本发明属于生物发酵领域，具体涉及一种同时生产木耳多糖和黑色素的方法。
背景技术：
黑木耳（auriculariaauricula）又名细木耳、川耳、云耳，别名黑菜、木蛾、树鸡、木菌、耳子、光木耳、榆耳、桑耳等，因其侧生于树木上，形似人耳而得名。是我国传统的药食两用真菌，营养丰富，具有益气强身、补气血、润肺、止血、止痛、通便等功效，是我国一种重要的中药资源。
研究表明木耳菌中的主要活性成分为黑色素、木耳多糖、氨基酸、微量元素等。黑色素具有抗氧化、清除自由基、刺激免疫、诱导肿瘤坏死因子tnf-a和白介素il-6的合成、保护肝脏、防紫外线辐射等生物活性。木耳多糖具有提高免疫、降血脂、抗血栓、抗衰老、降血糖、抗凝血、抗氧化、抗辐射以及止血等活性。
近几年，以木耳菌为出发菌，发酵法生产木耳菌丝体、多糖和黑色素已有研究报导，现有技术如授权公告号为cn102766658b的中国发明专利，公开了一种发酵法制备黑木耳黑色素的生产工艺，其特征是以麦麸汁为主要成分，添加干酪素、硫酸铜、磷酸二氢钾等组成发酵培养基，接种黑木耳(auriculariaauricula)菌丝体，经液体深层发酵，分离纯化和冷冻干燥制得纯度高、食用安全的黑木耳黑色素。本发明制备黑木耳黑色素具有生产周期短、成本低、产量高和便于后续加工等特点，黑木耳黑色素产品呈粉末状，纯度达70~85％，产量为900~1100mg/l。现有技术如授权公告号为cn103641924b的中国发明专利，公开了一种从木耳中提取木耳多糖的方法，其是选取干木耳为原料，经浸泡、清洗、捣碎后加入纤维素酶，控制酶解条件酶解破除细胞壁；酶解后的木耳渣采取热水浸提；木耳酶解液与木耳浸提液合并后经过滤，再加入鞣酸溶液去除过滤液中的蛋白，离心收集的多糖溶液采用乙醇溶液醇沉；最后经真空干燥而成多糖产品。本发明的提取方法工艺合理，操作简单，成分保留全面，多糖得率及纯熟高，产品安全性好。
现有的研究都只涉及发酵法单独生产木耳多糖或黑色素，由于木耳多糖和黑色素分别为初级代谢产物和次级代谢产物，两者发酵生产的菌株、发酵条件不一，需要筛选能同时高产木耳多糖和黑色素的菌株，并综合考察同时优化木耳多糖和黑色素的生产条件。木耳多糖和黑色素都是具有良好应用前景的生物活性物质，以液体发酵法同时生产木耳多糖和黑色素可同时获得这两种物质，但目前尚无有关以液体发酵法同时生产木耳多糖和黑色素的研究报导。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种同时提取黑色素和木耳多糖，且二者量高、纯度高的一种同时生产黑色素和木耳多糖的方法。
本发明针对背景技术提到的问题，采取的技术方案为：以黑木耳菌为出发菌株，经斜面菌种活化，进行液体摇瓶培养及发酵培养获得木耳菌发酵液，从所得发酵液中经分离纯化后分别获得木耳多糖和黑色素。
具体地，本发明以液体发酵法同时生产木耳多糖和黑色素的工艺中，所采用的菌种黑木耳菌（auriculariaauricula）于2014年9月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号cgmccno.9711。
具体操作步骤为：
1）菌种活化：将保藏编号为cgmccno.9711的黑木耳菌（auriculariaauricula）菌株接到斜面培养基上活化，温度控制在25~35℃，ph为5.5~6.5，活化时间为50~100h，待菌丝长满斜面培养基，活化结束。菌种活化是将处于保藏状态，活力低的黑木耳菌种变为活力旺盛，繁殖能力和新陈代谢能力强的菌种，为下一步菌种扩大培养做铺垫；
2）摇瓶种子培养：将试管斜面菌种接入装有液体培养基的摇瓶中进行扩大培养，装液系数为0.15~0.25，回旋培养，回旋培养的转速为150~200r/min，培养温度24~30℃，ph为5.7~6.5，培养时间为72~120h。黑木耳菌种在摇瓶培养基中分布均匀，繁殖速度加快，菌种数量迅速上升，得到数量足够的目标菌种；
3）发酵培养：发酵罐的容积一般采用30l~1000l，不论容积大小培养液加入量为罐容积的80%，发酵罐加入培养基前先进行空消，空消温度100~130℃，时间为20~40min，之后待罐温降至50~60℃时，再加入配置好的发酵培养基，加入后进行实消，实消温度110~115℃，时间20~40min。对发酵罐进行空消和实消都是高温灭菌，预防有害菌对黑木耳菌种对豆奶发酵产生不良影响。实消结束后待培养基温度降至20~30℃时接入扩大培养后得到的菌种进行发酵。菌种接种量为发酵培养基体积的5~10%，发酵温度为32~45℃，发酵罐压力为0.03~0.06mpa，搅拌转速为100~150r/min，通风量为1：0.5~1:1v/v/m，发酵时间为96~144h。黑木耳菌是需氧菌，在发酵过程中通入氧气能使其保持旺盛的活力，发酵效率高，产黑色素和木耳多糖能力强。制成的发酵培养基适合黑木耳菌种发酵，发酵的效率高且木耳黑色素的分泌量大，不仅缩短了发酵时间还提高了木耳黑色素和木耳多糖的含量；
4）分离纯化木耳黑色素：将步骤3得到的发酵培养物离心分离，转速为10000~20000r/min，离心20~40min，将木耳菌菌丝体和发酵清液分离。低温真空浓缩发酵清液至原来体积的1/3-1/2，用2~4mol/l的hcl调ph至1.8~2.4，静置0.8~1.2h，离心收集沉淀，分别用蒸馏水和0.005~0.015mol/l的hcl洗涤沉淀，冷冻干燥获得木耳黑色素。分离得到的黑色素纯度高，平面结构和空间结构都没有被破坏，抗氧化性强。冷冻干燥可保护黑色素活性，并能使其保存较长时间；
5）分离纯化木耳多糖：低温真空浓缩步骤3所得上清液至原来体积的1/4-1/3，加入25~35%的乙醇，将木耳菌菌种分泌的蛋白质和氨基酸醇析出来，提高木耳多糖的纯度。离心得上清液，在上清液中加入含0.002~0.004%氯化铁和0.004~0.008%氯化镁的65~80%乙醇，离心取沉淀，将沉淀冷冻干燥获得木耳多糖。在乙醇中添加微量的氯化铁和氯化镁可加大上清液中木耳多糖的析出率，提高木耳多糖的提取率。
斜面培养基成份及其重量份为：40~70份土豆汁，20~40份琼脂，10~15份葡萄糖，2~5份甘草提取物，1~4份姜黄素、0.05~0.15份醋酸钠和0.01~0.1份十二烷基二甲基甜菜碱（优选的0.01份十二烷基二甲基甜菜碱）。上述斜面培养基能充分提供黑木耳菌种活化期间所需的碳源，氮源，微量元素和生长因子，能加快黑木耳菌活化的速度，缩短高抗氧化性豆奶的制备时间，减少成本，提高经济效益。
摇瓶种子培养基成份及其重量份为：10~30份葡萄糖，20~35份牛肉提取物，0.75~1.5份k2hpo4，0.75~1.5份kh2po4，0.5~1份mgso4，1~3份caco3，1~4份nacl，5~10份酵母提取物，2~3份柠檬酸钠，1~4份蜂胶提取物、5~8份大豆分离蛋白和0.01~0.1份山梨坦三油酸酯（优选的，0.02份山梨坦三油酸酯）。上述培养基不仅能提供黑木耳菌种扩大培养所需的营养物质，还能刺激菌种的生长，使其分泌黑色素和木耳多糖的能力提高，提高生产效率。
发酵培养基成份及其重量份为：30~60份葡萄糖，35~70份玉米淀粉，2~5份酪氨酸，0.06~1.5份gp消泡剂，1~3份姜黄素，5~10份海藻多糖、1~5份越橘提取物和0.001~0..01份花生四烯酸（优选的，0.001份花生四烯酸）。上述发酵培养剂能诱导黑木耳菌分泌黑色素和木耳多糖，使其分泌黑色素和木耳多糖的量增加，花生四烯酸使黑色素和木耳多糖纯度相对提高，同时其他对本产品优良品质无关的物质分泌量减少，提高了产品发酵效率，缩短了产品制备时间。
与现有技术相比，本发明的优点在于：可同时生产木耳黑色素和木耳多糖，操作简单，耗时短，经济效益高；制备的斜面培养基能充分提供黑木耳菌种活化期间所需的碳源，氮源，微量元素和生长因子，能加快黑木耳菌活化的速度，缩短高抗氧化性豆奶的制备时间，减少成本，提高经济效益；摇瓶培养基不仅能提供黑木耳菌种扩大培养所需的营养物质，还能刺激菌种的生长，使其分泌黑色素和木耳多糖的能力提高，提高生产效率；发酵培养基能诱导黑木耳菌分泌黑色素和木耳多糖，使其分泌黑色素和木耳多糖的量增加，其他对本产品优良品质无关的物质分泌量减少，提高了产品发酵效率，缩短了产品制备时间。分离纯化得到的产品纯度高，结构不会被破坏，活性强，提取率高。
具体实施例
下面通过实施例对本发明方案作进一步说明：
实施例1：
一种同时生产木耳多糖和黑色素的方法，具体步骤为：
1）菌种活化：将保藏编号为cgmccno.9711的黑木耳菌（auriculariaauricula）菌株接到斜面培养基上活化，温度控制在25~35℃，ph为5.5~6.5，活化时间为50~100h，待菌丝长满斜面培养基，活化结束。菌种活化是将处于保藏状态，活力低的黑木耳菌种变为活力旺盛，繁殖能力和新陈代谢能力强的菌种，为下一步菌种扩大培养做铺垫；
2）摇瓶种子培养：将试管斜面菌种接入装有液体培养基的摇瓶中进行扩大培养，装液系数为0.15~0.25，回旋培养，回旋培养的转速为150~200r/min，培养温度24~30℃，ph为5.7~6.5，培养时间为72~120h。黑木耳菌种在摇瓶培养基中分布均匀，繁殖速度加快，菌种数量迅速上升，得到数量足够的目标菌种；
3）发酵培养：发酵罐的容积一般采用30l~1000l，不论容积大小培养液加入量为罐容积的80%，发酵罐加入培养基前先进行空消，空消温度100~130℃，时间为20~40min，之后待罐温降至50~60℃时，再加入配置好的发酵培养基，加入后进行实消，实消温度110~115℃，时间20~40min。对发酵罐进行空消和实消都是高温灭菌，预防有害菌对黑木耳菌种对豆奶发酵产生不良影响。实消结束后待培养基温度降至20~30℃时接入扩大培养后得到的菌种进行发酵。菌种接种量为发酵培养基体积的5~10%，发酵温度为32~45℃，发酵罐压力为0.03~0.06mpa，搅拌转速为100~150r/min，通风量为1：0.5~1:1v/v/m，发酵时间为96~144h。黑木耳菌是需氧菌，在发酵过程中通入氧气能使其保持旺盛的活力，发酵效率高，产黑色素和木耳多糖能力强。制成的发酵培养基适合黑木耳菌种发酵，发酵的效率高且木耳黑色素的分泌量大，不仅缩短了发酵时间还提高了木耳黑色素和木耳多糖的含量；
4）分离纯化木耳黑色素：将步骤3得到的发酵培养物离心分离，转速为10000~20000r/min，离心20~40min，将木耳菌菌丝体和发酵清液分离。低温真空浓缩发酵清液至原来体积的1/3-1/2，用2~4mol/l的hcl调ph至1.8~2.4，静置0.8~1.2h，离心收集沉淀，分别用蒸馏水和0.005~0.015mol/l的hcl洗涤沉淀，冷冻干燥获得木耳黑色素。分离得到的黑色素纯度高，平面结构和空间结构都没有被破坏，抗氧化性强。冷冻干燥可保护黑色素活性，并能使其保存较长时间；
5）分离纯化木耳多糖：低温真空浓缩步骤3所得上清液至原来体积的1/4-1/3，加入25~35%的乙醇，将木耳菌菌种分泌的蛋白质和氨基酸醇析出来，提高木耳多糖的纯度。离心得上清液，在上清液中加入含0.002~0.004%氯化铁和0.004~0.008%氯化镁的65~80%乙醇，离心取沉淀，将沉淀冷冻干燥获得木耳多糖。在乙醇中添加微量的氯化铁和氯化镁可加大上清液中木耳多糖的析出率，提高木耳多糖的提取率。
斜面培养基成份及其重量份为：40~70份土豆汁，20~40份琼脂，10~15份葡萄糖，2~5份甘草提取物，1~4份姜黄素、0.05~0.15份醋酸钠和0.01~0.1份十二烷基二甲基甜菜碱。上述斜面培养基能充分提供黑木耳菌种活化期间所需的碳源，氮源，微量元素和生长因子，能加快黑木耳菌活化的速度，缩短高抗氧化性豆奶的制备时间，减少成本，提高经济效益。
摇瓶种子培养基成份及其重量份为：10~30份葡萄糖，20~35份牛肉提取物，0.75~1.5份k2hpo4，0.75~1.5份kh2po4，0.5~1份mgso4，1~3份caco3，1~4份nacl，5~10份酵母提取物，2~3份柠檬酸钠，1~4份蜂胶提取物、5~8份大豆分离蛋白和0.01~0.1份山梨坦三油酸酯。上述培养基不仅能提供黑木耳菌种扩大培养所需的营养物质，还能刺激菌种的生长，使其分泌黑色素和木耳多糖的能力提高，提高生产效率。
发酵培养基成份及其重量份为：30~60份葡萄糖，35~70份玉米淀粉，2~5份酪氨酸，0.06~1.5份gp消泡剂，1~3份姜黄素，5~10份海藻多糖、1~5份越橘提取物和0.001~0..01份花生四烯酸。上述发酵培养剂能诱导黑木耳菌分泌黑色素和木耳多糖，使其分泌黑色素和木耳多糖的量增加，其中花生四烯酸使黑色素和木耳多糖纯度相对提高，同时其他对本产品优良品质无关的物质分泌量减少，提高了产品发酵效率，缩短了产品制备时间。
实施例2：
一种同时生产木耳多糖和黑色素的方法，最优选步骤为：
1）菌种活化：将保藏编号为cgmccno.9711的黑木耳菌（auriculariaauricula）菌株接到斜面培养基上活化，温度控制在30℃，ph为6，活化时间为80h，待菌丝长满斜面培养基，活化结束。菌种活化是将处于保藏状态，活力低的黑木耳菌种变为活力旺盛，繁殖能力和新陈代谢能力强的菌种，为下一步菌种扩大培养做铺垫；
2）摇瓶种子培养：将试管斜面菌种接入装有液体培养基的摇瓶中进行扩大培养，装液系数为0.22，回旋培养，回旋培养的转速为150r/min，培养温度28℃，ph为6，培养时间为100h。黑木耳菌种在摇瓶培养基中分布均匀，繁殖速度加快，菌种数量迅速上升，得到数量足够的目标菌种；
3）发酵培养：用体积为100l的发酵罐发酵，发酵罐加入培养基前先进行空消，空消温度121℃，时间为30min，之后待罐温降至50℃时，加入罐容积80%的发酵培养基，加入后进行实消，实消温度110℃，时间40min。对发酵罐进行空消和实消都是高温灭菌，预防有害菌对黑木耳菌种对豆奶发酵产生不良影响。实消结束后待培养基温度降至25℃时接入扩大培养后得到的菌种进行发酵。菌种接种量为发酵培养基体积的8%，发酵温度为40℃，发酵罐压力为0.004mpa，搅拌转速为120r/min，通风量为1:1v/v/m，发酵时间为110h。黑木耳菌是需氧菌，在发酵过程中通入氧气能使其保持旺盛的活力，发酵效率高，产黑色素和木耳多糖能力强。制成的发酵培养基适合黑木耳菌种发酵，发酵的效率高且木耳黑色素的分泌量大，不仅缩短了发酵时间还提高了木耳黑色素和木耳多糖的含量；
4）分离纯化木耳黑色素：将步骤3得到的发酵培养物离心分离，转速为10000r/min，离心30min，将木耳菌菌丝体和发酵清液分离。低温真空浓缩发酵清液至原来体积的1/3，用3mol/l的hcl调ph至2，静置1h，离心收集沉淀，分别用蒸馏水和0.01mol/l的hcl洗涤沉淀，冷冻干燥获得木耳黑色素。分离得到的黑色素纯度高，平面结构和空间结构都没有被破坏，抗氧化性强。冷冻干燥可保护黑色素活性，并能使其保存较长时间；
5）分离纯化木耳多糖：低温真空浓缩步骤3所得上清液至原来体积的1/4，加入30%的乙醇，将木耳菌菌种分泌的蛋白质和氨基酸醇析出来，提高木耳多糖的纯度。离心得上清液，在上清液中加入含0.002%氯化铁和0.006%氯化镁的70%乙醇，离心取沉淀，将沉淀冷冻干燥获得木耳多糖。在乙醇中添加微量的氯化铁和氯化镁可加大上清液中木耳多糖的析出率，提高木耳多糖的提取率。
斜面培养基成份及其重量份为：60份土豆汁，30份琼脂，15份葡萄糖，4份甘草提取物，2份姜黄素、0.05份醋酸钠和0.01份十二烷基二甲基甜菜碱。上述斜面培养基能充分提供黑木耳菌种活化期间所需的碳源，氮源，微量元素和生长因子，能加快黑木耳菌活化的速度，缩短高抗氧化性豆奶的制备时间，减少成本，提高经济效益。
摇瓶种子培养基成份及其重量份为：25份葡萄糖，30份牛肉提取物，0.75份k2hpo4，0.75份kh2po4，0.8份mgso4，2份caco3，3份nacl，7份酵母提取物，2份柠檬酸钠，3份蜂胶提取物、6份大豆分离蛋白和0.02份山梨坦三油酸酯。上述培养基不仅能提供黑木耳菌种扩大培养所需的营养物质，还能刺激菌种的生长，使其分泌黑色素和木耳多糖的能力提高，提高生产效率。
发酵培养基成份及其重量份为：50份葡萄糖，60份玉米淀粉，3份酪氨酸，1份gp消泡剂，2份姜黄素，9份海藻多糖，4份越橘提取物和0.001份花生四烯酸。上述发酵培养剂能诱导黑木耳菌分泌黑色素和木耳多糖，使其分泌黑色素和木耳多糖的量增加，其他对本产品优良品质无关的物质分泌量减少，提高了产品发酵效率，缩短了产品制备时间。本发明实验数据呈非线性变化，因作用机理尚不明确定，待验证本发明实验结果。
以上所述的实施例对本发明的技术方案进行了详细说明，应理解的是以上所述仅为本发明的具体实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的原则范围内所做的任何修改、补充或类似方式替代等，均应包含在本发明的保护范围之内。