本发明涉及一种菌体保藏方法，具体涉及一种简单有效的低温冷冻保藏反硝化菌的方法。
背景技术：
氨氮是国家实现水污染控制总量控制的污染物，水体中氨氮含量过高会引起水质富营养化，导致水体中某些藻类过度繁殖，其它生物生长受到影响，从而破坏了水生生态系统，导致水质恶化并影响到其使用功能。生物脱氮技术以其环保高效无二次污染等优点是目前国内外脱氮技术研究应用的热点。生物脱氮是在好氧条件下通过硝化反应先将氨氮氧化为硝氮或亚硝氮，再通过缺氧条件下的反硝化反应将硝氮或亚硝氮还原成气态氮从水中除去。由此可见，反硝化过程才是真正脱氮的步骤，而完成反硝化的高性能反硝化菌被选育出来后，如何能够长期有效的保藏至关重要。
微生物菌种是重要的生物资源之一，一个优良的菌种被选育出来以后，必须保持其优良性状不变或尽可能地少变慢变，才不至于降低菌体性能，能长期应用于生产中。菌种保藏的基本原理主要是根据其生理生化特征，人工创造条件，使微生物代谢处于不活泼、生长繁殖受抑制的休眠状态，即采取低温、干燥、缺氧等条件，使菌种暂时处于休眠状态。一种好的保藏方法首先应能长期保持菌种原有的优良性状不变，同时还需考虑到方法本身的简便和经济，以便在生产上能推广使用。
为了有效地保藏微生物菌种，就需要针对菌种的特性研究选用适宜的保藏方法。菌种保藏方法很多，目前国内外常用的有定期移植法、液体石蜡法、沙土管法、真空冷冻干燥法、超低温冰箱冷冻法、超低温液氮冷冻法等。其中定期移植法、液体石蜡法、沙土管法、真空冷冻干燥法不适合大量菌种的保藏；超低温液氮冷冻法和超低温冰箱冷冻法等均需使用保护剂来制备细胞悬液，保护剂有牛乳、血清、糖类、甘油、二甲亚砜等，目的是防止因冷冻或水分不断升华对细胞的损害。冷冻保存是解决种质退化和防止自然积累性突变的一种有效途径，但传统的低温保存需要昂贵的程序降温仪器，步骤繁琐。完全玻璃化是低温保存的一种新方法，即在高浓度保护剂下，细胞连同保护剂于快速降温中都进入玻璃化状态，避免胞内冰晶形成，使器官和组织各部分都进入相同的状态，具有设备简单、程序简单和冻存效果好等优点。但是保护剂仅能保证菌体的存活率，对菌体活性是否有影响及影响的程度还不明确。
CN101307293提供了一种菌种保藏方法，采用半固体、低温密封培养的方法：将菌种接种于无菌的半固体培养基中，倒入无菌液体石蜡后竖直存放入6～8℃的环境温度中保存。所述菌种为金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌、黑曲霉或白色链珠菌。采用此方法可延长菌种的保存时间，同时菌种的浓度保持相对稳定，为生产、试验节约了大量的成本，减少了菌种使用后废弃物的处理和排放，减少了对环境的危害。但是工序复杂繁琐，不适合大量菌体的保藏。
CN101012439公开了一种浸矿微生物嗜酸氧化亚铁硫杆菌深低温冷冻保藏过程中的保护剂。其配方组成为100G/L～150G/L甘油、80G/L～120G/L海藻糖、160G/L～200G/L蔗糖、40G/L～60G/L二甲亚砜。该保护剂可以使冷冻嗜酸氧化亚铁硫杆菌的存活率最高达到89%。但是，该方法并不适用于反硝化菌的保藏，并且保护剂中含有毒物质二甲亚砜。
CN103773684涉及一种反硝化菌的保藏方法，包括如下步骤：（1）将反硝化菌培养至生长稳定期，并收集菌体；（2）配制反硝化菌保藏营养液；（3）步骤（1）收集的反硝化菌体与步骤（2）配制的保藏营养液混合，含水率为40%～80%，含水率指反硝化菌保藏体系中水的重量含量；（4）低温冷冻保藏。该方法可以延长菌种的保存时间，使菌种的活性保持相对稳定。但该法需要投加高浓度营养物质和保藏剂，保藏成本较高。此外，冷冻保藏温度为-20～-70℃，为了提高保藏效果，通常选择-50～-70℃，长期保藏能耗较高。
技术实现要素：
针对现有技术的不足，本发明提供了一种反硝化菌的保藏方法，适宜于大量长期保存反硝化菌，具有存活率高、活性恢复快、保藏能耗低等优点。
本发明反硝化菌的保藏方法，包括如下内容：
（1）将反硝化菌培养至稳定生长期，并收集菌体；
（2）配制反硝化菌保藏营养液，主要包括碳源、氮源和微量物质等；
（3）步骤（1）反硝化菌与步骤（2）保藏营养液混合，加入适量保藏助剂，所述保藏助剂包括糖脂、糖醇和有机酸盐；
（4）低温冷冻保藏。
本发明中，步骤（1）的反硝化菌培养采用本领域常规的方法，如SBR法等。反硝化菌培养液可以采用人工配制的培养液，也可以采用实际废水对反硝化菌进行培养。反硝化菌培养液所含氮源为硝酸盐氮和/或亚硝酸盐氮，氮源浓度为100～800mg/L；所含碳源为甘油、甲醇等，浓度以COD计为1000～5000mg/L，还含有少量Fe2+、Mg2+、K+、Ca2+等金属离子以及磷酸根离子等。反硝化菌培养条件为：温度15～40℃，pH为7.0～8.5，溶解氧浓度低于1mg/L，搅拌转速10～50rpm，培养3～10天至稳定生长期。反硝化菌培养至稳定生长期，通过沉降、过滤、离心等方法收集获得的反硝化菌体。反硝化菌培养的初始来源可以是任意的需要保藏的反硝化菌。
本发明中，步骤（2）保藏营养液中碳源为甘油，氮源为硝酸盐氮（NO3--N）和/或亚硝酸盐氮（NO2--N），如硝酸盐为NaNO3、KNO3等，亚硝酸盐为NaNO2等，微量物质为FeSO4、KH2PO4、MgCl2和CaCl2。各种物质的用量按步骤（3）中所需的浓度确定。
本发明中，步骤（3）反硝化菌与保藏营养液混合物中，甘油浓度以COD 计为0.5～2.0g/L，NO3--N和/或NO2--N浓度为 0.2～0.8g/L，Fe2+浓度为0.01～0.06g/L，K+浓度为0.05～0.5g/L，Ca2+浓度为0.01～0.1g/L，Mg2+浓度为0.05～0.5g/L。
本发明中，步骤（3）所述保藏助剂中，以重量份计，糖脂含量为0.5-15重量份，优选2-10重量份；糖醇含量为0.5-15重量份，优选2-10重量份；有机酸盐为5-30重量份，优选为10-20重量份。所述糖脂为海藻糖脂、槐糖脂和鼠李糖脂等中的至少一种，优选内酯型槐糖脂；糖醇选自甘露醇、木糖醇、乳糖醇、核糖醇、半乳糖醇、肌醇和赤藓醇等中的一种或几种，优选乳糖醇；有机酸盐为乙酸钠、琥珀酸钠和柠檬酸钠等中的一种或几种，优选乙酸钠。使用量按照保藏体系中保藏剂浓度为0.01-3.0mg/L，优选0.1-0.5mg/L进行投加。
本发明中，步骤（4）低温冷冻保藏采用本领域常规的低温冷冻设备，冷冻保藏温度为-10℃～-70℃，优选为-10℃～-30℃。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
（1）从反硝化菌生长期、保藏液组成、保藏助剂等多方面进行综合优化，能够实现反硝化菌长期保藏，菌种活性保持相对稳定，菌体保藏后存活率高，活性恢复迅速，对于大量菌体保藏经济方便。
（2）通过加入特定的保藏助剂，在-10℃～-30℃条件下就可以实现良好的菌体保藏性能，降低了保藏能耗。
（3）本发明方法简单，不需特殊设备，经济简便，适合大量菌种的保藏，保藏3～5年能力后，存活率可以达到90%以上。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明方法和效果进行详细说明。
本发明使用的保藏助剂按照表1的比例和配方制备。所述促进剂浓度均为0.5g/L。
表1 保藏助剂的配方及比例
实施例1
配制NO2--N浓度为200mg/L，甘油为碳源，浓度以COD计为2500mg/L的培养液，在10L生物反应池中采用SBR法对反硝化菌进行培养，温度为27℃，pH为7.8，搅拌转速20rpm。当菌体进入稳定生长期后停止培养，沉降、离心后收集菌体。
制备保藏营养液，按照反硝化菌与保藏营养液混合物中，营养物质浓度为：甘油浓度以COD 计为1.0g/L，NO2--N浓度为 0.2g/L，Fe2+浓度为0.02g/L，K+浓度为0.1g/L，Ca2+浓度为0.05g/L，Mg2+浓度为0.1g/L制备。
将菌体与配制的营养液混合，按照体系中保藏剂浓度为0.25mg/L投加保藏助剂A，于-20℃低温冰箱保藏。2年后取出考察菌体的活性和存活率，经过2d的恢复，菌体活性可以完全恢复，存活率可达95%。
实施例2
培养过程及操作条件同实施例1，不同在于：甘油浓度以COD 计为2.5g/L。2年后取出考察菌体的活性和存活率，经过2d的恢复，菌体活性可完全恢复，存活率可达95%。保护剂使用量增大后，保藏效果基本相同。
实施例3
培养过程及操作条件同实施例1，不同在于：于-50℃低温冰箱保藏。2年后取出考察菌体的活性和存活率，经过2d的恢复，菌体活性可完全恢复，存活率可达95%。保藏效果基本相同，但-50℃保藏的能耗相对较高。
实施例4
培养过程及操作条件同实施例1，不同在于：采用保藏助剂B。2年后取出考察菌体的活性和存活率，经过2d的恢复，菌体的活性可以完全恢复，存活率可达93%。
实施例5
培养过程及操作条件同实施例1，不同在于：采用保藏助剂C。2年后取出考察菌体的活性和存活率，经过2d的恢复，菌体的活性可以完全恢复，存活率可达92%。
实施例6
配制硝氮浓度为600mg/L，甘油为碳源，浓度以COD计为4000mg/L的培养液，在10L生物反应池中采用SBR法对反硝化菌进行培养，温度为30℃，pH为8.0，搅拌转速40rpm。当菌体进入稳定生长期后停止培养，沉降或离心后收集菌体。
制备保藏营养液，按照反硝化菌与保藏营养液混合物中，营养物质浓度为：甘油浓度以COD 计为2.5g/L，NO3--N浓度为 0.6g/L，Fe2+浓度为0.02g/L，K+浓度为0.1g/L，Ca2+浓度为0.05g/L，Mg2+浓度为0.1g/L制备。
将菌体与配制的营养液混合，按照体系中保藏剂浓度为0.5mg/L投加保藏助剂A，于-30℃低温冰箱保藏。3年后取出考察菌体的活性和存活率，经过4d的恢复，菌体的活性可完全恢复，存活率可达91%。
实施例7
配制硝氮浓度为200mg/L，亚硝氮浓度为200mg/L，甘油为碳源，浓度以COD计为3000mg/L的培养液，在10L生物反应池中采用SBR法对反硝化菌进行培养，温度为32℃，pH为8.0，搅拌转速30rpm。当菌体进入稳定生长期后停止培养，沉降或离心后收集菌体。
制备保藏营养液，按照反硝化菌与保藏营养液混合物中，营养物质浓度为：甘油浓度以COD 计为1.5g/L，NO3--N浓度为 0.2g/L，NO2--N浓度为 0.2g/L，Fe2+浓度为0.02g/L，K+浓度为0.1g/L，Ca2+浓度为0.05g/L，Mg2+浓度为0.1g/L制备。
将菌体与营养液混合，按照体系中保藏剂浓度为0.15mg/L投加保藏助剂A，于-20℃低温冰箱保藏。5年后取出考察菌体的活性和存活率，经过6d的恢复，菌体活性可完全恢复，存活率可达92%。
比较例1
培养过程及操作条件同实施例1，不同在于：不采用保藏助剂A。2年后取出考察菌体的活性和存活率，经过2d的恢复，菌体的活性基本可以恢复，存活率可达80%。分析原因可能是一方面由于保护剂甘油使用量不足，另一方面冷冻温度不够。
比较例2
培养过程及操作条件同实施例1，不同在于：采用保藏剂D、E、F。2年后取出考察菌体的活性和存活率，经过3d的恢复，菌体的活性基本可以恢复，存活率可达85%左右。