一种O型口蹄疫病毒样颗粒及其制备方法和用途与流程

文档序号：12166967阅读：805来源：国知局

本发明涉及一种O型口蹄疫病毒样颗粒及其制备方法和用途，属于农业科学畜牧兽医科学技术领域。

背景技术：

动物病毒病的暴发流行往往严重影响整个国家的畜产品生产和出口贸易，如口蹄疫病毒，其引起的偶蹄动物烈性传染病，被世界动物卫生组织(OIE)列为A类传染病之首，在国家动物疫病防治长期发展规划中确定为首位限期免疫净化防控的病种。目前国内外主要使用全病毒灭活疫苗等传统疫苗对口蹄疫等病毒性传染病进行免疫防控，但防疫效果不尽人意。这类疫苗因生产成本较高、疫苗生产过程中或灭活不彻底可能造成散毒的生物安全问题，以及筛选匹配疫苗株周期长等缺点，已不能完全满足动物疫病防控目标中彻底净化的要求。因此，研发新型、安全、高效的基因工程疫苗制剂是目前的当务之急，也符合国家提出的有效防控重大动物疫病、保障畜牧业健康可持续发展的战略需求。

病毒样颗粒(Virus-like particles,VLPs)是近年来新出现的一种基因工程亚单位形式，其优点包括不含病毒复制所必须的遗传物质，生物安全性优越；可以模拟病毒的天然结构而使构象依赖型抗原表位得以正确呈现；能像自然病毒粒子一样与细胞表面受体结合进入细胞，从而诱导较强的免疫反应；在不影响VLPs结构的基础上可以根据需要插入或删除某些氨基酸序列，对其进行人工改造，从而实现对多种病毒同时免疫的多效性特点等。因此，VLPs作为疫苗，被认为是目前能够替代全病毒疫苗的最佳候选疫苗形式。

尽管VLPs研究从20世纪五六十年代开始相继出现报道，但大多VLPs的研究都集中在真核表达系统中，尤其是杆状病毒/昆虫表达系统，虽然已出现利用该系统获得的商品化人类VLPs疫苗，但由于该系统生产成本高、VLPs产率低等因素限制了动物病毒VLPs疫苗的产业化进程，至今还未出现商品化动物病毒VLPs疫苗。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种新型的O型口蹄疫病毒样颗粒及其制备方法。

为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：

原核表达系统生产VLPs，其优势是费用低廉，蛋白产率高，容易满足大规模生产。鉴于此，本发明则在前期建立的原核表达组装技术平台基础上，为了进一步提高O型口蹄疫病毒VLPs的蛋白表达效果及组装率，通过对口蹄疫病毒衣壳蛋白VP3基因的剪切优化，进一步提高了O型口蹄疫病毒衣壳蛋白的表达水平，并且经测定VP3的改变不影响VLPs的组装，且其组装效率高于未缺失VP3的自然VLPs的组装。并且优化后的病毒样颗粒，能够保持持久的刺激使动物机体产生特异性抗体以及中和抗体，与未缺失VP3组装得到的VLPs无显著差别。

具体的，本发明的一种O型口蹄疫病毒样颗粒是由O型口蹄疫病毒的结构蛋白VP0、VP1以及优化后的VP3结构蛋白组装而成，其中VP1的基因序列为SEQ ID NO.1所示，VP0的基因序列为SEQ ID NO.2所示，优化后的VP3的基因序列为SEQ ID NO.3所示。

进一步的，本发明还公开了一种构建O型口蹄疫病毒样颗粒的方法，包括以下步骤：

(1)小泛素样修饰蛋白融合表达载体pSMA以及pSMK的构建：

a.以酿酒酵母基因组DNA为模板，以smt3F与smt3R为引物扩增smt3基因，引物序列如下：

smt3F：5’GCCATGGGTCATCACCATCATCATCACGGGTCGGACTCAGAAGTCAATCAA3’，

smt3R：5’GGATCCGAGACCTTAAGGTCTCAACCTCCAATCTGTTCGCGGTG3’，

b.经NcoI和BamHI双酶切后将smt3基因插入到用同样内切酶处理的pET-28a载体中，所得载体为pSMK，将pSMK的卡那霉素抗性基因替换为氨苄青霉素抗性基因，得载体pSMA；

(2)口蹄疫结构蛋白基因重组表达载体的构建

根据GenBank中公布的登陆号为JN998085.1的O型口蹄疫病毒序列，进行密码子优化并合成结构蛋白基因VP0、VP1及VP3；以合成的基因为模板，用以下引物对分别扩增VP0，VP1以及VP3基因片段：

VP1F：5’GGTCTCTAGGTACCACCAGCACGGGCGAA 3’

VP1R：5’CGCGGATCCTCACAGACTTTGTTTGACCGG 3’

VP0F：5’GGTCTCTAGGTGGTGCGGGCCAGTCATCTCC 3’

VP0R：5’CGCGGATCCTCATTCTTTACTCGGAAATTC 3’

VP3F：5’GGTCTCTAGGTGGTATCTTCCCGGTGGCGTG 3’

VP3R：5’CGCGGATCCTCATTGCTGACGGGCATCAACC 3’

采用聚合酶链式反应的方法，分别用引物VP1F/VP1R、VP3F/VP3R和VP0F/VP0R，扩增获得VP1、VP0以及VP3基因片段，将扩增得到的VP3基因缺失574-615位的核苷酸序列，即获得优化后的VP3的基因序列，命名为optiVP3；扩增获得的VP1、VP0以及optiVP3基因片段分别经BsmBI/BamH I双酶切后插入经BsaI酶切处理的pSMK或pSMA，所构建重组表达载体分别命名为pSMK/VP0，pSMK/VP1以及pSMA/optiVP3，以pSMK/VP1为模板，以T7BamHI/VP1XhoI为引物扩增获得含T7启动子等原核表达元件和VP1基因的DNA片段，经BamHI/XhoI双酶切后插入用同样酶切处理的pSMK/VP0中，所得双表达重组载体命名为pSMK/VP0-VP1；所述T7BamHI/VP1XhoI引物序列为：

T7BamHI：5’GCAATTGGATCCCGTCCGGCGTAGAGGATCGA 3’

VP1XhoI：5’GCGCACCTCGAGTCACAGAGTCTGTTTCTCAGG 3’

(3)衣壳蛋白的表达及纯化

将表达载体pSMA/optiVP3与pSMK/VP0-VP1共转化到表达菌BL21(DE3)，用卡那霉素和氨苄青霉素筛选阳性克隆进行蛋白表达和纯化；

(4)口蹄疫病毒样颗粒体外组装

用小泛素样修饰蛋白酶酶切融合蛋白，通过His Trap HP除去小泛素样修饰标签蛋白，收集含有VP0、VP1以optiVP3的流穿液，在含有500mM NaCl，pH8.0的20mM Tris-HCl组装缓冲液中，4℃过夜组装成O型口蹄疫VLPs。

在本发明中，优选的，所述的VP1的基因序列为SEQ ID NO.1所示，VP0的基因序列为SEQ ID NO.2所示，优化后的VP3的基因序列为SEQ ID NO.3所示。

更进一步的，本发明还提出了所述的O型口蹄疫病毒样颗粒在制备口蹄疫疫苗中的用途。

相较于现有技术，本发明的有益效果在于：

本发明尝试将口蹄疫病毒VP3的部分区段进行人工缺失，以期提高目的蛋白的表达量及病毒样颗粒的组装效率，为进一步推进病毒样颗粒疫苗的研究和应用，加速动物疫苗由传统灭活苗向基因工程苗转化的步伐提供技术支持。结果显示，VP3基因经人工缺失后，VP3目的蛋白的表达量比突变前提高了20％，病毒样颗粒的组装效率提高了15％左右，且免疫学检测发现反应原性与未缺失VLPs无区别。本发明为优化口蹄疫VLPs的获得进行了一次新的尝试和创新。

附图说明

图1为融合蛋白诱导表达及纯化；

注：泳道1：Marker；泳道2：未突变诱导后的样品；泳道3：未突变诱导后的上清；泳道4-7：纯化的未突变样品；泳道8：突变的诱导后样品；泳道9-11：纯化的突变样品；

图2为体外组装的病毒样颗粒电镜检测结果；

图3为O型口蹄疫VLPs蔗糖密度梯度离心结果；

图4为第二组猪特异抗体水平检测结果；

图5为第二组猪中和抗体水平检测结果。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实施例1 O型口蹄疫病毒样颗粒的构建

(1)小泛素样修饰蛋白融合表达载体pSMA以及pSMK的构建：

a.以酿酒酵母基因组DNA为模板，以smt3F与smt3R为引物扩增smt3基因，引物序列如下：

smt3F：5’GCCATGGGTCATCACCATCATCATCACGGGTCGGACTCAGAAGTCAATCAA3’，

smt3R：5’GGATCCGAGACCTTAAGGTCTCAACCTCCAATCTGTTCGCGGTG3’，

(2)口蹄疫结构蛋白基因重组表达载体的构建

根据已公布的O型口蹄疫病毒的序列(GenBank登陆号：JN998085.1)，参考Hoover等的方法(Hoover DM1,Lubkowski J.DNAWorks:an automated method for designing oligonucleotides for PCR-based gene synthesis.Nucl.Acids Res.(2002)30(10):e43.)进行密码子优化并合成结构蛋白基因VP0，VP3和VP1。

以合成的基因为模板，用以下引物对分别扩增VP0，VP1以及VP3基因片段：

VP1F：5’GGTCTCTAGGTACCACCAGCACGGGCGAA 3’

VP1R：5’CGCGGATCCTCACAGACTTTGTTTGACCGG 3’

VP0F：5’GGTCTCTAGGTGGTGCGGGCCAGTCATCTCC 3’

VP0R：5’CGCGGATCCTCATTCTTTACTCGGAAATTC 3’

VP3F：5’GGTCTCTAGGTGGTATCTTCCCGGTGGCGTG 3’

VP3R：5’CGCGGATCCTCATTGCTGACGGGCATCAACC 3’

采用聚合酶链式反应(PCR)方法，分别用引物VP1F/VP1R、VP3F/VP3R和VP0F/VP0R扩增获得VP1、VP0以及VP3基因片段，所述的VP1的基因序列为SEQ ID NO.1所示，VP0的基因序列为SEQ ID NO.2所示，VP3的基因序列为SEQ ID NO.4所示，将扩增得到的VP3基因的第574-615位的核苷酸缺失，即获得优化后的VP3的基因序列，命名为optiVP3，其序列为SEQ ID NO.3所示；扩增获得的VP1、VP0以及optiVP3基因片段分别经BsmBI/BamH I双酶切后插入经BsaI酶切处理的pSMK或pSMA，所构建重组表达载体分别命名为pSMK/VP0，pSMK/VP1以及pSMA/optiVP3，以pSMK/VP1为模板，以T7BamHI/VP1XhoI为引物扩增获得含T7启动子等原核表达元件和VP1基因的DNA片段，经BamHI/XhoI双酶切后插入用同样酶切处理的pSMK/VP0中，所得双表达重组载体命名为pSMK/VP0-VP1；所述T7BamHI/VP1XhoI引物序列为：

T7BamHI：5’GCAATTGGATCCCGTCCGGCGTAGAGGATCGA 3’

VP1XhoI：5’GCGCACCTCGAGTCACAGAGTCTGTTTCTCAGG 3’

同时构建含有未优化的VP3的重组质粒，命名为pSMA/VP3，作为对照。

(3)衣壳蛋白的表达及纯化

将表达载体pSMK/VP0-VP1和pSMA/optiVP3(或者pSMA/VP3)共转化到表达菌BL21(DE3)。用卡那霉素和氨苄青霉素筛选阳性克隆。挑选阳性克隆菌于双抗性LB培养基中37℃220rpm过夜培养。将上述菌液以1:100接种LB培养基，于37℃、220rpm培养至菌液的OD₆₀₀达0.6左右，以终浓度为1mM IPTG、25℃过夜诱导表达，随后以5000rpm、30min离心收集菌体沉淀，-20℃储存备用。

用10-20ml冰浴的缓冲液A(20mM Tris-HCl，500mM NaCl，20mM Imidazol，pH＝8.4)重悬细菌沉淀，超声破碎菌体细胞(超声时间3s,间隔时间3s,共8min，功率200W)。12,000×g离心30min，取上清，弃沉淀，上清与Ni-NTA His·Bind Resins混匀，4℃结合1h左右。用缓冲液A洗去非特异性结合的杂蛋白，用缓冲液B(20mM Tris-HCl，500mM NaCl，300mM Imidazol，pH＝8.4)洗脱目的蛋白，-70℃保存。SDS-PAGE检测结果显示获得了预期大小的蛋白(如图1)。结果也显示，VP3缺失后，其表达量比未缺失的完整VP3的量显著增加，这说明VP3的缺失有利于口蹄疫病毒蛋白的表达。

(4)口蹄疫病毒样颗粒的体外组装

参照Invitrogn的试剂使用说明，用小泛素化修饰蛋白酶酶切融合蛋白，按照如下方法和比例进行：20μg上述纯化的融合蛋白，200μL酶切缓冲液(50mM Tris-HCl，150mM NaCl，pH8.0,0.2％Igepal(NP-40)，1mM DTT)，10μL小泛素化修饰蛋白酶(1U/μL)，37℃酶切30min。将酶切混合物通过HisTrap HP除去小泛素化修饰标签蛋白，收集含有VP0、VP1和optiVP3(或者VP3)的流穿液在组装缓冲液(20mM Tris-HCl，500mM NaCl，pH8.0)中，4℃过夜组装VLPs。

过夜组装的VLPs经截留分子量100KD的超滤管浓缩后，透射电镜观察：将10μL含VLPs的浓缩液加到200目的铜网上，室温吸附2-3min，用滤纸吸干铜网上剩余的液体后用3％的磷钨酸染色，用Hitachi,H-7100FA透射电镜观察，组装的VLPs电镜观察，如图2所示，在此条件下组装的病毒样颗粒直径主要分布在20-30nm之间，其形态完整，大小和自然的病毒粒子相似，说明VP3的缺失并不影响VLPs的组装。

(5)病毒样颗粒的分离及组装率的测定

病毒样颗粒的蔗糖密度梯度离心法的分离：将1.5ml含病毒样颗粒的液体(突变和未突变)置于45％-15％浓度的蔗糖梯度上，以38000rpm、4℃离心3.5h,然后用连续进样的方法在紫外检测仪(259nm)检测，并绘制图普，依据峰面积确定VLPs的组装情况。结果显示VP3部分缺失(opti VP3)组装得到的VLPs的峰面积明显大于对照组，如图3所示。收集含VLPs的样品峰，用双抗夹心ELISA方法进行定量，并最终确定组装率。VLPs的组装效率＝含VLPs样品峰的抗原量/上样的抗原总量×100％

结果显示VP3部分缺失(optiVP3)组装得到的VLPs的组装率为45％，VP3未缺失的VLPs组装率为30％。

实施例2 O型口蹄疫病毒样颗粒的免疫效力检测

将13只5周龄的猪分为3组，第一组(3只)用PBS免疫作为对照，第二组(5只)用实施例1制备得到的含有optiVP3的VLPs蛋白免疫，第三组(5只)用实施例1制备得到的含有未缺失VP3的VLPs蛋白免疫。免疫前对所有实验猪进行颈静脉采血，免疫后第一周开始每周采血，分离血清并检测抗体水平，具体操作为:在微量血凝板上将猪血清及阴阳性对照血清用PBST 2倍系列稀释后，加入口蹄疫O型病毒抗原(1:20稀释)，4℃静置过夜。将抗原抗体混合液转移至包被口蹄疫O型兔抗的ELISA板上，封板，37℃孵育60min。PBST清洗3次，孔板中加入口蹄疫O型豚鼠抗体工作液(50μL)，封板，37℃孵育30min。PBST清洗3遍后，再加入兔抗豚鼠IgG-HRP工作液(50μL)，封板，37℃孵育30min。PBST清洗3次后，50μL底物溶液(OPD，添加3％双氧水)加于各孔中于37℃孵育15min。然后用50μL终止液加于各孔终止颜色反应，于490nm检测光密度(OD值)(见图5)。

血清中和抗体的检测具体为，以微量中和试验检测血清中和抗体滴度。将生理盐水稀释的猪血清56℃灭活30分钟后，在96孔微量细胞培养板上，用DMEM营养液作2倍系列稀释，每个稀释度作4孔，每孔加入50μL病毒液(100TCID50)，37℃温箱中和1h后每孔加入100μL细胞悬液(1×10⁵个/mL)，置5％CO2培养箱37℃培养，自48h观察至144h终判。设置阳性和阴性血清对照、病毒回归试验、血清毒性对照、正常细胞对照。按照Spearman-Karber方法，计算出能保护50％细胞孔不产生细胞病变的血清稀释度，该稀释度即为该份血清的中和抗体效价。

图4为第二组猪特异性抗体水平检测结果，图4结果显示，与PBS对照组相比，VLPs免疫组的猪血清抗体水平持续升高，在第3周达到了最高峰，并一直持续到第5周。攻毒后28天，抗体急剧升高。这说明VLPs能够保持持久的刺激使动物机体产生更多的抗体。与第三组相比，特异性抗体水平无显著差别(结果未示出)。

图5为第二组猪中和抗体水平检测结果，图5结果显示，与PBS组相比，口蹄疫病毒VLPs免疫后猪中和抗体水平持续升高，并在第2周达到最高峰。两周后，抗体水平下降，但仍有较高的抗体滴度，说明VLPs免疫组能够引起机体产生特异中和抗体，与第三组相比，中和抗体水平无显著差别(结果未示出)，进一步证明了口蹄疫病毒VLPs作为疫苗的免疫潜力。

序列表

<110> 中国农业科学院兰州兽医研究所

<120> 一种O型口蹄疫病毒样颗粒及其制备方法和用途

<130> KLPI161046

<160> 4

<170> PatentIn 3.5

<210> 1

<211> 639

<212> DNA

<213> VP1

<400> 1

accaccagca cgggcgaatc ggcagatccg gttacggcaa cggtcgaaaa ctacggcggc 60

gaaacgcagg ttcaacgtcg tcatcatacc gatgttagct ttattctgga ccgtttcgtg 120

aaagttacgc cgaaggattc tatcaacgtc ctggacctga tgcagacccc gccgcatacc 180

ctggtgggcg cactgctgcg caccgccacg tattactttg cagatctgga agtcgctgtg 240

aaacacgaag gcgacctgac ctgggtcccg aatggtgcac cggaagcagc actggataac 300

accacgaatc cgacggcata tcataaagct ccgctgaccc gtctggcact gccgtacacg 360

gccccgcacc gtgttctggc aaccgtctat aacggcaatt gcaaatacgc tggcggtagt 420

ctgccgaacg tgcgtggtga tctgcaggtt ctggcccaaa aggcagcttg gccgctgccg 480

accagcttca attatggtgc gattaaagcc acccgtgtga cggaactgct gtatcgtatg 540

aagcgtgcag aaacctactg tccgcgtccg ctgctggcag tccacccgtc cgcagcacgc 600

cataagcaaa aaatcgtcgc cccggtcaaa caaagtctg 639

<210> 2

<211> 909

<212> DNA

<213> VP0

<400> 2

ggtgcgggcc agtcatctcc ggcgacgggt tcccagaatc aatcaggcaa cacgggttcc 60

atcatcaaca actactacat gcaacagtat cagaacagtg tggataccca actgggcgac 120

aacgcggttt caggcggttc gaatgaaggt agtaccgaca ccacgtccac gcataccacg 180

aatacccaga acaatgattg gtttagcaaa ctggcaagct ctgctttttc tggcctgttc 240

ggtgcgctgc tggccgacaa aaagaccgaa gaaaccacgc tgctggaaga tcgtattctg 300

accacgcgca acggccatac cacgagtacc acgcagagtt ccgtcggcat cacgcacggt 360

tacgcgaccg ccgaagattt cgtgtcaggc ccgaatacgt cgggtctgga aacccgtgtg 420

gttcaagccg aacgcttttt caaaacgcac ctgtttgatt gggtgacctc cgacccgttc 480

ggtcgttgct atctgctgga actgccgacg gatcacaagg gcgtttacgg tagcctgacc 540

gactcttatg cgtacatgcg caacggctgg gatgtggaag ttaccgccgt gggtaaccag 600

tttaatggcg gttgcctgct ggttgcaatg gtcctggaac tgtgttctat tgaacgtcgc 660

gaactgttcc agctgaccct gtttccgcat caattcatta acccgcgtac caatatgacg 720

gctcacatca aagttccgtt tgtcggcgtg aaccgctatg atcagtacaa agtccacaag 780

ccgtggaccc tggtcgtgat ggttgtcgca ccgctgaccg ttaatacgga aagcgctccg 840

caaatcaagg tgtatgccaa tatcgccccg acgaatgtcc acgttgctgg tgaatttccg 900

agtaaagaa 909

<210> 3

<211> 618

<212> DNA

<213> optiVP3

<400> 3

ggtatcttcc cggtggcgtg tagcgatggt tacggtggcc tggtgacgac ggacccgaaa 60

acggcagacc cggtgtatgg caaagttttt aacccgccgc gtaatctgct gccgggtcgc 120

ttcaccaacc tgctggatgt tgccgaagca tgcccgacgt ttctgcattt cgatggcgac 180

gtgccgtatg ttaccacgaa aaccgattcg gaccgtgtcc tggcccagtt tgacctgtcc 240

ctggcggcca agcatatgtc aaacaccttc ctggctggcc tggcgcagta ttacacccaa 300

tacagcggta cggtgaatct gcactttatg ttcaccggcc cgacggatgc taaagcgcgc 360

tatatgattg cctacgcacc gccgggtatg gaaccgccaa agaccccgga agcagctgcg 420

cattgcattc acgcggaatg ggacaccggc ctgaacagca aatttacgtt ctctatcccg 480

tatctgagtg ccgcagatta tgcctacacc gcaagtgacg ctgcggaaac cacgaatgtc 540

cagggttggg tgtgtctgtt tcaaatcacg cacggcaagg attttgaact gcgtctgccg 600

gttgatgccc gtcagcaa 618

<210> 4

<211> 660

<212> DNA

<213> VP3

<400> 4