本发明涉及一种酶活和稳定性提高的甲酸脱氢酶突变体及其构建方法，属于基因工程技术领域。
背景技术：
甲酸脱氢酶(FDH，EC 1.2.1.2)催化甲酸生成二氧化碳并伴随着NAD+还原生成NADH。由于该反应为不可逆反应，底物为廉价的甲酸，且产物为CO2等多种优势，甲酸脱氢酶被用作辅酶循环系统常与其他氧化还原酶组合用于羟基酸、手性醇、氨基酸等重要光学活性化合物的生物转化生产。其中来源于博伊丁假丝酵母的野生型FDH(CboFDH)被用于L-叔亮氨酸生产中的NADH再生，是现今工业化生产中甲酸脱氢酶应用规模最大的实例。随着CboFDH三维结构的精确解析，使得对其理性设计和精确的分子改造成为可能。
野生型CboFDH存在比酶活低和操作稳定性差的缺点，因此，定点突变改造CboFDH，提高比酶活和稳定性，可提高CboFDH再生辅酶NADH的效率，从而对手性化合物生物合成工业具有重要意义。
技术实现要素：
为了解决上述问题，本发明提供了一种酶活和稳定性提高的甲酸脱氢酶突变体及其制备方法等。
本发明的第一个目的是提供一种酶活和稳定性提高的甲酸脱氢酶突变体，其氨基酸序列是SEQ ID NO.1所示的序列。
所述突变体的氨基酸序列是在氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的氨基酸的基础上，将10位氨基酸由丙氨酸突变成半胱氨酸得到的。
本发明的第二个目的是提供编码所述突变体的核苷酸序列。
在本发明的一种实施方式中，编码所述突变体的核苷酸序列是SEQ ID NO.3所示的序列。
在本发明的一种实施方式中，所述核苷酸序列是在SEQ ID NO.4所示核苷酸序列的基础上，将编码第10位的丙氨酸的密码子突变成编码半胱氨酸的密码子而得到的。
本发明的第三个目的是提供含有编码所述突变体的核苷酸序列的重组表达载体。
本发明的第四个目的是提供一种表达所述甲酸脱氢酶突变体的基因工程菌。
在本发明的一种实施方式中，所述基因工程菌是将SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列连接到表达载体得到重组质粒，然后将重组质粒转化到宿主菌，即得到基因工程菌。
在本发明的一种实施方式中，所述基因工程菌为重组大肠杆菌基因工程菌。
在本发明的一种实施方式中，所述表达载体是pET28a。
在本发明的一种实施方式中，所述宿主菌为E.coli BL21。
在本发明的一种实施方式中，所述基因工程菌的制备方法，是在SEQ ID NO.4所示核苷酸序列的基础上，将编码第10位的丙氨酸的密码子突变成了编码半胱氨酸的密码子，得到重组基因，将重组基因连接到表达载体得到重组质粒，重组质粒转化到大肠杆菌BL21宿主菌中即得到重组基因工程菌。
在本发明的一种实施方式中，所述的制备方法，具体是：
(1)以SEQ ID NO.4所示核苷酸序列为模板，Flprimer(序列如SEQ ID NO.5所示)，Rlprimer(序列如SEQ ID NO.6所示)为引物，进行PCR即得到SEQ ID NO.3所示的重组基因A10C。
(2)将上一步得到的重组基因序列，连接到pET28a表达载体中，得到重组质粒pET28a-A10C，重组质粒化转化E.coli BL21，获得重组工程菌株，命名为pET28a-A10C/E.coli BL21。
本发明的第五个目的是提供所述突变体、编码所述突变体的核苷酸序列、含有编码所述突变体的核苷酸序列的载体、表达所述突变体的基因工程菌的应用。
在本发明的一种实施方式中，所述应用，包括与相应的脱氢酶组合构建辅酶NADH循环体系。
在本发明的一种实施方式中，所述应用，可用于羟基酸、手性醇、氨基酸等重要光学活性化合物的生物转化生产中的NADH再生。
本发明的有益效果：
本发明在天然甲酸脱氢酶的基础上，通过定点突变生物技术改造甲酸脱氢酶分子结构，本发明的突变体酶的纯酶比酶活较突变前提高1.3倍，60度的半衰期(t1/2)较突变期提高了6.8倍，铜离子耐受性较突变前提高30倍；同时本发明的突变体的耐酸性也有所提高，在pH＝4的条件下稳定性提高了2.0倍。此外，突变体酶A10C对底物NAD+亲和力Km较突变前降低1.4倍，而对底物甲酸亲和力Km较突变前降低不显著，而催化效率提高1.4倍。本发明表明10位氨基酸残基突变成半胱氨酸可以与天然甲酸脱氢酶原有的第30位半胱氨酸残基形成正确的二硫键，从而消除了游离半胱氨酸的氧化提高突变体酶对铜离子的抗性(铜离子是公认的促进巯基氧化的过渡金属离子)，并伴随着稳定性、比酶活和催化效率的增加。本发明所得的突变体酶可以相应的脱氢酶组合构建NADH辅酶循环体系应用于光学活性化合物和精细化学品的生物转化生产。
具体实施方式
TY发酵培养基：酵母粉8g/L，蛋白胨12g/L，K3PO4 4.02g/L，NaCl 3g/L，柠檬酸2g/L，柠檬酸铁铵0.3g/L，甘油10g/L，(NH)4SO4 2.5g/L，MgSO4·7H2O2。调节pH 7.2。
酶活定义：定义每分钟还原lμmol NAD+还原为NADH所需的酶量为一个酶活单位U。酶比活力定义为单位蛋白的酶活U/mg。
甲酸脱氢酶酶活测定方法：反应体系为10mmol/L pH 7.5的磷酸钾缓冲液中含1.67mmol/LNAD，167mmol/L甲酸钠。加入适量的酶液启动反应，30℃反应1.5分钟，每隔30s测定340nm吸光度的值并记录数据。根据反应液在340nm吸光值增量，计算出NADH的浓度,并计算出酶活力，反应式为：NaCOOH+NAD+＝CO2+NADH+Na+。
实施例1含甲酸脱氢酶突变体的重组载体的构建
(1)A10C突变体的获得：以SEQ ID NO.4所示核苷酸序列为模板，Fprimer(序列如SEQ ID NO.5所示)和Rprimer(序列如SEQ ID NO.6所示)为引物，进行PCR即得到SEQ ID NO.3所示的重组基因。
(2)将重组基因与pET28a分别用EcoR I、Xho I双酶切，纯化后用T4DNA连接酶16℃过夜连接。连接产物化学法转化E.coli BL21感受态细胞。转化液涂布含卡那霉素(50mg/L)LB平板，提取质粒，双酶切验证构建的重组质粒，命名为pET28a-A10C。测序工作由上海生工完成。
实施例2产甲酸脱氢酶突变体重组大肠杆菌工程菌构建
将实施例1得到的含正确重组质粒pET28a-A10C的菌株即为本发明的重组基因工程菌pET28a-A10C/E.coli BL21。
实施例3重组菌pET28a-A10C/E.coliBL21表达甲酸脱氢酶及酶活测定
将实施例2构建的重组菌pET28a-A10C/E.coli BL21与表达未突变的野生酶CboFDH(氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示)的对照菌株pET28a-FDH/E.coli BL21分别接种于l0mL含卡那霉素的LB培养基中，37℃振荡培养过夜，次日按4％的接种量转接于TY发酵培养基中，37℃培养4h后加入0.5mM的IPTG于24度诱导16小时。离心收集细胞并破碎，细胞破碎上清液(粗酶液)用于酶活力的测定。
将得到的粗酶液经纯化后得到甲酸脱氢酶突变体A10C，分析纯化后的重组甲酸脱氢酶突变体A10C动力学参数，如表1，突变体酶A10C对底物NAD+亲和力Km较突变前降低1.4倍，而对底物甲酸亲和力Km较突变前降低不显著，而催化效率提高1.4倍，比酶活较突变前提高1.3倍。
表1 A10C反应动力学参数
对得到的纯酶进行铜离子耐受性分析，在含有不同浓度铜离子的条件下检测野生型CboFDH和突变体酶A10C的酶活，其中突变体酶残余酶活为50％时所需的铜离子的浓度为15mM，而野生型酶CboFDH残余酶活为50％时所需的铜离子的浓度小于0.5mM。这表明突变体酶A10C对铜离子的耐受性提高了30倍以上。
对得到的纯酶进行热稳定性分析，在温度为60度条件下孵育不同时间，发现突变体酶的半衰期为21.6min，相比野生型CboFDH(3.2min)提高了6.8倍。
对得到的纯酶进行pH稳定性分析，在不同pH条件下孵育1h，发现突变体酶A10C的在酸性添加下的残余酶活比野生型酶CboFDH高，其中pH＝4时，突变体酶A10C的残余酶活为89.2％而野生型酶CboFDH仅为45.3％。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
<110> 江南大学
<120> 一种酶活和稳定性提高的甲酸脱氢酶突变体及其构建方法
<160> 6
<170> PatentIn version 3.3
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