一种高纯度环孢菌素衍生物STG-175的制备方法与流程

本发明涉及一种新型抗丙肝病毒药物的制备方法，具体涉及一种高纯度环孢菌素衍生物STG-175的制备方法。

背景技术：

丙型病毒性肝炎，简称为丙型肝炎、丙肝，是一种由丙型肝炎病毒（Hepatitis C virus,HCV）感染引起的病毒性肝炎，据世界卫生组织统计，目前全球HCV的感染率约为3%，估计约1.8亿人感染了HCV，每年新发丙型肝炎病例约为3.5万例。丙型肝炎呈全球性流行，可导致肝脏慢性炎症坏死和纤维化，部分患者可发展为肝硬化甚至细胞癌（HCC）。有数据显示，未来20年内由HCV感染导致的死亡率将持续增长，HCV感染已成为严重的社会公共卫生问题。

目前，HCV感染的治疗方法主要有两种，一种是连续6到12个月静脉注射α-干扰素（IFN-α），另一种是利用IFN-α和通用型抗病毒核苷模拟物（如利巴韦林）进行共同治疗。上述两种方法的治疗功效低，且所用干扰素的副作用较大，因此，需要研发用于治疗HCV感染的有效抗病毒剂，环孢菌素衍生物STG-175即是一种对HCV细胞具有很好的清除效果的新型抗丙肝病毒在研药物。

环孢菌素衍生物STG-175，即[(S)-(4-羟基丁基硫基)-甲基-肌氨酸]-3-[γ-羟基-N-甲基亮氨酸]-4-环孢菌素，其结构式为：

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WO2014/145686中公开了STG-175的制备方法，其先以4-羟基环孢菌素为原料制得3-亚甲基-4羟基环孢菌素，再将3-亚甲基-4羟基环孢菌素与4-巯基-1-丁醇或巯基丁酸甲酯通过1,4加成反应制备STG-175。

当采用4-巯基-1-丁醇与3-亚甲基-4-羟基环孢菌素反应时，所得的产品中含有STG-175异构体（简称206），该异构体与STG-175的物化性质极其相似，TLC Rf值非常接近，经过两次展开的Rf值分别是0.25和0.2，HPLC分析STG-175及其异构体，保留时间分别是24.72min和20.71min。因此，两者的分离难度非常之大，即使经过多次硅胶柱分离仍然得不到高纯度的STG-175产品，且操作繁杂，收率较低，不适合大量样品的制备。反应过程如下所示：

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当采用巯基丁酸甲酯与3-亚甲基-4羟基环孢菌素反应时，同样也会得到物化性质非常接近的两个异构体，而且还需要将酯基还原成醇才能得到STG-175产品，还原收率较低，也不适合大量样品的制备。反应过程如下：

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综上所述，现有制备STG-175的方法均存在收率低、纯度低、操作繁琐的问题，如何提高产品纯度，提高药效，减少杂质的副作用，是保障患者健康的重中之重，也是SFDA和美国FDA对新药质量的基本要求。

技术实现要素：

本发明的目的就是提供一种高纯度环孢菌素衍生物STG-175的制备方法，以解决现有制备方法收率低、纯度低、操作繁琐的问题。

本发明的目的是这样实现的，一种高纯度环孢菌素衍生物STG-175的制备方法，包括以下步骤：将含有STG-175及其异构体的反应混合液减压浓缩去溶剂，得反应混合物；向反应混合物中加入羟基保护剂对3位侧链上的羟基进行保护，得STG-175及其异构体的衍生物反应液，将所得衍生物反应液浓缩后通过硅胶柱层析分离，得到STG-175衍生物；将所得STG-175衍生物在水解剂中脱保护，再经浓缩、提取、洗涤、结晶，即得到STG-175成品。

进一步地，本发明的具体步骤为：

a. 3-亚甲基-4-羟基环孢菌素与4-巯基-1-丁醇反应得到STG-175及其异构体的反应混合液，将反应混合液减压浓缩去溶剂，得反应混合物；

b. 将所得反应混合物溶于有机溶剂中，于-5~50℃下滴加羟基保护剂进行保护反应，待反应完毕，得到STG-175及其异构体的衍生物反应液；

c. 将所得衍生物反应液浓缩，得粘稠物，将该粘稠物用C18硅胶层析分离，并将洗脱液减压浓缩，得STG-175衍生物；

d. 将所得STG-175衍生物溶解于有机溶剂中，于-5~50℃下滴加水解剂进行脱保护反应，待反应完毕，得水解反应液；

e. 将所得水解反应液减压浓缩，蒸去溶剂后，加入提取剂，搅拌，静置，分去水相，再依次用饱和盐水、纯水洗涤，将有机相减压浓缩至干，即得到STG-175成品。

所述步骤b中的羟基保护剂是一氯乙酸酐、二氯乙酸酐、三氯乙酸酐或二苯基磷酰氯中的任意一种或几种。

所述步骤b中所用有机溶剂为烷烃类溶剂，具体为二氯甲烷、三氯甲烷或1,2-二氯乙烷中的任意一种或几种；保护反应的温度为0~5℃；反应过程中产生的盐酸采用有机碱中和，所述有机碱为吡啶、三乙醇胺或二异丙胺中的任意一种或几种。

所述步骤b中有机溶剂和羟基保护剂的用量以步骤a中3-亚甲基-4-羟基环孢菌素的用量来确定，其中3-亚甲基-4-羟基环孢菌素与羟基保护剂的摩尔比为1∶1.5~6，优选1∶2.5，3-亚甲基-4-羟基环孢菌素与溶剂的质量体积比为1g∶5~20mL，优选1g∶10 mL。

所述步骤d中所用有机溶剂为醇类溶剂，具体为甲醇、异丙醇、乙醇或甲醇/二氯甲烷混合溶剂中的任意一种或几种；脱保护反应的温度为5~10℃。

所述步骤d中有机溶剂和水解剂的用量以步骤a中3-亚甲基-4-羟基环孢菌素的用量来确定，其中，3-亚甲基-4-羟基环孢菌素与水解剂的摩尔比为1∶3~8，优选为1∶3.5，3-亚甲基-4-羟基环孢菌素与有机溶剂的质量体积比为1g∶5~20mL，优选1g∶10~12.5mL，更优选为1g∶12.5mL。

所述步骤d中的水解剂是氨水(3N ~ 5N)或氢氧化钠（5N~8N）水溶液。所述步骤e中的提取剂为乙酸乙酯、叔丁基甲基醚或二氯甲烷中的任意一种或几种。

与现有技术相比，本发明的制备方法可大大减少C18硅胶层析分离精制次数，只需一次分离，就能将STG-175与其异构体分离开，所制得的STG-175产品的纯度可达到99.51%，且产品收率高（可达53%左右，远高于现有技术的21%），损失少，本发明方法可大量制备高纯度STG-175产品，是现有制备方法无法企及的。

另外，由于本发明方法所制得的产品的纯度高，产品的药效也相应提高，杂质含量减少，杂质带来的副作用也相应减小，从而为患者的健康提供了更加安全可靠的保障。

附图说明

图1是4-羟基-环孢菌素的HPLC图谱。

图2是合成的3-亚甲基-4-羟基环孢菌素的HPLC图谱。

图3是STG-175及其异构体的反应混合液的HPLC图谱。

图4是羟基保护反应得到的衍生物反应液的HPLC图谱。

图5是分离出的STG-175氯乙酸酯的衍生物的质谱图。

图6是所得STG-175成品的HPLC图谱。

图7是对比例1所制备的STG-175产品的HPLC图谱。

具体实施方式

下面结合具体实施例进一步阐述本发明，在以下各实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法，所用试剂为市售分析纯或化学纯。

以下各实施例中，无特别说明的STG-175及其异构体的反应混合物均按以下方法制备：

氮气保护下，将四氢呋喃 150ml及二异丙胺15.39m加入到500ml 四口反应瓶中，降温至-78℃后，开始滴加正丁基锂（2.2M，49.3mL）的四氢呋喃溶液150mL，滴加完毕，搅拌1h。此温度下，滴加预先配制好的含12.31g4-羟基-环孢菌素（HPLC纯度：97.04，见图1）的四氢呋喃溶液30mL，滴加完毕继续搅拌2h后，往该反应液中通二氧化碳气体，通气时间为2h，接着保温1h后，自然升至室温。将该反应液冷却至0~5℃，滴加氯甲酸氯甲酯13.98g，然后自然升温至室温过夜。加30mL水终止反应后，减压浓缩出四氢呋喃，加乙酸乙酯100mL，水80mL，搅拌30min提取，乙酸乙酯提取液浓缩后，用硅胶柱层析分离得3-亚甲基-4-羟基环孢菌素，得量5.52g，HPLC纯度：97.12%（见图2）（HPLC分析条件：柱：Agilent poroshell 120 SB-C18 2.7µm 4.6mm×150mm；柱温：80℃；流动相：乙腈/水/叔丁基甲醚=350/570/80；流速：1.0ml/分；检测波长：254nm）。

将3-亚甲基-4-羟环孢素（2.13g，0.0017mol）、甲醇25mL、4-巯基1-丁醇（1.56g，0.0147 mol）、氢氧化锂（0.94g，0.039 mol）一并投入到500mL反应瓶中，按照WO2014/145686A2实例89方法2操作，液相检测反应完毕后（见图3，HPLC分析条件：C18柱，乙腈/水/醋酸 PH=4，210nm，柱温64℃，异构体和STG-175出峰时间分别为20.71min和24.72min），在30~35℃下，减压浓缩出甲醇，得反应浓缩物物2.43g。

反应式为：

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实施例1

羟基保护反应：向STG-175及其异构体的反应混合物中加入二氯甲烷 20mL搅拌溶解后，加入吡啶0.34g（0.00425mol），降温至0~5℃，开始滴加氯乙酸酐0.73g(0.00425 mol)，滴加完毕，此温度下保温30min，HPLC检测反应完毕（见图4，异构体和STG-175两个衍生物出峰时间分别为48.28min和69.81min），得衍生物反应液。

分离：将上述衍生物反应液浓缩至干，得粘稠状残留物，该残留物用C18硅胶层析分离得含高纯度的STG-175的洗脱液，洗脱液减压浓缩，得高纯度STG-175氯乙酸酯的衍生物1.39g，对其进行质谱分析，质谱图如图5所示。

脱保护反应：将上述得到的STG-175衍生物溶解在15mL甲醇中，降温至10~15℃，滴加NH3.H2O（3N，1.1mL），滴加完毕保温10min，反应完毕，得水解反应液。

后处理：水解液减压浓缩，蒸出甲醇后，加入15mL乙酸乙酯，搅拌30min，静置20min分去水相，再分别用饱和盐水10mL、纯水10mL洗涤，取有机相，有机相减压浓缩至干，得高纯度STG-175产品1.21g，收率52.38%，纯度99.51%，HPLC图谱见图6。

反应式为：

实施例2

将羟基保护反应中的0.34g吡啶改为0.43g三乙胺，其他条件及操作均同实施例1，得高纯度STG-175产品1.18g，摩尔收率为51.1%（以3-亚甲基-4-羟环孢素计），纯度为99.5%。以下收率均以3-亚甲基-4-羟环孢素为原料计的摩尔收率。

实施例3

将羟基保护反应中的0.34g吡啶改为0.43g二异丙胺，其他条件及操作均同实施例1，得高纯度STG-175产品1.16g，收率为50.22%，纯度为99.5%。

实施例4

将脱保护反应中的NH3.H2O（3N，1.1mL）改为NaOH（7N，0.47mL），其他条件及操作均同实施例1，得高纯度STG-175产品1.05g，收率为45.45%，纯度为99.5%。

实施例5

将后处理过程中的20mL乙酸乙酯改为15mL甲基叔丁基醚，其他条件及操作均同实施例1，得高纯度STG-175产品1.22g，收率为52.81%，纯度为99.5%。

实施例6

将羟基保护反应中的氯乙酸酐0.73g改为1.02g二氯乙酸酐，其他条件及操作均同实施例1，得高纯度STG-175产品1.09g，收率为40.37%，纯度为99.51%。

实施例7

将羟基保护反应中的氯乙酸酐0.73g改为1.31g三氯乙酸酐，其他条件及操作均同实施例1，得高纯度STG-175产品1.12g，收率为41.17%，纯度为99.5%。

实施例8

将羟基保护反应中的0.73g氯乙酸酐改为1g二苯基磷酰氯，其他条件及操作均同实施例1，得高纯度STG-175产品1.14g，收率为41.91%，纯度为99.66%。

实施例9

制备STG-175粗品反应：氮气保护下，将3-亚甲基-4-羟环孢素12.31g（摩尔数0.01mol）,甲醇125ml，4-巯基-1-丁醇1.69g（0.015mol）,氢氧化锂0.72g（0.03mol）一并投入到500ml的反应瓶中，在20~25℃间反应24小时，液相检测反应完毕后，加入柠檬酸1.92g（0.01mol）,中和后，加压蒸出甲醇，得浓缩物，浓缩物加乙酸乙酯120ml溶解后，用去离子水100ml×2洗涤两次，有机相用无水硫酸镁干燥1小时，过滤出干燥剂，有机相减压浓缩至干得浓缩物14.23g。

保护反应：氮气保护下，将上述浓缩物用145ml二氯甲烷溶解，加入吡啶2.0g（0.025mol）后，降温至0~5℃，滴加氯代乙酸酐4.27g（0.025mol），滴加完毕保温30分钟，HPLC检测完毕后，将反应液浓缩至干。

层析柱分离：该残留物用C18硅胶层析纯化分离得含高纯度的STG-175氯代乙酸酯的洗脱液，洗脱液减压浓缩至干，得高纯度STG-175氯乙酸酯的衍生物的浓缩物7.91g。

脱保护反应：将上述得到的高纯度衍生物7.91g(0.056mol)用甲醇80ml溶解后，降温至10~15℃间，滴加3N-氨水（6.5ml）滴加完毕保持10分钟，水解完毕。将反应液的甲醇蒸出后，加二氯甲烷溶解，用去离子水洗涤3次，有机相用无水硫酸钠干燥6小时后，除干燥剂过滤，滤液浓缩至干得高纯度STG-175产品6.95g，收率52.1%，纯度99.5%

对比例1

将实施例1所用的STG-175及其异构体的反应混合物直接进行C18硅胶柱层析分离，经过5次C18硅胶柱层析分离后，最终得到STG-175产品0.49g，收率为21.46%，纯度为96.18%，HPLC图谱见图7。

对比例2

按照WO2014/145686实施例88和实施例89的方法1制备STG-175产品，具体步骤为：将溶于3-亚甲基-4-羟环孢素1.28g和4-巯基-1-丁酸甲酯0.84g的甲醇25mL溶液中，加入氢氧化锂0.15g,室温反应过夜后得S-3-巯基1-丁酸甲酯-4-羟基环孢菌素和其异构体R--3-巯基1-丁酸甲酯-4-羟基环孢菌素两种化合物反应液。反应液溶剂浓缩后，分别加入乙酸乙酯和食盐水各30mL,提取收集有机相，有机相用饱和盐水洗涤，无水硫酸镁干燥，过滤掉干燥剂后溶剂浓缩的含有两种异构体的浓缩液，浓缩液经液相制备得S-3-巯基1-丁酸甲酯-4-羟基环孢菌素300mg。收率：21.12%。将氯化铯200mg和硼氢化钠300mg加入到溶于S-3-巯基1-丁酸甲酯-4-羟基环孢菌素200mg的四氢呋喃15mL的溶解液中，然后30min内，将甲醇30mL滴加至该反应液中，并在室温下保温30min，反应完毕，减压浓缩。然后分别加入乙酸乙酯30mL溶解残留物，接着加水30mL洗涤，取有机相，用30mL食盐水洗涤，无水硫酸镁干燥，除去干燥剂，减压浓缩掉乙酸乙酯得浓缩物。浓缩物用硅胶柱层析分离（二氯甲烷/甲醇=100/0至96/4）(C8柱，乙腈/水（0.05%三氟醋酸），检测波长210nm,柱温：64℃)得STG-175产品13mg，产率为6.6%，纯度为98.89%。