本发明属于生物发酵工程技术领域，具体涉及一种食药用菌发酵产物的制备方法及其应用。
背景技术：
食药用菌是一类具有食用或药用价值的大型真菌，近年来，由于其富含多种营养成分和生物活性物质，日益受到人们的青睐。
红栓菌(trametescinnabarina(jacq.)fr.)是担子菌门担子菌纲多孔菌目生物，子实体无柄，菌盖木栓质，半圆形或扇形而基部狭小，有清热除湿、消炎、解毒作用，多被作为中药使用。目前，红栓菌菌种的生物发酵产物中受关注较多的是其具有肿瘤抑制作用的多糖，对其他成分的研究未见报道。
现有山奈酚和/或芥子酸的获得多采用从富含山奈酚和/或芥子酸的植物(例如富含山奈酚的凤仙花，富含芥子酸的白芥等植物)中直接提取，需要大量的植物原料来维持产量，成本普遍偏高，也不够绿色环保。
膜联蛋白(annexins)是一类同源的水溶性多功能蛋白，可以在依赖和不依赖ca2+的环境下与内膜和质膜结合或形成跨膜结构，存在于部分原核生物以及全部的真核生物中，在大多数高等生物中以多基因家族形式存在。膜联蛋白在细胞分泌调控和信号转导过程中起着重要作用，它还对活化血小板及凋亡细胞有极高的亲和力。
将膜联蛋白用于食药用菌红栓菌的发酵生产，提高其发酵产物中山奈酚和芥子酸的含量，国内外尚未见报道。
技术实现要素：
本发明针对现有技术的不足，提供了一种食药用菌发酵产物的制备方法，其利用膜联蛋白提高食药用菌发酵产物中山奈酚和芥子酸的含量，为得到富含山奈酚和芥子酸的产物提供了新的途径。
一种食药用菌发酵产物的制备方法，包括步骤：
(1)红栓菌液体种子液的制备：将活化后的红栓菌菌种接种于液体种子培养基中培养3天-8天，得到红栓菌液体种子液；
(2)固体发酵培养：将步骤(1)中红栓菌液体种子液按占固体培养基体积8％-20％的用量接入添加有省沽油种子的固体培养基中，在15℃-28℃培养3天-30天后，将培养产物真空冷冻干燥、粉碎后得省沽油种子固体发酵培养物；
(3)液体发酵培养：将步骤(1)中红栓菌液体种子液按占液体发酵培养基体积3％-20％的量接种于添加有省沽油种子固体发酵培养物的液体发酵培养基中，培养1天-6天后，加入膜联蛋白，然后继续培养1天-8天，终止发酵，得到富含山奈酚和芥子酸的红栓菌液体发酵产物；
(4)发酵产物萃取分离：将步骤(3)中红栓菌液体发酵产物通过分离处理分别获得富含山奈酚和芥子酸的红栓菌发酵菌丝体和红栓菌胞外液；
所述红栓菌胞外液经冷冻重结晶后调ph值为3-8，进行高压脉冲电场处理，电场强度15kv/cm-70kv/cm，脉冲时40μs-250μs，脉冲宽度1.0μs-5.0μs，脉冲频率120hz-500hz，流速0.5ml/s-2.5ml/s；经高压脉冲电场处理后的溶液，再与十六烷基三甲基溴化铵(ctab)-正庚烷-异丙醇反胶束萃取剂混合，搅拌萃取，静置分层，上层为反胶束层，下层为水相，将反胶束层与kcl水溶液混合，搅拌反萃取，静置分层，合并下层水相经旋蒸，除盐，过滤，洗涤，取滤液旋干，干燥得富含山奈酚和芥子酸的发酵分离粗品。
本发明根据药用真菌红栓菌发酵产物山奈酚和芥子酸合成代谢途径的特点，通过在固体发酵阶段添加省沽油种子，并在特定的发酵阶段添加膜联蛋白，有效提高了红栓菌液体发酵产物中山奈酚和芥子酸的含量。
所述红栓菌菌种可采用任意一种红栓菌菌种，可采用市售产品。例如红栓菌(trametescinnabarina(jacq.)fr.)bio-31308菌种，来源于北京百欧博伟生物技术有限公司。
为了达到更好的发明效果，进行以下优选：
步骤(1)中，所述活化后的红栓菌菌种在液体种子培养基中培养的温度为自然环境温度，优选为20℃-30℃。一般1l液体种子培养基中接入1cm2-4cm2大小活化后的红栓菌菌种菌块。
红栓菌菌种的活化方法为本领域常规的菌种活化方法，一般包括：将斜面保藏的红栓菌菌种接种到pda平板培养基上，在22℃-30℃活化培养3天-10天，得到活化后的红栓菌菌种。
所述pda平板培养基和液体种子培养基均采用本领域种子培养常用的培养基，可采用市售产品。进一步优选，所述的pda平板培养基：马铃薯200g、葡萄糖20g和琼脂15g-20g，用水定容至1000ml。进一步优选，所述的液体种子培养基：葡萄糖5g-20g、酵母粉4g、蛋白胨3g、kh2po41g和mgso40.5g，用水定容至1000ml。
步骤(2)中，每升固体培养基中省沽油种子的添加量为0.5g-8g。
所述固体培养基可采用本领域固体发酵培养常用的培养基，优选由以下质量百分比的组分组成：k2hpo40.1％-0.2％、mgso40.05％-0.1％和余量的水。
步骤(3)中，每升液体发酵培养基中省沽油种子固体发酵培养物的添加量为0.2g-5g。
优选，每毫升液体发酵培养基中添加膜联蛋白0.1mg-2.0mg；进一步优选每毫升液体发酵培养基中添加膜联蛋白0.3mg-1.6mg；最优选的，每毫升液体发酵培养基中添加膜联蛋白1.2mg。
所述的膜联蛋白采用从大多数动物或植物等原料中提取的膜联蛋白，可以选用市售产品，也可以采用现有方法制备，如从瘤背石磺提取的膜联蛋白，可采用以下制备方法制备，包括：将瘤背石磺在液氮中冷冻后取出破碎，将破碎后的组织置于含乙二胺四乙酸(edta)的三羟甲基氨基甲烷(tris)-hcl缓冲液中匀浆，含edta的tris-hcl缓冲液中edta的浓度为5mmol/l，tris-hcl缓冲液的浓度为10mmol/l，ph为7.4，再将匀浆物在3℃-5℃(优选4℃)离心，弃沉淀，上清液经真空冷冻干燥成冻干粉；将冻干粉溶解于0.05mol/ltris-hcl缓冲液中，置于分子量排阻值为6kda的透析袋内，对0.05mol/ltris-hcl缓冲液3℃-5℃(优选4℃)透析过夜；将透析好的样品经离心去沉淀后，上平衡好的二乙氨乙基纤维素(例如deaecellulosede-52)阴离子交换柱，用0.05mol/ltris-hcl缓冲液过柱，流速0.4ml/min，每管6ml自动收集，并于紫外280nm检测并收集相应样品组分(收集280nm有吸收的样品组分)，洗脱完全后，将收集的样品组分真空冻干后溶解于3ml0.01mol/lna2hpo4-nah2po4的缓冲液中，上样于葡聚糖凝胶过滤柱(例如sephadexg-150凝胶过滤柱)，用0.01mol/lna2hpo4-nah2po4的缓冲液洗脱，流速0.3ml/min，每管2ml自动收集，280nm检测并收集相应的组分(收集280nm有吸收的组分)，得到膜联蛋白。
所述液体发酵培养的温度为自然环境温度，一般为20℃-30℃，优选为25℃-30℃。
所述液体发酵培养基可采用本领域液体发酵培养常用的培养基，优选液体发酵培养基的组成为：以1l液体发酵培养基计，葡萄糖25g、蛋白胨6g、酵母粉5g、kh2po41.0g、mgso40.5g和余量的水。
步骤(4)中，所述分离处理可采用本领域现有的分离技术，例如离心分离、过滤分离等技术均可将红栓菌发酵菌丝体和红栓菌胞外液分离。
所述反胶束萃取剂中ctab的浓度为50mmol/l，正庚烷的体积百分浓度为40％，异丙醇的体积百分浓度为20％。
所述kcl水溶液的浓度为0.4mol/l。
本发明所用的培养基均需灭菌、冷却后使用，灭菌的条件采用本领域的常规条件，例如可在120℃-125℃下灭菌20min-30min。
所述红栓菌发酵产物，由红栓菌发酵菌丝体和发酵分离粗品组成。该红栓菌发酵产物中富含山奈酚和芥子酸，山奈酚和芥子酸均具有良好的抗氧化性，主要可应用于保健食品或动物饲料等中，其可以直接作为保健食品或动物饲料等，也可作为主要营养成分用于制备保健食品或制备动物饲料等。
所述红栓菌发酵产物具有抗氧化、增强免疫力等功效，可用于制备具有抗氧化和/或增强免疫力功效的保健食品，可将红栓菌发酵菌丝体和发酵分离粗品与保健食品领域常用的营养组分混合制备得到具有抗氧化和/或增强免疫力功效的保健食品，如所述的保健食品由以下重量份的原料组成：
红栓菌发酵菌丝体粉30重量份-40重量份、发酵分离粗品20重量份-40重量份和多花黄精10重量份-20重量份。
所述红栓菌发酵产物可有效提高断奶仔猪的成活率，可用于制备提高断奶仔猪成活率的动物饲料，可将红栓菌发酵菌丝体和发酵分离粗品与饲料领域常用的基础饲料混合制备得到提高断奶仔猪成活率的动物饲料，如所述的动物饲料由以下重量份的原料组成：红栓菌发酵菌丝体粉20重量份-30重量份、发酵分离粗品15重量份-25重量份和构树叶30重量份-40重量份。
所述红栓菌发酵菌丝体粉是由红栓菌发酵菌丝体经干燥粉碎而成的粉末。
省沽油(staphyleabumalda)属于省沽油科省沽油属,多年生落叶灌木或小乔木，别名水条，是我国稀有的木本油料、可食用灌木和优良的园林绿化树种。省沽油多分布于北半球温带、亚热带和热带地区，我国主要分布于东北、黄河流域和长江流域的黑龙江、河南、山西、陕西、湖北、安徽等地，生于路旁、山地或丛林中。省沽油可清热解毒、消肿、散结，长期食用对无名肿毒、痔疮、皮炎、跌打骨损、动脉硬化、肠炎等病症具有一定的疗效。省沽油果为膨大膜质蒴果，膀胱状，2裂，种子黄色，光亮，有腊质层，果微黄时采摘，摘后置于阴凉处晾干，待果荚80％左右开裂时揉搓，风选出种子。本发明选用省沽油种子。
多花黄精(polygonatumcyrtonemahua)是百合科黄精属的多年生草本植物，根状茎肥厚，少有近圆柱形，茎高可达100厘米，叶互生，椭圆形、卵状披针形至矩圆状披针形，伞形花序，花被黄绿色，浆果黑色，5-6月开花，8-10月结果。分布于中国四川、贵州、湖南、湖北、河南、江西、安徽、江苏、浙江、福建、广东、广西。生林下、灌丛或山坡阴处。中国南方用该种做药用植物黄精使用。黄精医药部位根状茎，味甘，平，补气养阴，健脾，润肺，益肾，用于脾虚胃弱，体倦乏力，口干食少，肺虚燥咳，精血不足，内热消渴。本发明选用多花黄精的根状茎。
构树(broussonetiapapyrifera)别名褚桃等，为落叶乔木，高10-20m；树皮暗灰色；小枝密生柔毛。树冠张开，卵形至广卵形；树皮平滑，浅灰色或灰褐色，不易裂，全株含乳汁。为强阳性树种，适应性特强，抗逆性强，其叶是很好的猪饲料，其韧皮纤维是造纸的高级原料，材质洁白，其根和种子均可入药，树液可治皮肤病，经济价值很高。本发明选用构树叶。
本发明同现有技术相比有如下优点：
1、本发明将膜联蛋白用于红栓菌中山奈酚和芥子酸类成分的发酵生产，且优化了发酵方法，大幅度提高了红栓菌发酵产物中山奈酚和芥子酸含量，山奈酚可达到20.42μg/g-25.53μg/g，芥子酸可达到11.53μg/g-14.82μg/g，富含的山奈酚和芥子酸可用于食品、医药和饲料工业中。
2、针对传统的红栓菌等食药用菌液体发酵产物发酵液由于粘度大、成分复杂、难以利用、造成资源的浪费的情况。利用高压脉冲电场技术，通过对两电极间的流态食品反复施加高电压的短脉冲作用，可以改变脂肪氧化酶的二级和三级结构，从而钝化脂肪氧化酶的酶活。通过高压脉冲电场-反胶束联用萃取，可以高效萃取分离出红栓菌液体发酵产物中的山奈酚和芥子酸等有效成分。
3、本发明采用的膜联蛋白可从大多数动物及植物等原料中提取，来源广泛，成本较低，制备方法也相对简单，可规模提取生产，对红栓菌山奈酚和芥子酸活性物质的发酵生产具有很好的促进效果。
4、本发明所采用的红栓菌菌丝体发酵方法简单，重复性好，发酵周期短，效率高，同时利用天然产物作为生产原料且需求量较小，环保无毒，成本低。整个发酵过程可控，不受外部环境条件限制，非常适合工业化生产和应用推广。本发明方法同样适用于发酵罐规模化生产，具有很好的工业化应用前景。
具体实施方式
下面结合部分具体实施例对本发明内容进行进一步阐明，但本发明的内容并不仅限于下面的实施例。
红栓菌(trametescinnabarina(jacq.)fr.)bio-31308菌种，来源于北京百欧博伟生物技术有限公司。
膜联蛋白的制备：
将瘤背石磺投入液氮中，10min-15min后取出进行破碎，将破碎后的组织置于含5mmol/ledta的tris-hcl缓冲液(tris-hcl缓冲液ph7.4，浓度10mmol/l)中，匀浆3min，再将匀浆物在4℃、8000rmp离心20min，弃沉淀，上清液经真空冷冻干燥成冻干粉；将冻干粉溶解于0.05mol/ltris-hcl缓冲液中，置于分子量排阻值为6kda的透析袋内，对0.05mol/ltris-hcl缓冲液4℃透析过夜；将透析好的样品经离心去沉淀后，上平衡好的deaecellulosede-52阴离子交换柱，用0.05mol/ltris-hcl缓冲液过柱，流速0.4ml/min，每管6ml自动收集，并于紫外280nm检测并收集相应样品组分，洗脱完全后，将收集的样品组分真空冻干后溶解于3ml0.01mol/lna2hpo4-nah2po4的缓冲液中，上样于sephadexg-150凝胶过滤柱，用0.01mol/lna2hpo4-nah2po4的缓冲液洗脱，流速0.3ml/min，每管2ml自动收集，280nm检测并收集相应的组分，得到膜联蛋白。
实施例1
一、材料准备
pda平板培养基：马铃薯200g、葡萄糖20g和琼脂15g，用水定容至1000ml，自然ph，在121℃下灭菌20min。
将斜面保藏的红栓菌菌种接种到pda平板培养基上在22℃活化培养10天，得到活化后的红栓菌菌种。
液体种子培养基：葡萄糖12g、酵母粉4g、蛋白胨3g、kh2po41g和mgso40.5g，用水定容至1000ml，ph自然，在121℃下灭菌20min。
固体培养基由以下质量百分比的组分组成：k2hpo40.1％、mgso40.1％和余量的水，ph自然，在121℃下灭菌20min。
液体发酵培养基的组成为：以1l液体发酵培养基计，葡萄糖25g、蛋白胨6g、酵母粉5g、kh2po41.0g、mgso40.5g和余量的水，ph自然，在121℃下灭菌20min。
二、药用菌发酵产物的制备：
(1)红栓菌液体种子液的制备：将2cm2大小活化后的红栓菌菌种菌块接种于1l液体种子培养基中，25℃培养5天，得到红栓菌液体种子液；
(2)固体发酵培养：将步骤(1)中红栓菌液体种子液按占固体培养基体积10％的用量接入添加有省沽油种子的固体培养基中，在20℃培养15天后，将培养产物真空冷冻干燥、粉碎后得省沽油种子固体发酵培养物；
其中，每升固体培养基中省沽油种子的添加量为5g；
(3)液体发酵培养：将步骤(1)中红栓菌液体种子液按占液体发酵培养基体积10％的量接种于添加有省沽油种子固体发酵培养物的液体发酵培养基中，在25℃培养3天后，加入膜联蛋白，然后继续在25℃培养4天，终止发酵后，得到富含山奈酚和芥子酸的红栓菌液体发酵产物；
其中，每升液体发酵培养基中省沽油种子固体发酵培养物的添加量为2g；每毫升液体发酵培养基中添加膜联蛋白0.3mg；
(4)发酵产物萃取分离：将步骤(3)中红栓菌液体发酵产物通过离心分离分别获得富含山奈酚和芥子酸的红栓菌发酵菌丝体和红栓菌胞外液；
红栓菌胞外液经冷冻重结晶后调ph值为5，进行高压脉冲电场处理，电场强度45kv/cm，脉冲时150μs，脉冲宽度3.0μs，脉冲频率300hz，流速1.5ml/s；经高压脉冲电场处理后的溶液，再与ctab-正庚烷-异丙醇反胶束萃取剂混合(其中，反胶束萃取剂中ctab的浓度为50mmol/l，正庚烷的体积百分浓度为40％，异丙醇的体积百分浓度为20％)，搅拌萃取，静置分层，上层为反胶束层，下层为水相，将反胶束层与0.4mol/lkcl水溶液混合，搅拌反萃取，静置分层，合并下层水相经旋蒸，除盐，过滤，洗涤，取滤液旋干，干燥得富含山奈酚和芥子酸的发酵分离粗品。
三、测定
红栓菌发酵菌丝体冷冻干燥后，测定其中的芥子酸和山奈酚含量。
发酵分离粗品，测定其中的芥子酸和山奈酚含量。
山奈酚含量的测定：
(a)精密称取过60目筛干燥的样品1g于50ml量瓶中，加甲醇-盐酸(甲醇与盐酸的体积比为4:l，盐酸为质量百分浓度25％的盐酸水溶液)混合液45ml，摇匀，放置一夜，于60℃时超声30min，5000rpm离心分离5min，上清液转入另一50ml量瓶中，用质量百分浓度10％的氢氧化钠水溶液调ph2-3，用甲醇稀释至刻线，摇匀，过0.45μm滤膜，即得供试品溶液。
(b)色谱柱shim-ods(150mm×4.6mm，5μm)，流动相为甲醇-磷酸水溶液(甲醇与磷酸水溶液的体积比为70:30，磷酸水溶液的质量百分浓度为0.4％)；流速为1ml/min；检测波长为368nm。
芥子酸含量的测定：
称取20ml2mol/lnaoh水溶液于100ml三角瓶中，称取1g样品于naoh水溶液中，使其均匀分布，于氮气条件下震荡水解2h(280r/min，25℃)，水解后用低温保存的6mol/l稀盐酸调节ph至1.5-2.0，再用35ml乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液，35℃下旋转蒸发浓缩至干，加入2ml质量百分浓度50％甲醇水溶液，溶解蒸干后的物质保存于-40℃冰箱待分析，测定样品前经0.22μm有机相滤膜过滤。
色谱柱：agilentzorbaxeclipseplusc18rapidresolutionhd(2.1mm×50mm，1.8μm-micron)；流动相a：超纯水(含0.1％乙酸，质量百分浓度)；流动相b：乙腈；进样体积：1.5μl；流速：0.5ml·min-1；柱温：30℃；dad扫描波长范围：100-360nm；检测波长：280nm和325nm。
梯度洗脱程序为：0-1min，8％-10％b；1-2.5min，10％-13％b；2.5-5.5min，13％b；5.5-6min，13％-21％b；6-6.5min，21％-27％b；6.5-7.5min，27％-50％b；7.5-9min，50％-100％b；9-12min，100％b；12-12.5min，100％-8％b；后运行2.5min，体积百分比。
质谱条件：离子源：esi电离源(negativemode)；扫描范围：100-2000da；毛细管电压：2800v；锥孔电压35v；碰撞电压：5v；源温度110℃；脱溶剂温度：250℃；脱溶剂气流500l·h-1；锥孔气流：50l·h-1。
检测结果见表1。
实施例2
一、材料准备
pda平板培养基：马铃薯200g、葡萄糖20g和琼脂20g，用水定容至1000ml，自然ph，在121℃下灭菌20min。
将斜面保藏的红栓菌菌种接种到pda平板培养基上在30℃活化培养3天，得到活化后的红栓菌菌种。
液体种子培养基：葡萄糖5g、酵母粉4g、蛋白胨3g、kh2po41g和mgso40.5g，用水定容至1000ml，ph自然，在121℃下灭菌20min。
固体培养基由以下质量百分比的组分组成：k2hpo40.2％、mgso40.05％和余量的水，ph自然，在121℃下灭菌20min。
液体发酵培养基同实施例1。
二、药用菌发酵产物的制备：
(1)红栓菌液体种子液的制备：将1cm2大小活化后的红栓菌菌种菌块接种于1l液体种子培养基中，20℃培养8天，得到红栓菌液体种子液；
(2)固体发酵培养：将步骤(1)中红栓菌液体种子液按占固体培养基体积20％的用量接入添加有省沽油种子的固体培养基中，在28℃培养3天后，将培养产物真空冷冻干燥、粉碎后得省沽油种子固体发酵培养物；
其中，每升固体培养基中省沽油种子的添加量为8g；
(3)液体发酵培养：将步骤(1)中红栓菌液体种子液按占液体发酵培养基体积20％的量接种于添加有省沽油种子固体发酵培养物的液体发酵培养基中，在30℃培养6天后，加入膜联蛋白，然后继续在30℃培养1天，终止发酵后，得到富含山奈酚和芥子酸的红栓菌液体发酵产物；
其中，每升液体发酵培养基中省沽油种子固体发酵培养物的添加量为5g；每毫升液体发酵培养基中添加膜联蛋白0.1mg；
(4)发酵产物萃取分离：将步骤(3)中红栓菌液体发酵产物通过离心分离分别获得富含山奈酚和芥子酸的红栓菌发酵菌丝体和红栓菌胞外液；
红栓菌胞外液经冷冻重结晶后调ph值为8，进行高压脉冲电场处理，电场强度70kv/cm，脉冲时250μs，脉冲宽度5.0μs，脉冲频率500hz，流速2.5ml/s；经高压脉冲电场处理后的溶液，再与ctab-正庚烷-异丙醇反胶束萃取剂混合(其中，反胶束萃取剂中ctab的浓度为50mmol/l，正庚烷的体积百分浓度为40％，异丙醇的体积百分浓度为20％)，搅拌萃取，静置分层，上层为反胶束层，下层为水相，将反胶束层与0.4mol/lkcl水溶液混合，搅拌反萃取，静置分层，合并下层水相经旋蒸，除盐，过滤，洗涤，取滤液旋干，干燥得富含山奈酚和芥子酸的发酵分离粗品。
三、测定
红栓菌发酵菌丝体冷冻干燥后，测定其中的芥子酸和山奈酚含量。
发酵分离粗品，测定其中的芥子酸和山奈酚含量。
芥子酸和山奈酚含量测定同实施例1。
检测结果见表1。
实施例3
一、材料准备
pda平板培养基同实施例1。
将斜面保藏的红栓菌菌种接种到pda平板培养基上在26℃活化培养6天，得到活化后的红栓菌菌种。
液体种子培养基：葡萄糖20g、酵母粉4g、蛋白胨3g、kh2po41g和mgso40.5g，用水定容至1000ml，ph自然，在121℃下灭菌20min。
固体培养基由以下质量百分比的组分组成：k2hpo40.15％、mgso40.05％和余量的水，ph自然，在121℃下灭菌20min。
液体发酵培养基同实施例1。
二、药用菌发酵产物的制备：
(1)红栓菌液体种子液的制备：将4cm2大小活化后的红栓菌菌种菌块接种于1l液体种子培养基中，30℃培养3天，得到红栓菌液体种子液；
(2)固体发酵培养：将步骤(1)中红栓菌液体种子液按占固体培养基体积8％的用量接入添加有省沽油种子的固体培养基中，在15℃培养30天后，将培养产物真空冷冻干燥、粉碎后得省沽油种子固体发酵培养物；
其中，每升固体培养基中省沽油种子的添加量为0.5g；
(3)液体发酵培养：将步骤(1)中红栓菌液体种子液按占液体发酵培养基体积3％的量接种于添加有省沽油种子固体发酵培养物的液体发酵培养基中，在30℃培养1天后，加入膜联蛋白，然后继续在30℃培养8天，终止发酵后，得到富含山奈酚和芥子酸的红栓菌液体发酵产物；
其中，每升液体发酵培养基中省沽油种子固体发酵培养物的添加量为0.2g；每毫升液体发酵培养基中添加膜联蛋白1.6mg；
(4)发酵产物萃取分离：将步骤(3)中红栓菌液体发酵产物通过离心分离分别获得富含山奈酚和芥子酸的红栓菌发酵菌丝体和红栓菌胞外液；
红栓菌胞外液经冷冻重结晶后调ph值为3，进行高压脉冲电场处理，电场强度15kv/cm，脉冲时40μs，脉冲宽度1.0μs，脉冲频率120hz，流速0.5ml/s；经高压脉冲电场处理后的溶液，再与ctab-正庚烷-异丙醇反胶束萃取剂混合(其中，反胶束萃取剂中ctab的浓度为50mmol/l，正庚烷的体积百分浓度为40％，异丙醇的体积百分浓度为20％)，搅拌萃取，静置分层，上层为反胶束层，下层为水相，将反胶束层与0.4mol/lkcl水溶液混合，搅拌反萃取，静置分层，合并下层水相经旋蒸，除盐，过滤，洗涤，取滤液旋干，干燥得富含山奈酚和芥子酸的发酵分离粗品。
三、测定
红栓菌发酵菌丝体冷冻干燥后，测定其中的芥子酸和山奈酚含量。
发酵分离粗品，测定其中的芥子酸和山奈酚含量。
芥子酸和山奈酚含量测定同实施例1。
检测结果见表1。
实施例4
除了“步骤(3)中每毫升液体发酵培养基中添加膜联蛋白2mg”之外其余操作同实施例1，得到富含山奈酚和芥子酸的红栓菌发酵菌丝体和发酵分离粗品。
芥子酸和山奈酚含量测定同实施例1。检测结果见表1。
实施例5
除了“步骤(3)中每毫升液体发酵培养基中添加膜联蛋白1.2mg”之外其余操作同实施例1，得到富含山奈酚和芥子酸的红栓菌发酵菌丝体和发酵分离粗品。
芥子酸和山奈酚含量测定同实施例1。检测结果见表1。
对比例1
(1)摇瓶种子培养
液体种子培养基：葡萄糖12g、酵母粉4g、蛋白胨3g、kh2po41g和mgso40.5g，用水定容至1000ml；ph自然，在121℃下灭菌20min。
培养方法：取2cm2大小实施例1中活化后的红栓菌菌种菌块接入灭菌冷却后1l液体种子培养基中，25℃，120r/min下摇床培养3天，得到培养好的种子液。
(2)摇瓶发酵培养
液体发酵培养基同实施例1。
培养方法：将培养好的种子液按占液体发酵培养基体积10％的接种量接入液体发酵培养基中，在25℃，120r/min摇床中培养12天，得到发酵产物。每个试验设3个平行。
检测结果见表1。
对比例2不添加膜联蛋白
除了“(3)液体发酵培养：将步骤(1)中红栓菌液体种子液按占液体发酵培养基体积10％的量接种于添加有省沽油种子固体发酵培养物的液体发酵培养基中，在25℃培养6天，终止发酵，得到红栓菌液体发酵产物；其中，每升液体发酵培养基中省沽油种子固体发酵培养物的添加量为2g”之外其余操作同实施例1，得到红栓菌发酵菌丝体和发酵分离粗品。
芥子酸和山奈酚含量测定同实施例1。检测结果见表1。
应用例1
将实施例1中的红栓菌发酵菌丝体经干燥粉碎，得到红栓菌发酵菌丝体粉。多花黄精根状茎干燥后粉碎备用。
将红栓菌发酵菌丝体粉30重量份、实施例1中的发酵分离粗品20重量份和多花黄精10重量份混合均匀，得到保健食品。
应用例2
将实施例2中的红栓菌发酵菌丝体经干燥粉碎，得到红栓菌发酵菌丝体粉。多花黄精根状茎干燥后粉碎备用。
将红栓菌发酵菌丝体粉40重量份、实施例2中的发酵分离粗品40重量份和多花黄精20重量份混合均匀，得到保健食品。
应用例3
将实施例3中的红栓菌发酵菌丝体经干燥粉碎，得到红栓菌发酵菌丝体粉。多花黄精根状茎干燥后粉碎备用。
将红栓菌发酵菌丝体粉35重量份、实施例3中的发酵分离粗品30重量份和多花黄精15重量份混合均匀，得到保健食品。
应用例4
将实施例1中的红栓菌发酵菌丝体经干燥粉碎，得到红栓菌发酵菌丝体粉。构树叶粉碎备用。
将红栓菌发酵菌丝体粉20重量份、实施例1中的发酵分离粗品15重量份和构树叶30重量份混合均匀，得到动物饲料。
应用例5
将实施例2中的红栓菌发酵菌丝体经干燥粉碎，得到红栓菌发酵菌丝体粉。构树叶粉碎备用。
将红栓菌发酵菌丝体粉30重量份、实施例2中的发酵分离粗品25重量份和构树叶40重量份混合均匀，得到动物饲料。
应用例6
将实施例3中的红栓菌发酵菌丝体经干燥粉碎，得到红栓菌发酵菌丝体粉。构树叶粉碎备用。
将红栓菌发酵菌丝体粉25重量份、实施例3中的发酵分离粗品20重量份和构树叶35重量份混合均匀，得到动物饲料。
表1红栓菌发酵代谢产物含量检测结果
注：与对比例1比较，δ：p<0.05；δδ：p<0.01；表明差异具有显著性；
与对比例2比较，*：p<0.05；**：p<0.01；表明差异具有显著性；
表1中山奈酚含量代表红栓菌发酵菌丝体和发酵分离粗品中山奈酚的总含量，芥子酸含量代表红栓菌发酵菌丝体和发酵分离粗品中芥子酸的总含量。
表1数据显示，与对比例1相比，采用本发明方法液体发酵培养的红栓菌代谢产物菌丝体中山奈酚含量提高了63.0％-103.8％，芥子酸含量提高了71.6％-120.5％。与对比例2相比，采用本发明方法液体发酵培养的红栓菌代谢产物菌丝体中山奈酚含量提高了30.6％-63.3％，芥子酸含量提高了38.6％-78.1％。表明本发明结合红栓菌发酵产物山奈酚和芥子酸合成代谢途径的特点，通过在固体发酵阶段添加省沽油种子，并在特定的发酵阶段添加膜联蛋白，显著提高了红栓菌液体发酵产物中山奈酚和芥子酸的含量。
检测实施例1-5中红栓菌发酵菌丝体和发酵分离粗品、对比例1中发酵产物、对比例2中红栓菌发酵菌丝体和发酵分离粗品和vc(维生素c)的抗氧化活性，检测结果见表2：
表2抗氧化检测结果
注：与空白对照组对比例1比较，δ：p<0.05；δδ：p<0.01；表明差异具有显著性；
与对比例2比较，*：p<0.05；**：p<0.01；表明差异具有显著性。
表2数据显示，本发明红栓菌发酵菌丝体和发酵分离粗品具有优异的抗氧化性能。
分别用应用例4-6中的动物饲料饲养20头刚断奶的仔猪，用由构树叶30重量份和玉米粉35重量份混合均匀组成的对照饲料饲养相同环境下的另20头刚断奶的仔猪，断奶后5-6天内需控制采食量，以喂8成饱为宜，实行少喂多餐(6-8次/天)，逐渐过渡到自由采食，一个月后用应用例4-6中的动物饲料饲养的仔猪全部成活，对照饲料饲养的仔猪成活率在75％。对比显示，本发明动物饲料能够有效提高断奶仔猪的成活率。
在本发明制备方法限定的范围内各参数的变化并不影响红栓菌液体发酵代谢产物中山奈酚和芥子酸含量的提高，因此本发明制备方法中任意参数的组合均可实现红栓菌液体发酵代谢产物山奈酚和芥子酸含量的提高。在此不再赘述。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进，这些改进也应视为本发明的保护范围。