一种金针菇多糖及其制备方法与流程

技术领域

本发明涉及生物医药领域，具体涉及一种金针菇多糖及其制备方法。

背景技术：

金针菇又名朴菇、冬菇、构菌和金钱菌等，是目前人工栽培最为广泛的食用菌之一，其产量已位居世界前三。大量研究表明，金针菇主要的功能成分是金针菇多糖，其具有抗肿瘤、免疫调节、降低胆固醇、降血压、改善记忆、抗炎症、抗病毒、抑菌以及抗氧化等多种功能活性。金针菇多糖是一个以葡聚糖为主，由数个多糖组分构成的混合多糖，不同的提取分离方法得到的金针菇多糖，其分子量、单糖组成等分子结构特征有所不同，具有的生物功能活性也各有差异。现有技术中粗多糖由于其成分复杂，其中含有蛋白类、色素、小分子可溶性物质等，导致产品质量难以控制。因此需要进一步纯化处理，根据其分子结构确定其生物功能。

新城疫是由新城疫病毒引起的一种禽类的高度接触性、传染性和致死性疾病。近年来，国内外多个实验室的研究结果表明，由于NDV只有一个血清型，常用的疫苗株能对不同基因型的流行株攻击提供较好的临床保护，但鸡群中流行株的带毒率和病毒载量较高，这是免疫鸡群仍发生非典型新城疫的主要原因。一些细胞因子虽然有一定疗效，但由于其价格昂贵，很难在畜禽业中推广应用。因此，寻找安全有效的新型抗新城疫兽药一直是兽医领域研究的热点。

CN201210219695公开了一种通过采用超声波提取金针菇多糖的方法，披露了金针菇多糖具有免疫调节活性，但是仅通过实验对体外活性进行了评价，其在体内的活性评价并没有涉及；CN201410599264公开了一种通过水煮醇沉的方式提高金针菇多糖纯度的方法，但是通过该方法提取出的多糖，其组分及生物应用不能确定，得到的多糖不是纯品。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种可以从金针菇中提取高纯度均一多糖的方法，该方法保证了多糖得率与活性之间的一致性，确保了提纯后的金针菇多糖的组分与含量。

本发明的技术方案：

一种金针菇多糖的制备方法，包括热水提取、乙醇沉淀、离子交换柱层析、凝胶柱层析，具体步骤如下：

（1）脱脂：取金针菇子实体，将其置于50-60℃鼓风中干燥至恒重，粉碎干燥后的金针菇子实体，按料液比1:8-1:10加入95%乙醇，室温下充分浸泡24小时，过滤去除脂类；

（2）将步骤（1）重复两次；

（3）热水提取：收集残渣，在室温下干燥，按料液比1:15-1:20加入蒸馏水后充分浸泡20-30min，于90-120℃下反应1-2小时，过滤，收集滤液；

（4）重复步骤（3）两次，合并三次反应的滤液；

（5）乙醇沉淀：将滤液进行浓缩，然后添加无水乙醇至乙醇的质量百分比浓度达到60%，充分搅匀后于4-20℃下静置8-12小时，离心，收集沉淀物；

（6）将沉淀物用5-10倍蒸馏水溶解后，水浴挥去残留乙醇，冷冻干燥即得金针菇粗多糖；

（7）离子交换柱层析：将冻干金针菇粗多糖样品溶于蒸馏水中，离心后取上清液，将上清液进行DEAE-Sepharose Fast Flow离子柱层析；

（8）凝胶柱层析：将离子柱层析得到的金针菇粗多糖组分配成样品液，离心，经SephacrylS-300柱层析后得到金针菇多糖。

进一步的，制备得到的金针菇多糖包括四种组分，包括半乳糖、甘露糖、岩藻糖和葡萄糖四种单糖，其摩尔质量比为2.6:1.4:1.1:1，金针菇多糖可以抑制新城疫病毒，具有免疫调节活性。

本发明与现有技术相比具有如下优点：

1、本发明提供的制备金针菇多糖的方法，引入了凝胶柱层析方法，通过分离纯化制备得到高纯度均一金针菇多糖，其一级分子结构确定，多糖重均分子量为1.8×104 Da，单糖组成为半乳糖、甘露糖、岩藻糖和葡萄糖，四种单糖的摩尔质量比为2.6:1.4:1.1:1，通过研究发现，该金针菇多糖具有抑制新城疫病毒的作用，并且可以在一定程度上提高动物的免疫能力。

2、本发明分离纯化获得的多糖，其组分与占比确定，产品质量易于控制，与粗多糖相比，杂质较少，不易引起动物的过敏反应，因而安全性更高，同时其对抗新城疫病毒功效不减，更有利于在兽医临床上推广应用。

附图说明

图1为金针菇多糖对巨噬细胞释放NO的影响；

图2为新城疫病毒与金针菇多糖同时添加抗病毒活性检测结果。

具体实施方式

下列实施例中使用的主要材料的来源如下：

1. 金针菇子实体购于上海雪榕生物科技股份有限公司，

2. RAW264.7骨髓巨噬细胞株购自美国国家菌种保藏中心（ATCC number TIB-71TM），

3. 5日龄小鸡购自广东省农业科学院畜牧研究所，

4. 小鸡饲料购自广州市番禺区大川饲料有限公司，

5. 新城疫强毒Lasota株保存于广东海大畜牧兽医研究院，病毒TCID50为10-6.33/0.1mL，

6. 9-10日龄鸡胚购自梅里亚动物保健有限公司，为NDV非免鸡胚，

7. DMEM、RPMI1640购于GIBCO公司，

8. DEAE-Sepharose Fast Flow离子柱，

9. Sephacryl S-300柱。

实施例1：

金针菇多糖的制备，包括以下步骤：

（1）脱脂：取金针菇子实体，将其置于60℃鼓风中干燥至恒重，粉碎干燥后的金针菇子实体，按料液比1:8（W/V）加入95%乙醇，室温下充分浸泡24小时，过滤去除脂类；

（2）将步骤（1）重复两次；

（3）水提：收集残渣，在室温下干燥，按料液比1:20（W/V）加入蒸馏水后充分浸泡，于100℃下反应1小时，过滤，收集滤液；

（4）重复步骤（3）两次，合并三次反应的滤液；

（5）将滤液进行浓缩，然后添加无水乙醇，至乙醇的质量百分比浓度达到60%，充分搅匀后置于阴凉下，静置10小时，离心，收集沉淀物；

（6）将沉淀物用5倍蒸馏水溶解后，水浴挥去残留乙醇，冷冻干燥即得金针菇粗多糖；

（7）取1g冻干金针菇粗多糖溶于100mL蒸馏水中，12000 rpm离心15min，取50mL上清液进行DEAE-Sepharose Fast Flow离子柱层析，其中：蒸馏水与0-2 mol/L NaCl梯度洗脱，流速为10mL/min，每管收集15mL，逐管苯酚-硫酸法检测，得到金针菇粗多糖组分；

（8）将离子柱层析得到的FVP60A组分配成10mg/mL样品液，12000rpm离心5min，经Sephacryl S-300柱层析分别得到提纯后的金针菇多糖。

实验结果：得到12.38mg金针菇多糖纯品，其结构为

，

经离子色谱测定其分子量为1.8×104Da，经离子色谱检测发现其由半乳糖，甘露糖、岩藻糖和葡萄糖四种单糖组成，摩尔质量比例为2.6:1.4:1.1:1。

实施例2：

供试样品的配制

精确称取实施例1制备的金针菇粗多糖和金针菇多糖样品于灭菌的eppendorf管中，用PBS缓冲液配置成浓度5mg/mL的溶液，充分溶解后以12000 rpm/min离心30min，无菌条件下转移至新的无菌eppendorf管中，将样品稀释成50、200和500μg/mL待用。阴性对照为PBS缓冲液，阳性对照为10μg/mL LPS溶液。

小鼠RAW264.7巨噬细胞的制备

用DMEM培养基在37℃、5% CO₂条件下传代培养后，用0.25%胰蛋白酶消化，混悬液300g离心3min后收集细胞，用无色RPMI1640培养基将细胞稀释到一定浓度备用。

巨噬细胞释放NO活性的测定

由于NO极不稳定，在体内很快生成亚硝酸基（NO2^-）和硝酸基（NO3^-），故采用Griess法测定样品中的NO2^- / NO3^-作为衡量NO水平的指标。

（1）用亚硝酸钠制标准曲线：

配成不同浓度的亚硝酸钠溶液，浓度梯度为0、5、10、15、20、25、30、35、40μM共9个浓度梯度；取100μL于96孔板，加入50μL Griess试剂，测定543nm吸光值，标准曲线每个浓度3个重复，绘制标准曲线。

（2）NO产量测定

巨噬细胞的培养液消化完毕后用无色RPMI1640 培养基(含10%胎牛血清、1%抗生素液体)将细胞稀释至5×105/ml，每孔180μL加入96孔板，然后再加入20μL各浓度待测样品和阴性（PBS）、阳性（LPS，10μg/mL）对照，于37℃、含5%的CO2条件下培养48h后，取100μL培养上清于96孔板，加入50μL Griess试剂，显色10min后，于波长543nm处测定吸光度，根据标准曲线计算相应的NO量。

实验结果：

金针菇粗多糖在各浓度均不能引起RAW264.7NO释放增加：在浓度50μg/mL时，刺激巨噬细胞产生NO的量（单位：μmoL/5.0×105cells）为4.84；在浓度200μg/mL时，产生NO量为4.41；在浓度500μg/mL时，产生NO量为5.17；

金针菇多糖纯品在浓度50μg/mL时，刺激巨噬细胞产生NO的量（单位：μmoL/5.0×105cells）为7.48；在浓度200μg/mL时，产生NO量为12.83；在浓度500μg/mL时，产生NO量为32.94，阴性对照为5.61，阳性对照（浓度1μg/mL）27.69，样品组显著高于阴性对照活性（P<0.05），金针菇多糖纯品在500μg/mL时活性高于阳性对照LPS，表现出良好的刺激巨噬细胞产生NO活性。

实施例3

成纤维鸡胚细胞制备

取9-10日龄发育良好的鸡胚用碘酒和酒精棉球消毒，无菌操作下取出鸡胚放于灭菌平皿中，除去鸡胚头、四肢及内脏，用PBS液冲洗鸡胚3次。将清洗后的鸡胚移入无菌的100mL小烧杯中，用眼科剪剪成1mm³的组织快，近于乳糜状。先用PBS液洗3次，并静置几分钟，待组织块下沉，吸弃上层液体，再加入PBS液，转移到细胞培养瓶中，静置几分钟，待组织块下沉，吸弃上层PBS液，向细胞培养瓶组织块内加入0.25%的胰蛋白酶溶液5mL，胰蛋白酶溶液与鸡胚组织量之比为4-5:1，将带有组织小块的细胞培养瓶置37℃水浴中消化30分钟。每10分钟轻轻摇动一次，使细胞消化均匀。随时观察被消化细胞，当组织快变得疏松、表面发毛时中止消化。吸出上层消化液，用5mL的PBS液轻轻加入并混匀，静置几分钟后，吸弃上层液体，反复洗涤2-3次。加入3mL的5%胎牛血清营养液，用大口吸管反复吹打数次。静置片刻，吸上层细胞悬液经有纱布的漏斗过滤入另一细胞培养瓶中，先吸去少量营养液蘸湿纱布，以免细胞吸附在纱布上。再加入2-3mL营养液充分吹打，直至形成均匀的细胞悬液，准备细胞计数。取上述细胞悬液0.5mL加入0.1%即0.1mol/L的结晶紫—柠檬酸溶液2mL，置室温或37℃培养箱中5-10min，充分振动混合后，用毛细管或吸血管吸取，滴入血细胞计数板内，在显微镜下计数。按细胞计数结果将细胞悬液用营养液进一步稀释成50万个细胞/mL的细胞悬液。将细胞悬液分装入培养瓶，分装量为瓶容量的1/10，塞紧瓶塞，写上培养日期，细胞名称、姓名。轻轻摇动培养瓶使细胞均匀，然后静置放好，不再摇动。放入5% CO₂、37℃培养箱内培养。

金针菇多糖对NDV的抑制作用实验：

取对数生长期的鸡成纤维细胞接种到 96孔细胞培养板，加入用DMEM培养基稀释的金针菇多糖，将每种含量的多糖配成浓度分别为15.63ug/mL、7.81ug/mL、3.91ug/mL和1.95ug/mL的溶液，同时设置DMEM培养基溶剂为对照。将不同浓度的多糖分别用0.22um滤膜过滤除菌，每组添加各浓度多糖和100 TCID₅₀的病毒液（200uL/孔）；另外设无细胞孔仅加维持液做为检测调零孔。每组以加入病毒液后开始计算作用时间，每天观察一次CPE变化，并对细胞进行拍照和MTT法检测OD₄₉₀值。

表1. 新城疫病毒与金针菇多糖同时添加组的鸡成纤维细胞OD值

实验结果：如图2和表1所示，中低浓度的金针菇多糖抗病毒活性并不明显，而当多糖浓度达到15.63ug/mL时，病毒感染的鸡成纤维细胞活力出现上升，因而此研究表明提纯后的金针菇多糖对鸡成纤维细胞起到保护作用，即对新城疫病毒起到一定的抑制作用。

实施例4

金针菇多糖对鸡体内免疫功能及生长性能的影响

试验前，将60只小鸡随机分组，并对各组鸡称重，高浓度多糖组和低浓度多糖组的鸡自由采食、饮水，饲喂周期为30天，并做好养殖场卫生。

试验鸡在饲喂30日龄进行空腹称重。记录各组鸡的健康状况和采食量，并计算平均日采食量(ADFI)、平均体重(BW)、平均日增重(ADG)和料肉比(F/M)。

料肉比=消耗饲料总量(KG)/增重总量(KG)，测定增重一公斤所消耗的饲料量；免疫器官指数（%）=免疫器官重量（g）×100/活体重（g）。

记录30天小鸡采食饲料总重量，每组随机抽取20只鸡称重，并取其脾脏、胸腺、法氏囊，剔除脂肪后称鲜重。

表2 金针菇多糖饲料对鸡生长性能的影响(饲喂30天)

实验结果：由表2可知，30日龄时，与对照组相比，低浓度组和高浓度组平均体重分别升高了3.7%和7.73%；与对照组相比，低浓度组和高浓度组肉鸡的平均日采食量分别提高了2.68%和14.15%；与对照组相比，低浓度组和高浓度组平均日增重分别提高了2.53%和14.61%；与对照组相比，低浓度和高浓度平均料肉比分别提高了2.02%和4.55%。

表3 金针菇多糖饲料对鸡免疫器官指数影响单位：%

由表3可知，与对照组相比，肉鸡在30日龄时，100mg/kg和400mg/kg金针菇均能引起脾脏指数分别上升3.7%和7.73%，引起胸腺指数上升1.58%和3.76%，还能引起法氏囊指数上升4.29%和12.37%。

通过金针菇多糖对鸡体内免疫功能及生长性能的影响试验可以得出，与空白对照组相比，金针菇多糖可以明显提高肉鸡的体重、采食量、日增重和料肉比，同时还能促进肉鸡脾脏指数、胸腺指数和法氏囊指数上升，以上研究结果表明金针菇多糖可以在一定程度上提高肉鸡的免疫功能。