本发明涉及一种胆盐水解酶酶活提高的重组大肠杆菌，属于生物工程领域。
背景技术：
血清胆固醇浓度过高是引起冠心病等心血管疾病的重要因素，人和动物体内的初级胆盐主要是由胆固醇在肝脏中合成，在碳24位置将甾核和一个甘氨酸或者牛磺酸通过酰胺键连接。结合胆盐存储在胆囊中，通过胆管分泌到小肠，这种结合胆盐本能的捕捉膳食胆固醇和脂肪，使它们通过肠上皮细胞更容易的被吸收到血液中，同时大约95％的胆盐进入肝肠循环，650mg的胆盐可避免被肠上皮细胞吸收，因此，结合胆盐大量存在于胃肠道中。研究表明，一些益生菌可以通过产生胆盐水解酶(bile salt hydrolase，BSH)，分解牛磺酸或甘氨酸结合的胆盐形成游离氨基酸和游离胆酸，这些益生菌通过这种作用来降低结合胆盐对自身的毒害作用。
胆盐水解酶(BSH)是由bsh基因编码的一种胞内酶，广泛存在于肠道微生物中，是降解胆汁的主要组成成份——共轭胆酸第一步所需的酶。胆酸盐水解酶可将共轭胆酸水解成牛磺酸或甘氨酸和游离胆酸，后者可由其它肠道微生物在肠道内作进一步降解。胆酸盐水解酶的生理作用体现在两个方面：一、影响宿主的脂肪代谢过程，减少脂肪的消化吸收和降低胆固醇水平等；二、胆汁的降解减少了胆汁对肠道微生物的毒性，改善了微生物生存的肠道环境；由降解产生的氨基酸和游离脂肪酸还可为微生物提供营养物质。
由于胆盐水解酶通常来源于乳酸菌等微生物中，其生长环境和发酵强度不适合大规模工业化生产。另一方面，目前报道的多数胆盐水解酶表达量低，易形成包涵体。因此，筛选一种能够酶活较高并能高效表达的胆盐水解酶基因对于工业化生产胆盐水解酶，及运用胆盐水解酶调节生物机体健康状况具有重要意义。
技术实现要素：
为了克服上述问题，本发明的第一个目的是提供一种酶活提高的胆盐水解酶基因，所述基因序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明的第二个目的是提供表达所述胆盐水解酶基因的细胞系。
本发明的第三个目的是提供一种重组大肠杆菌，所述重组大肠杆菌是以pET-28a(+)为载体，以大肠杆菌BL21(DE3)为宿主，表达SEQ ID NO.1所示基因。
本发明的第四个目的是提供一种酶活提高的重组大肠杆菌的构建方法。
在本发明的一种实施方式中，所述方法是将含有编码所述胆盐水解酶突变体的基因与表达载体连接后转化至大肠杆菌中。
在本发明的一种实施方式中，所述重组大肠杆菌是pET-28b(+)为载体、以E.coli BL21(DE3)为宿主表达SEQ ID NO.1所示基因。
本发明的第五个目的是提供一种生产胆盐水解酶的方法，是将所述重组大肠杆菌接种至TB培养基中，37℃培养12～52h.
在本发明的一种实施方式中，所述接种量按体积比为1％。
在本发明的一种实施方式中，所述菌体至OD600为0.8～1.0时，加入IPTG诱导28～36h。
在本发明的一种实施方式中，所述IPTG浓度为0.1～0.15mol/L。
在本发明的一种实施方式中，所述方法还将诱导培养后的发酵液离心，收集菌体，并破壁纯化获得纯酶。
在本发明的一种实施方式中，所述破壁纯化是将发酵液6000～9000rpm离心，收集菌体后，用0.1M、pH 6～7的磷酸盐缓冲液洗涤菌体2～3次，超声破碎3～10min，离心收集上清液，经过镍柱亲和柱层析进行纯化。
本发明还提供所述胆盐水解酶基因在食品、保健品、医药配制品生产领域的应用。
本发明的有益效果：本发明筛选出一种双歧杆菌来源的高产胆盐水解酶的基因，在大肠杆菌实现了胆盐水解酶基因的异源表达。本发明提供的胆盐水解酶生产方法通过IPTG诱导，使胆盐水解酶的相对酶活提高至123.2％，与对照相比提高了23.2％，诱导32h酶活提高了21.6％，且该方法操作简单，具备工业应用的潜力。
附图说明
图1为不同IPTG诱导时间下重组菌胞内酶活。
具体实施方式
LB培养基：胰蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、NaCl 10g/L，pH 7.0；
TB培养基：蛋白胨12g/L，酵母膏24g/L，甘油8g/L，17mmol/L KH2PO4，72mmol/L K2HPO4。
胆盐水解酶活性鉴定方法：滴加5μL受体菌菌液至别含有0.01％猪胆盐(w/v)的LB固体平板(含100μg/mL氨苄青霉素和24μg/mL IPTG)上，通过能否产生白色或透明沉淀圈检验胆盐水解酶的活性。
胆盐水解酶酶活测定方法：取10μL酶液用0.1M磷酸盐缓冲液(pH 6.0)稀释至90μL，加入10μL结合胆盐(200mM)混合，于37℃孵育30min，加入等体积的15％(w/v)三氯乙酸终止反应，离心后取10μL上清液与190μL茚三酮试剂混合，于100℃反应15min，冷却后于570nm处测定吸光值，根据甘氨酸标准曲线进行计算。其中，茚三酮试剂的组成为：0.5mL 1％(w/v)茚三酮(溶解于0.5M、pH5.5柠檬酸盐缓冲液)，1.2mL甘油，0.2mL 0.5M、pH5.5的柠檬酸缓冲液。
具体实施方式中选用牛磺脱氧结合胆盐测定酶活。
实施例1重组大肠杆菌的构建
以质粒pET-28a(+)为载体，合成双歧杆菌ATCC 27673胆盐水解酶基因(NCBI登录号为CP007522.1)构建重组质粒pET-28a(+)-bsh，转化至E.coil JM109的感受态细胞，挑取阳性菌落。37℃摇床过夜培养后提取质粒，经测序验证，将测序正确的质粒pET-28a(+)-bsh转化至大肠杆菌E.coil BL21(DE3)，获得重组大肠杆菌E.coil BL21(DE3)pET-28a(+)-bsh。
实施例2胆盐水解酶基因的筛选
(1)以双歧杆菌ATCC 27672(购自ATCC)为出发菌株，接种至含0.5％(质量分数)半胱氨酸的MRS培养基中，37℃厌氧培养至对数期，取10μL的菌悬液滴加在灭菌冷却后的载玻片上，用ARTP诱变育种仪(思清源生物科技)进行等离子诱变，诱变时间分别为0s、5s、10s、15s、20s、40s、60s。
(2)将诱变后的菌悬液转移至装有1mL生理盐水的无菌管中，然后将样品稀释至10-1～10-3三个浓度，取稀释液涂布于筛选培养基(含0.1g/L猪胆盐的LB固体平板)中，置于37℃恒温培养箱中厌氧培养24～48h，每个处理重复三次。
(3)按透明圈从大至小的顺序挑取具有透明圈的单菌落接种至含有0.5％半胱氨酸的MRS培养基的96孔板中，37℃恒温培养箱中厌氧培养24～48h，离心，收集菌体，用生理盐水洗涤并稀释至相同OD值，测定全细胞酶活。
(4)挑取酶活最高的菌株(命名为双歧杆菌BH06)按步骤(3)的方法培养，离心收集菌体，提取基因组。以Genbank登录号530821.1的bsh基因为模板设计引物，扩增双歧杆菌BH06的bsh基因，凝胶核酸电泳验证并测序，获得如SEQ ID NO.1所示基因。
实施例3重组大肠杆菌的构建
以质粒pET-28a(+)为载体，构建重组质粒pET-28a(+)-bsh06，转化至E.coil JM109的感受态细胞，挑取阳性菌落。37℃摇床过夜培养后提取质粒，经测序验证，将测序正确的质粒pET-28a(+)-bsh06转化至大肠杆菌E.coil BL21(DE3)，获得重组大肠杆菌E.coil BL21(DE3)pET-28a(+)-bsh06。
实施例3重组菌中酶蛋白的诱导表达及酶活测定
(1)将表达胆盐水解酶的重组大肠杆菌E.coil BL21(DE3)pET-28a(+)-bsh和E.coil BL21(DE3)pET-28a(+)-bsh06挑选单菌落分别接种到LB液体培养基中，37℃，200rpm下培养12h，转接到TB培养基中，接种量为1％，于37℃、200rpm条件下培养至菌体长到OD600为0.8时，加入IPTG诱导，IPTG浓度为0.1M，并将培养温度降到20℃，培养24h。按照胆盐水解酶活性鉴定方法，检测到受体菌在含有0.01％猪胆盐(w/v)的LB固体平板均出现透明的沉淀圈，表明受体菌表达的胆盐水解酶突变体有活性。
(2)以E.coil BL21(DE3)pET-28a(+)-bsh为对照，将两个重组菌分别挑选单菌落接种到LB液体培养基中，37℃，200rpm下培养12h，转接到TB培养基中，接种量为1％，于37℃、200rpm条件下培养至菌体长到OD600为0.8时，加入IPTG诱导，IPTG浓度为0.15M，并将培养温度降到20℃，培养24h。将发酵液6000～9000rpm离心，用0.1M、pH 6～7的磷酸盐缓冲液洗涤菌体2～3次，并超声破碎5min，离心收集上清液测定胞内酶活。结果显示，对照菌株胞内酶活112.29U/mL，重组菌E.coil BL21(DE3)pET-28a(+)-bsh06胆盐水解酶的胞内酶活提高了14.6％。
实施例4不同诱导时间对酶活的影响
将表达胆盐水解酶的重组大肠杆菌E.coil BL21(DE3)pET-28a(+)-bsh06挑选单菌落接种到LB液体培养基中，37℃，200rpm下培养12h，转接到TB培养基中，接种量为1％，于37℃、200rpm条件下培养至菌体长到OD600为0.8时，加入IPTG诱导，IPTG浓度为0.1M，并将培养温度降到20℃，诱导16～36h。以实施例3测得的E.coil BL21(DE3)pET-28a(+)-bsh酶活为对照，测定不同诱导时间下E.coil BL21(DE3)pET-28a(+)-bsh06胞内的相对酶活，结果如图1所示。在0.1M IPTG诱导下，酶活提高了10.3％以上，其中诱导28h后相对酶活为123.2％，与对照相比提高了23.2％，诱导32h酶活提高了21.6％。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 曹书华
<120> 一种胆盐水解酶酶活提高的重组大肠杆菌
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
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<212> DNA
<213> 人工序列
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