植物乳杆菌SG5在产γ‑氨基丁酸中的应用的制作方法

本发明涉及发酵技术领域，更具体地，涉及植物乳杆菌sg5在产γ-氨基丁酸中的应用。

背景技术：

γ-氨基丁酸(γ-aminobutyricacid，简称gaba)是哺乳动物神经中枢的一种抑制性递质，具有调节血压、促使精神安定、促进脑部血流、增进脑活力、营养神经细胞、增加生长激素分泌、健肝利肾、促进乙醇代谢(醒酒)等多种功效。2009年卫生部已正式批准gaba为新资源食品，富集gaba的原料可应用于生产功能性食品，通过饮食来降低和预防高血压。gaba的获取方法有化学合成法和生物法。化学合成法成本较高，产品中易残留化学物质，不属于天然产物，应用有条件限制。生物法主要从植物体和微生物发酵液中获取，相对于植物富集法的成本高、产率低和局限性大的缺点，微生物发酵法更有优越性，它不受空间、环境和资源的限制，具有成本低、无化学残留和产量高等显著优点，是富集γ-氨基丁酸的理想途径。

现有技术分离得到的产γ-氨基丁酸的微生物多为真菌，真菌生长较为缓慢，不能满足生产需要。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是克服现有技术存在的上述缺陷，提供植物乳杆菌sg5在产γ-氨基丁酸中的应用。

本发明的目的是通过以下技术方案予以实现的：

植物乳杆菌sg5在产γ-氨基丁酸中的应用，该植物乳杆菌sg5保藏在广东省微生物菌种保藏中心，保藏地址是广东省微生物研究所，保藏日期为2016年3月16日，保藏编号为gdmccno：60020。

本发明通过筛选获得一株可产γ-氨基丁酸的植物乳杆菌sg5，在mrs培养基上菌落较小、圆形、中间隆起，表面湿润光滑，不透明，乳白色，边缘整齐；革兰氏阳性菌，成对或链状。菌株形态呈两端钝圆的短杆状，长短不一，无芽孢，细胞大小为(0.5～1)μm×(2～3)μm，植物乳杆菌sg5为兼性厌氧菌，api50鉴定结果与植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)的id为99.9％。

本发明植物乳杆菌sg5可在mrs培养基上生长，其中培养基的最佳配方为20g/l酵母膏、20g/l葡萄糖、10g/l丁二酸钠、5mg/mll-谷氨酸、1mg/l磷酸吡哆醛及1mg/mlca²⁺。

所述植物乳杆菌sg5的16srdna序列如seqidno：1所示。

γ-氨基丁酸作为新型功能因子，具有降低血压的作用，因此可将该植物乳杆菌sg5扩大培养用于发酵生产γ-氨基丁酸。

具体地，所述植物乳杆菌sg5在产γ-氨基丁酸中的应用，是将植物乳杆菌sg5接种于液体培养基中30～37℃下培养16～48h即可。

更优选地，所述液体培养基的组成为每升培养基中含有20g/l酵母膏、20g/l葡萄糖、10g/l丁二酸钠、5mg/mll-谷氨酸、1mg/l磷酸吡哆醛及1mg/mlca²⁺。

最优选地，所述应用是将植物乳杆菌sg5接种于液体培养基中30℃培养48h，ph值为6.8，所述植物乳杆菌sg5的接种量为2％。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明提供了植物乳杆菌sg5在产γ-氨基丁酸中的应用，该植物乳杆菌sg5保藏在广东省微生物菌种保藏中心，保藏地址是广东省微生物研究所，保藏日期为2016年3月16日，保藏编号为gdmccno：60020；利用该菌进行发酵gaba的含量可达59μg/ml，gaba具有降血压、促进生长激素分泌和降低胆固醇等多种有益的保健功能，为开发新的富含γ-氨基丁酸的保健食品提供依据，将所述植物乳杆菌sg5应用于富含gaba的食品、保健品的开发，具有广泛的应用前景。

附图说明

图1为基于16srdna基因序列建立的乳杆菌属系统发育树。

图2为发酵液超高效液相色谱-质谱图；其中，a—gaba标准品的峰图；b—gaba标准品分子质量图谱；c—发酵液样品超高效液相色谱图；d—发酵液样品的分子质量图谱。

图3为sg5在mrs培养基(a)及乳酸菌分离培养基(含溴甲酚绿)平板(b)上的菌落形态图。

图4为菌株sg5革兰氏染色的细胞形态。

图5为sg5菌体投射电镜图。

具体实施方式

下面结合具体实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的简单修改或替换，均属于本发明的范围；若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1菌株的分离、筛选与鉴定

菌株分离：选取新鲜完整的桑叶先用自来水冲洗干净，在无菌超净台内用无菌水再冲洗及用无菌滤纸吸干水分，剪碎；将剪碎的桑叶置于mrsg液体培养基(mrs培养基中加入2％v/v，1mg/ml的谷氨酸钠)中，于30℃恒温培养箱培养2d，待桑叶碎片周围长出菌体，挑取菌体在mrs固体培养基上多次划线分离纯化；将纯化后的菌株于斜面培养基(mrs)培养，挑单菌落接种于发酵培养基tyg中30℃培养48h后做薄层定性，初步鉴定分离可知所得菌株可产γ-氨基丁酸。

阴性对照：为了检查桑叶表面除菌是否彻底，取最后一次无菌水冲洗液涂布在mrs固体培养基上作对照，另将无菌水清洗后的桑叶材料在mrs固体培养基上作对照，于相同的条件下培养。

经过多次重复，对照的平板培养基均无任何菌落长出，证明桑叶表面除菌彻底，分离到的菌是桑叶内细菌，而不是植株表面的附生菌。

菌株的筛选：以功能活性物质—γ-氨基丁酸为指标，采用响应面分析法优化菌株发酵条件。将-80℃保存的分离所得菌株于mrs液体培养基中30℃，120r/min培养16h，活化两次，接种于tyg发酵培养基中富集gaba。根据单因素实验结果对4个主要因素(底物浓度、发酵温度、发酵时间)进行响应面优化实验，建立实验模型，若实验模型显著，利用响应面优化试验方法，最终设计三因素三水平的响应面实验，以底物浓度、发酵温度和发酵时间3个因素为自变量，gaba产量为响应值，确定最优发酵条件。用berthelot比色法或hplc法对发酵液中富集的gaba定量分析，最终确定高产gaba菌株(简称为sg)。

菌株分子鉴定：对筛选得到的高产gaba菌株进行分子鉴定，按以下步骤进行：提取菌株的基因组dna，利用细菌16srdna的通用引物，以基因组dna为模板进行pcr扩增。然后利用胶回收试剂盒回收纯化pcr产物，之后进行克隆、转化，筛选阳性克隆的菌落，经扩大培养后委托广州华大基因技术有限公司进行测序。

测序可知菌株的16srdna序列长度为1371bp，其序列如seqidno：1所示，将测序结果与genbank中的16srdna序列进行同源性比对，然后用软件构建系统发育树(如图1所示)，以确定菌株的种属关系。同源性分析结果表明，该序列与lactobacillusplantarum(植物乳杆菌)的同源性达99％，因此将该高产gaba的菌株属于乳杆菌属(lactobacillus)，为植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)。

菌株菌落形态鉴定：在mrs培养基上菌落较小、圆形、中间隆起，表面湿润光滑，不透明，乳白色，边缘整齐；在乳酸菌分离培养基(含溴甲酚绿)平板，30℃培养48h，出现圆形乳白或黄色菌落，周围培养基变为黄色者初步确定为乳酸菌(如图3所示)。菌体形态经革兰氏染色后用显微镜于100倍的油镜下观察并拍照。如图4所示，可知其为革兰氏阳性菌，成对或链状。菌株细胞经透射电镜(tem,tenai12,holland)观察，见图5，形态呈两端钝圆的短杆状，长短不一，无芽孢，细胞大小为(0.5～1)μm×(2～3)μm。

菌落生理生化鉴定：参照《伯杰细菌鉴定手册》(第九版)、《常见细菌系统鉴定手册》和法国生物梅里埃api鉴定系统对植物乳杆菌进行鉴定，其结果如表1所示：

表1菌株sg-5的api50chl检测结果

注：“﹣”表示阴性，“﹢”表示阳性。

由表1结果再次验证，植物乳杆菌sg5api的id与lactobacillusplantarum(植物乳杆菌)为99％，将其命名为该植物乳杆菌sg5，该植物乳杆菌sg5保藏在广东省微生物菌种保藏中心(gdmcc)，保藏地址是广东省微生物研究所，保藏日期为2016年3月16日，保藏编号为gdmccno：60020。

实施例2菌株的培养

植物乳杆菌sg5可在mrs培养基上生长，mrs培养基(1000ml)由20g酵母膏、20g葡萄糖、10g丁二酸钠、5mg/mll-谷氨酸(0.5％v/v)、1mg磷酸吡哆醛(生长因子)及1mg/mlca²⁺和余量的蒸馏水组成，调节ph值6.8～7.0，于121℃高压灭菌20min。

1、植物乳杆菌sg5的活化：在超净工作台中无菌操作。用接种环挑取植物乳杆菌sg5，在mrs固体培养基上用接种环划线，在30℃培养箱中进行培养2d。

2、植物乳杆菌sg5发酵样品的制备：将分离得到的植物乳杆菌sg5接种于mrs液体培养基中，作3个重复，置于150r/min，30℃恒温振荡培养箱中，培养16～18h取出，作为种子液；将种子液按2％的接种量接种到装有50mltyg液体培养基的三角瓶中，置于150r/min30℃恒温振荡培养箱中培养2d，得发酵液(经优化得植物乳杆菌sg5的最适生长温度为30℃，最适生长环境的ph值为6.8)。

3、用超高效液相-质谱联用法对发酵液样品中gaba进行定性及定量的检测：gaba标准品购至sigma公司，乳酸菌发酵液样品的超高效液相色谱-质谱分析图与标准品gaba相比较见图2。

由图2可以看出标准品gaba的出峰时间在0.4～0.6min，其相对分子质量为104.0707；检测发酵液样品gaba相对分子质量为104.1072，与标准品gaba的相对分子质量十分接近，发酵液样品的出峰时间较标样的略宽些，还有一个小的杂峰出现，有可能是受到其他基质的干扰。该结果证实了发酵液中含有gaba。

4、高效液相色谱法(hplc)测定发酵液gaba含量

将sg5的发酵液沸水浴10min后，以12000r/min离心10min，用微量进样器吸取上清液用高效液相色谱法(hplc)法分别测定初筛的五个样品发酵液中γ-氨基丁酸的浓度(优化得植物乳杆菌sg5产γ-氨基丁酸的最佳液体发酵时间为48h，gaba的含量可达59μg/ml)。

sequencelisting

<110>华南农业大学

<120>植物乳杆菌sg5在产γ-氨基丁酸中的应用

<130>

<160>1

<170>patentinversion3.3

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<211>1371

<212>dna

<213>植物乳杆菌sg5的16srdna序列

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