一种通过电场控制细菌纤维素结构的方法与流程

本发明涉及一种控制细菌纤维素结构的方法，具体涉及一种通过电场控制细菌纤维素结构的方法。

背景技术：

细菌纤维素(Bacterial cellulose，简称BC)主要是由木醋杆菌(Gluconacetobacter xylinus，简称G.xylinus)发酵合成的多孔网状纳米级生物高分子聚合物。BC的合成包括：单个葡萄糖分子通过聚合作用形成β-1-4-葡聚糖链，胞外线性聚合物链的“挤出”以及多条链装配成带状的原纤维。因此BC展现出良好的三维网状结构，具有极强的持水和透气性，此外高结晶度和聚合度使其具有高弹性模量和抗张强度，其次优良的生物相容性和可降解性，使其在生物医学领域具有很好的应用前景。

然而，通常对BC微纤丝的控制是在宏观的后处理中进行，如果可以在微纳米尺度下控制BC的形状和尺寸来充分促进移植细胞的生长和功能，将会进一步扩展其医学生物支架上的应用前景。研究人员为了克服这些局限性做出了许多努力，其中直流电场(Direct current，简称DC)刺激G.xylinus是一种制作定制化BC网状结构的方法，且可反过来调节BC的机械性能。

在前人的研究中，DC通常被用来控制G.xylinus的移动，继而影响BC产量。文章Yan L,Jia S R,Zheng X T,et al.The Effect of Growth,Migration and Bacterial Cellulose Synthesis of Gluconacetobacter xylinus in Presence of Direct Current Electric Field Condition[J].Advanced Materials Research,2012,550-553:1108-1113，公开了3d内DC对G.xylinus生产BC的影响，发现随着电场强度的增强，细胞移向负极的速度会增大，且在1V/cm下合成的BC纤维束直径更大并有同向性趋势，而当电场强度超过0.5V/cm(10mA)，G.xylinus生长就会受到抑制。

文章Zheng X,Zhong C,Liu M,et al.The Cells of Gluconacetobacter xylinus Response to Exposure[J].Lecture Notesin Electrical Engineering,2014,251:1749-1757，进一步公开了阴阳极处菌体形态以及培养3d后的BC产量，其发现阴阳极下菌体形态较相似，且在1V/cm电场下，G.xylinus由表面光滑长杆状变为粗糙短杆状，同时细胞表面出现一些小孔。此外，BC产量只在0.25V/cm下稍微提高，而超过0.5V/cm后迅速下降。

但是之前的研究并没有考虑在不同通电位置下的水电解作用和短时通电对细胞生长和脱氢酶活性的最佳促进效果。文章Liu M,Zhong C,Zhang Y M,et al.Metabolic Investigation in Gluconacetobacter xylinus and Its Bacterial Cellulose Production under a Direct Current Electric Field[J].Frontiers in Microbiology,2016,7，公开了在24h内，10mA直流电场对G.xylinus的刺激作用，其发现BC产量在12h内得到促进，在后12h受到抑制；在阴极，氢气的产生有利于细胞生长环境，在最初12h，提高了细胞的糖酵解和三羧酸循环代谢，但随着氧气的不足，从丙酮酸累积的乳酸减弱了BC的生产；在阳极，前6h，三羧酸循环和糖酵解受到抑制，18-24h，由于发酵液pH值降低使得细胞密度有所下降。同时，细胞累积的如葡萄糖酸、乳酸等代谢产物，向阳极细胞施加了强的酸压力，最终抑制细胞生长。

然而，在不同电场强度下，G.xylinus代谢与BC物理结构间的关系仍未清楚。因此，本发明利用不同强度直流电场，静态培养G.xylinus 24h，且在10mA电流强度下发酵得到的BC膜，其结晶度由0mA的76％分别下降到阴、阳极的49％、59％，这使得BC吸水能力由22.7倍分别提高到阴、阳极的34.8倍、30.2倍，有利于BC基生物支架上细胞生长所需的高持水环境；BC平均孔直径由669nm分别提高到阴、阳极的1654nm和1520nm，孔隙率由97％分别下降到90％和93％，孔直径的增大有利于移植细胞在孔洞中的游移，而孔隙率的下降可增加BC基生物支架材料的抗挤压性能和断裂强力，这将有效抵抗支架磨损并支持生理压力，同时较高的孔隙率也有利于组织沿着支架长入孔洞，并最终完全填充缺陷。这些将有利于支架上细胞的吸附、增殖和分化，并最终成为所需要的组织或器官。

因此，该方法为细菌纤维素在高附加值生物支架领域的进一步应用提供了新的研究角度。

技术实现要素：

针对上述问题，本发明提供了一种通过电场控制细菌纤维素结构的方法，正如上所述，其为细菌纤维素在高附加值生物支架领域的进一步应用提供了新的研究角度。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案为：

一种通过电场控制细菌纤维素结构的方法，包括以下步骤：

(1)在插有两个铂电极的培养容器中添加600～700mL的G.xylinus发酵培养基；

(2)将一定菌浓度的接种液以5～15％的体积比接种到步骤(1)中的培养容器中，并预培养20～30h使其达到对数期；

(3)通过恒流稳压电源在培养容器中施加恒定电流强度的直流电场；

(4)25～35℃下静态培养20～30h，得到了在微纳米尺度下结构可控的细菌纤维素。

作为上述技术方案的改进，步骤(1)中所述的铂电极直径为0.5mm。

作为上述技术方案的改进，步骤(1)中所述的培养容器为Wide cell GT电解槽。

作为上述技术方案的改进，步骤(1)中所述的G.xylinus发酵培养基的主要成分为葡萄糖15～25g/L、酵母粉4～6g/L、蛋白陈4～6g/L、Na₂HPO₄ 4～6g/L、柠檬酸铵0.5～1.5g/L及盐酸，其中盐酸调节初始pH至5～7。

作为上述技术方案的改进，步骤(2)中所述的一定菌浓度指培养基OD₆₀₀值为0.4～0.6。

作为上述技术方案的改进，步骤(2)中所述的对数期是指培养基OD₆₀₀值为0.15～0.35。

作为上述技术方案的改进，步骤(3)中所述的恒流稳压电源为BIO-RAD PowerPac^TMBasic。

作为上述技术方案的改进，步骤(3)中所述的恒定电流强度是指5～20mA的电流强度。

本发明带来的有益效果有：

实验表明，不同电场强度对G.xylinus运动速度、水电解速率、G.xylinus细胞膜的影响作用不同，其中10mA对阴极处菌体生长的促进作用最强。

10mA通电下产生的BC，其结晶度由0mA的76％分别下降到阴、阳极的49％、59％，这使得BC吸水能力由22.7倍分别提高到阴、阳极的34.8倍、30.2倍，有利于BC基生物支架上细胞生长所需的高持水环境；BC平均孔直径由669nm分别提高到阴、阳极的1654nm和1520nm，孔隙率由97％分别下降到90％和93％，孔直径的增大有利于移植细胞在孔洞中的游移，而孔隙率的下降可增加BC基生物支架材料的抗挤压性能和断裂强力，这将有效抵抗支架磨损并支持生理压力，同时较高的孔隙率也有利于组织沿着支架长入孔洞，并最终完全填充缺陷。这些将有利于支架上细胞的吸附、增殖和分化，并最终成为所需要的组织或器官。

因此，该方法为细菌纤维素在高附加值生物支架领域的进一步应用提供了新的研究角度。

附图说明

下面结合附图及具体实施例对本发明作进一步说明，

附图1为不同电流强度下，培养基中阴极菌体细胞浓度的变化；

附图2为不同电流强度下，培养基中阳极菌体细胞浓度的变化；

附图3为0mA下得到的三维网状结构的BC形态；

附图4为10mA电场强度下阴阳极中部的BC形态；

附图5为不同电场强度下的BC结晶度变化；

附图6为0mA与10mA电场强度下的BC吸水率变化；

附图7为0mA与10mA电场强度下的BC孔隙率变化。

具体实施方式

实施例1

一种通过电场控制细菌纤维素结构的方法，包括以下步骤：

(1)在插有两个直径为0.5mm铂电极的Wide cell GT电解槽中添加600mL的G.xylinus发酵培养基，该发酵培养基的主要成分为葡萄糖15g/L、酵母粉4g/L、蛋白陈4g/L、Na₂HPO₄ 4g/L、柠檬酸铵0.5g/L及盐酸，其中盐酸调节初始pH至5；

(2)将OD₆₀₀值为0.4的接种液以5％的体积比接种到步骤(1)中的培养容器中，并预培养20h使其OD₆₀₀值达到0.15；

(3)通过BIO-RAD PowerPac^TM Basic恒流稳压电源在培养容器中施加5mA电流强度的直流电场；

(4)25℃下静态培养20h，得到在微纳米尺度下结构可控的BC。

实施例2

一种通过电场控制细菌纤维素结构的方法，包括以下步骤：

(1)在插有两个直径为0.5mm铂电极的Wide cell GT电解槽中添加700mL的G.xylinus发酵培养基，该发酵培养基的主要成分为葡萄糖25g/L、酵母粉6g/L、蛋白陈6g/L、Na₂HPO₄ 6g/L、柠檬酸铵1.5g/L及盐酸，其中盐酸调节初始pH至7；

(2)将OD₆₀₀值为0.6的接种液以15％的体积比接种到步骤(1)中的培养容器中，并预培养30h使其OD₆₀₀值达到0.35；

(3)通过BIO-RAD PowerPac^TM Basic恒流稳压电源在培养容器中施加20mA电流强度的直流电场；

(4)35℃下静态培养30h，得到在微纳米尺度下结构可控的BC。

实施例3

一种通过电场控制细菌纤维素结构的方法，包括以下步骤：

(1)在插有两个直径为0.5mm铂电极的Wide cell GT电解槽中添加650mL的G.xylinus发酵培养基，该发酵培养基的主要成分为葡萄糖20g/L、酵母粉5g/L、蛋白陈5g/L、Na₂HPO₄5g/L、柠檬酸铵1g/L及盐酸，其中盐酸调节初始pH至6；

(2)将OD₆₀₀值为0.5的接种液以9％的体积比接种到步骤(1)中的培养容器中，并预培养24h使其OD₆₀₀值达到0.25；

(3)通过BIO-RAD PowerPac^TM Basic恒流稳压电源在培养容器中施加10mA电流强度的直流电场；

(4)30℃下静态培养24h，得到在微纳米尺度下结构可控的细菌纤维素。

实施例4

通过实验，验证不同电场强度对G.xylinus运动速度、水电解速率、G.xylinus细胞膜的影响。

图1为不同电流强度下，培养基中阴极菌体细胞浓度的变化。

图2为不同电流强度下，培养基中阳极菌体细胞浓度的变化。

图3为0mA下得到的三维网状结构的BC形态。

图4为10mA电场强度下阴阳极中部的BC形态，可见纤维丝束呈现定向排列。

图5为不同电场强度下的BC结晶度变化。结合表1，可见10mA电场强度下的BC结晶度小于0mA下的BC，由0mA的76％分别下降到10mA阴、阳极的49％、59％。

表1

图6为0mA与10mA电场强度下的BC吸水率变化。可见10mA电场强度下的BC吸水率由0mA的22.7倍分别提高到阴阳极下BC的34.8倍、30.2倍。

图7为0mA与10mA电场强度下的BC孔隙率变化。结合表2，可见10mA电场强度下的BC孔隙率由0mA的97.3％分别提高到10mA通电阳极的92.8％和阴极的90.0％，平均孔直径由669.1nm分别提高到通电阳极的1520.2nm和阴极的1654.0nm。

表2

虽然上述介绍了本发明的四种不同的实施例，对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节。

同时应当理解，虽然本说明书按照实施例加以描述，并非每个实施例仅包含一个独立的技术方案，本说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。

以上对本发明的具体实施例进行了详细说明，但内容仅为本发明的较佳实施例，不能被认为用于限定本发明的实施范围。凡依本发明申请范围所作的均等变化与改进等，均应仍归属于本发明的专利涵盖范围之内。