子作为阳性标准品并用于制作标准曲线，因此，本发明提供的小菜蛾颗粒体病毒的定量检测方法简便快捷、灵敏度高、重复性好。另外地，本发明还提供了用于小菜蛾颗粒体病毒定量检测的试剂盒，本发明提供的试剂盒使用方便，可以满足当前对小菜蛾颗粒体病毒定量检测的需求。

本发明是通过以下的技术方案实现的。

一方面，本发明提供了一种小菜蛾颗粒体病毒的定量检测方法，所述方法包括以下步骤：

1)使用碱裂解液处理小菜蛾颗粒体病毒样品；

2)使用实时荧光定量PCR检测经步骤1)处理后的小菜蛾颗粒体病毒样品；

其中，所述碱裂解液包含以下组分：50-200mmol/L NaCl，50-200mmol/L Na₂CO₃，1-20mmol/L EDTA，0.1-1mg/ml蛋白酶K；

优选地，所述碱裂解液包含以下组分：80-120mmol/L NaCl，80-120mmol/L Na₂CO₃，3-8mmol/L EDTA，0.1-0.5mg/ml蛋白酶K；

更优选地，所述碱裂解液包含以下组分：50mmol/L NaCl，50mmol/L Na₂CO₃，2.5mmol/L EDTA，0.2mg/ml蛋白酶K；

优选地，所述小菜蛾颗粒体病毒样品与所述碱裂解液的体积比为1～100:1，更优选地，所述小菜蛾颗粒体病毒样品与所述碱裂解液的体积比为1～10:1，进一步优选地，所述小菜蛾颗粒体病毒样品与所述碱裂解液的体积比为9:1；

优选地，在步骤1)中，在37℃下，使用所述碱裂解液处理病毒样品至少1小时；更优选地为3-5小时；进一步优选地为4小时；

优选地，在所述处理期间，上下颠倒晃动样品，使其充分溶解。

优选地，将经过步骤1)处理的小菜蛾颗粒体病毒样品用水稀释后，再进行实时荧光定量PCR检测；

优选地，所述稀释的倍数为500-2000倍，更优选地为800-1200倍，进一步优选地为1000倍。

优选地，所述实时荧光定量PCR可以使用常规的荧光定量试剂盒进行。在一个优选的实施方案中，所述实时荧光定量PCR使用如SEQ ID NO:1所示的质粒标准分子；

SEQ ID NO:1

CCTGCCCGGTCTGTCTACGTTTGCGTACCGCTCCCAGGTGGGCGTCGACACCATAGAGCAGATAATATCTAGAGATTCTCTATTCCAAGGTAACGGTAGATCGGCCTACAAATTGAACGTTGACGAATTCGTCGATTCCGCTACTCTAACGTACGAACAGGACATGATAATATTCAGGAACGGACCCCTTACTGCGCTGTTCGATTTCCCTCACTTGGCGGT

更优选地，所述方法使用的引物序列如SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示：

SEQ ID NO:2：CCTGCCCGGTCTGTCTACG

SEQ ID NO:3：ACCGCCAAGTGAGGGAAATC

在一个优选的实施方案中，所述PCR的反应体系如下所示：

待测样品1μl，50ng/μl的质粒标准分子DNA 1μl，浓度10M的SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示的引物各0.5μl，2×UltraSYBR Mixture 12.5μl，用H₂O补足至25μl。

其反应条件：在95℃预变性10min后，扩增40个循环，循环条件：95℃30s，62℃1min。

另一方面，本发明提供了一种用于定量检测小菜蛾颗粒体病毒的试剂盒，其中所述试剂盒包括：

碱裂解液，其中，所述碱裂解液包含以下组分：50-200mmol/L NaCl，50-200mmol/L Na₂CO₃，1-20mmol/L EDTA，0.1-1mg/ml蛋白酶K；优选地，所述碱裂解液包含以下组分：80-120mmol/L NaCl，80-120mmol/L Na₂CO₃，3-8mmol/L EDTA，0.1-0.5mg/ml蛋白酶K；更优选地，所述碱裂解液包含以下组分：50mmol/L NaCl，50mmol/L Na₂CO₃，2.5mmol/L EDTA，0.2mg/ml蛋白酶K；

质粒标准分子；优选地，所述质粒标准分子的核酸序列如SEQ ID NO:1所示；更优选地，所述试剂盒还包括用于特异性扩增SEQ ID NO:1所示的序列的引物序列；进一步优选地，所述引物序列如SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示；

其他的荧光定量PCR试剂；优选地，所述其他的荧光定量PCR试剂包括定量PCR预混液和/或小菜蛾颗粒体病毒DNA标准品；

优选地，所述定量PCR预混液为常用的试剂，包括PCR缓冲液、DNA聚合酶、dNTP、MgCl₂中的一种或多种。本领域技术人员可以根据需求调整。

优选地，本发明还提供了本发明的试剂盒在定量检测小菜蛾颗粒体病毒中的用途。

优选地，所述检测为实时荧光定量PCR检测。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

本发明提供了一种无损耗的小菜蛾颗粒体病毒样品预处理方法，本发明人发现，使用特定浓度的碱裂解液处理病毒样品，并进行特定的倍数稀释后，可以直接对小菜蛾颗粒体病毒样品进行定量PCR检测，无需额外的核酸提取，并且该方法对样品无损耗，操作方便，使得结果更准确。本发明提供的方法不仅可以定量检测小菜蛾颗粒体病毒，而且可以提高检测的准确性、可靠性，并且本发明的方法操作简单，使用到的仪器简易，可以广泛地推广应用到农药生产、农业病虫害防治等领域。

附图说明

以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：

图1为使用不同浓度的碱裂解液处理小菜蛾颗粒体病毒样品的结果，其中图a为通过荧光定量PCR法测定小菜蛾颗粒体病毒浓度，通过4种浓度对比实验，结果表明碱裂解液A、B、C三个浓度均可达到较好的碱解效果；图b为A、B、C三个浓度测得的结果的方差分析，可以得知三者之间不具有显著差异；

图2为使用本发明的碱裂解液C浓度对小菜蛾颗粒体病毒样品进行不同时间的碱解处理，从图中可以看出，荧光定量PCR法测定小菜蛾颗粒体病毒浓度随着时间的变化存在差异，结果表明碱裂解液处理4h效果最优；

图3为小菜蛾颗粒体病毒样品使用碱裂解液B碱解后，溶液经水稀释6个倍数后，使用荧光定量PCR法测定小菜蛾颗粒体病毒样品浓度，结果表明碱裂解液占溶液体积百分比为0.1％，即将碱解后的样品用水稀释1000倍效果最优；

图4为小菜蛾颗粒体病毒样品使用碱裂解液B碱解后，溶液经水稀释不同倍数后测定浓度，结果表明碱裂解液稀释1000倍后对样品浓度测定没有影响；

图5为通过构建含有小菜蛾颗粒体病毒特异性基因序列的质粒标准品制作标准曲线，得到线性方程y＝-3.3874x+40.771。图中，横坐标是模版起始拷贝数(浓度)的对数，纵坐标是实时荧光定量PCR扩增到阈值的循环次数，即Ct值；

图6为将小菜蛾颗粒体病毒同一样品，进行不同倍数的稀释，使用荧光定量法测定其浓度并制作曲线，检测结果在线性范围内的浓度底限为4×10⁷OB/ml；图7为将小菜蛾颗粒体病毒同一样品加入不同浓度的棉铃虫核型多角体病毒(HaNPV)和美洲粘虫颗粒体病毒(PuGV)的结果示意图，显示小菜蛾颗粒体病毒终浓度差异不显著。

图8为小菜蛾颗粒体病毒样本(原液)的信号颗粒散点图，颗粒体病毒样本中门内的颗粒占比约75.79％，特殊的颗粒被排除在外不予统计。

具体实施方式

本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件操作，例如Sambrook等编著的分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，2001)中所述的条件，或按制造厂商所建议的条件。

除非特别说明，本发明所用的试剂均为实验纯或分析纯，并且可以商购获得。

实施例1小菜蛾颗粒体病毒样品的定量检测方法

1.1样品处理

首先，使用本发明的碱裂解液将浓度为1×10¹³OB/ml的小菜蛾颗粒体病毒原液，浓度为1×10¹²OB/g的小菜蛾颗粒体病毒制剂，分别稀释10倍，例如原液取样品0.5ml，加入4.5ml碱裂解液；制剂样品称取0.05g溶解于5ml碱裂解液。所述碱解液配方：NaCl浓度为100mmol/L，Na₂CO₃浓度为100mmol/L，EDTA浓度为5mmol/L。将每种样品选取三个样品重复。

然后，将样品在37℃放置1h，期间每间隔15分钟上下颠倒晃动以使样品充分溶解。

最后，将处理后的样品用水稀释1000倍。

1.2荧光定量PCR测定

实时荧光定量PCR使用北京康为世纪生物技术有限公司的荧光定量PCR试剂盒UltraSYBR Mixture(with ROX II)。

扩增反应体系：上述待测样品1μl，SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3引物，浓度10M各0.5μl，2×UltraSYBR Mixture 12.5μl，用H₂O补足25μl。每个样品3个实验重复。

反应条件：在95℃预变性10min后，扩增40个循环，循环条件：95℃30s，62℃1min。

1.3样品浓度计算

将小菜蛾颗粒体病毒质粒标准分子进行系列稀释作为模板，通过上述实时荧光定量PCR步骤获得各浓度样品的Ct值，通过稀释浓度与Ct值之间的关系制作标准曲线，得到线性方程y＝-3.3874x+40.771(图5)。图中，横坐标是模版起始拷贝数(浓度)的对数，纵坐标是实时荧光定量PCR扩增到阈值的循环次数，即Ct值。

再根据稀释倍数，获得待测样品浓度计算公式：

原液样品浓度(OB/ml)＝(10^((Ct-40.771)/(-3.3874)))×10000000

制剂样品浓度(OB/g)＝(10^((Ct-40.771)/(-3.3874)))×5000000/样品重量

1.4结果分析

小菜蛾颗粒体病毒原液样品浓度为：1×10¹³OB/ml

小菜蛾颗粒体病毒制剂样品浓度为：1×10¹²OB/ml

实施例2小菜蛾颗粒体病毒样品的定量检测方法的方法学比较

2.1碱解液缓冲液浓度的确定

如实施例1所述的方法，分别使用下表1的碱裂解液，通过4个浓度对比实验(组成见表1)，处理时间均为1h，结果经方差分析表明碱裂解液A、B、C三个浓度均可(结果见图1a)。

虽然从样品终浓度平均值看是上升趋势，但经方差分析可以看出，三者之间不具有显著差异(图1b)。

表1 4组碱裂解液配方组成

2.2碱解液缓冲液处理时间的确定

如实施例1所述的方法，通过对碱裂解液C处理小菜蛾颗粒体病毒样品，处理时间为0.5h、1h、2h、4h和12h，结果表明碱裂解液使用浓度C处理时间越长，效果越好，但是日常应用中，以处理4小时左右最佳(结果见图2)。

2.3碱裂解液B处理后用水稀释倍数的确定

通过对碱裂解液B分别稀释6个浓度处理对比实验，结果表明碱裂解液占溶液体积百分比为0.1％，即将碱解后的样品用水稀释1000倍效果最优(结果见图3)。

2.4碱裂解液B稀释1000倍后对样品测定浓度的影响

使用碱裂解液B(水按照体积比1:1000)与纯水做为溶剂做比较，将小菜蛾颗粒体病毒样品稀释为4个浓度进行对比实验，结果表明碱裂解液稀释1000倍后对样品浓度测定没有影响。

2.5方法特异性检测

将同一种小菜蛾颗粒体病毒样品，稀释为不同倍数，使用荧光定量法测定其浓度并制作曲线，由图6可知，检测结果在线性范围内的浓度底限为4×10⁷OB/ml。

2.6方法特异性检测

将小菜蛾颗粒体病毒同一样品加入不同浓度的棉铃虫核型多角体病毒(HaNPV)和美洲粘虫颗粒体病毒(PuGV)，小菜蛾颗粒体病毒终浓度差异不显著，即使用荧光定量检测方法，加入其他病毒样品不影响小菜蛾颗粒体病毒浓度的测定结果，结果如图7所示。

实施例3对比例

对于同一样品，发明人首先使用默克密理博(Merck Millipore)公司的Guava easyCyte系列微毛细管细胞分析仪，通过计数法对的样品进行了流氏分析，每个样本收集30000个信号颗粒的数据。我们利用前向角(FSC-Hlog)和侧向角(SSC-Hlog)对信号颗粒做了散点图。根据颗粒大小和颗粒度信息对较均一的信号进行了圈门设定。分别统计门内信号颗粒的绝对数量，在30000个信号颗粒中所占的比例，以及颗粒的浓度等信息(如图8所示)。

最终获得的小菜蛾颗粒体病毒样品浓度为8.6×10⁶OB/ml。

然后，发明人使用如本发明的实施例1的方法进行荧光定量PCR法定量结果为4.2×10⁹OB/ml。

也就是说，本发明的方法得到的结果远高于流氏分析计数测定方法得到的结果。流氏分析计数方法测定小菜蛾颗粒体病毒结果比实际数值偏低，测定中发现存在颗粒聚集情况，可能是这种原因导致其结果偏低。

实施例4本发明的试剂盒的制备

可以制备包括以下组成成分的试剂盒：

小菜蛾颗粒体病毒碱裂解液(5mL/管)3管、定量PCR预混液(1.5mL/管)1管、小菜蛾颗粒体病毒DNA标准品(40μl/管)1管、小菜蛾颗粒体病毒质粒标准分子(10μl/管)1管、正向引物(100μl/管)1管、反向引物(100μl/管)1管、纯水(1mL/管)1管。

2×小菜蛾颗粒体病毒碱裂解液：小菜蛾颗粒体病毒碱裂解液(2×)。

质粒标准分子，浓度为40ng/μl(8×10¹¹个拷贝)。

正向引物、反向引物都是10μM。

2×Q-PCR预混液：Q-PCR预混液(2×)，(with ROX II)。

序列表

<110> 中国科学院动物研究所；河南省济源白云实业有限公司

<120> 一种小菜蛾颗粒体病毒的定量检测方法

<130> DIC16110041

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 222

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 质粒标准分子

<400> 1

cctgcccggt ctgtctacgt ttgcgtaccg ctcccaggtg ggcgtcgaca ccatagagca 60

gataatatct agagattctc tattccaagg taacggtaga tcggcctaca aattgaacgt 120

tgacgaattc gtcgattccg ctactctaac gtacgaacag gacatgataa tattcaggaa 180

cggacccctt actgcgctgt tcgatttccc tcacttggcg gt 222

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 2

cctgcccggt ctgtctacg 19

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 3

accgccaagt gagggaaatc 20