一种动物饲料生产用乳酸菌培养基及其制备和应用的制作方法

本发明涉及微生物
技术领域：
，具体涉及一种动物饲料生产用乳酸菌培养基及其制备和应用。
背景技术：
：以乳酸菌作为益生菌已广泛使用于养殖业中。由于乳酸菌在代谢过程中会产生乙酸、乳酸等酸性物质，使ph降低，可调节肠道酸碱环境，促进饲料的消化吸收，同时乳酸菌在代谢过程中也会产生一些抗菌肽、细菌素、生长因子等物质，这些产物可在一定程度上抑制有害菌的生长，提高动物体的免疫力。目前水产养殖业多用乳酸菌治疗白便等水产生物常见肠道疾病；同时乳酸菌在畜禽上也大量使用，特别是断奶仔猪教槽料的发酵上。现阶段乳酸菌发酵培养基多用mrs培养基，其中碳源和氮源的价格较为昂贵，为在大量生产过程中降低成本，目前已有一些专利采用了豆粕、鱼粉、中药粉等物质来提高乳酸菌的活菌数，效果也确实得到了一定改善。然而现有技术手段在成本控制上还不具备优势，且无法满足保持或促进乳酸菌生长及其对病原菌的抑制作用。技术实现要素：鉴于此，有必要针对上述问题，提供一种在降低饲用乳酸菌培养基原料成本的同时，能有效保持或促进乳酸菌生长及其对病原菌的抑制作用，从而有利于推广至大规模生产及应用的动物饲料生产用乳酸菌培养基及其制备和应用。为实现上述目的，本发明采取以下技术方案：本发明的动物饲料生产用乳酸菌培养基，其配方为：玉米粉25-35g/l、豆粕55-65g/l、糖蜜10-18g/l、果糖10-18g/l、k2hpo4·3h2o0-2g/l、乙酸钠4-7g/l、柠檬酸二铵0-3g/l、mgso4·7h2o0-0.5g/l、mnso4·h2o0.2-0.5g/l、吐温-801-2ml/l、抗坏血酸0.5-3g/l，以水配制，乳酸菌培养基的ph值控制在6.8-7.2。作为优选的，动物饲料生产用乳酸菌培养基，其配方为：玉米粉30g/l、豆粕60g/l、糖蜜15g/l、果糖15g/l、k2hpo4·3h2o2g/l、乙酸钠5g/l、柠檬酸二铵2g/l、mgso4·7h2o0.5g/l、mnso4·h2o0.5g/l、吐温-801ml/l、抗坏血酸1g/l，以水配制。作为优选的，配方中组分：玉米粉30g/l、豆粕60g/l、糖蜜15g/l、果糖15g/l。作为优选的，豆粕的蛋白含量大于38％，玉米粉的碳水化合物含量不低于40％。上述乳酸菌培养基的制备，步骤如下：1)称取豆粕，加10-12倍蒸馏水，打成浆，用六层纱布过滤，滤液待用；2)称取玉米粉，加9-11倍蒸馏水，煮沸至粘稠，用六层纱布过滤，放凉，滤液待用；3)称取l-抗坏血酸，溶于适量蒸馏水中，过滤除菌，滤液待用；4)分别称取糖蜜、果糖、k2hpo4·3h2o、乙酸钠、柠檬酸二铵、mgso4·7h2o、mnso4·h2o、吐温-80，溶于适量蒸馏水中，加入1)、2)中的溶液，加适量蒸馏水，混匀，灭菌；5)将4)中溶液灭菌后，冷却至50℃或以下，加入3)所得滤液，混匀。采用上述培养基培养乳酸菌的方法，具体为：取乳酸菌于mrs平板进行三区划线，培养活化；在平板上挑取单菌落接种于mrs培养基中培养后，以1-2％的接种量接种于mrs培养基中培养后，再以2-5％的接种量接种于本发明的培养基中培养。本发明的有益效果为：本发明的培养基采用玉米粉和豆粕作为培养基氮源，并对培养基的碳源组分进行了优化，可以在降低培养基原料成本的同时，保持或提高乳酸菌的活菌数，并且对于水产养殖常见致病菌(如副溶血弧菌)的抑制效果也起到了促进作用。附图说明图1为实施例1的培养基培养乳酸菌的抑菌效果图，图中“新培养基”为本实施例的培养基；图2为实施例2的培养基培养乳酸菌的抑菌效果图，图中“新培养基”为本实施例的培养基；图3为实施例3的培养基培养乳酸菌的抑菌效果图，图中“新培养基”为本实施例的培养基；图4为实施例4的培养基培养乳酸菌的抑菌效果图，图中“新培养基”为本实施例的培养基。具体实施方式为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案作进一步清楚、完整地描述。需要说明的是，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。实施例1上述的乳酸菌发酵培养基的制备，步骤如下：1)取60g豆粕，加500ml蒸馏水，打成浆，用六层纱布过滤，滤液待用；2)取30g玉米粉，加300ml蒸馏水，煮沸至粘稠(大约20min)，用六层纱布过滤，放凉，滤液待用；3)称取l-抗坏血酸1g，溶于10ml蒸馏水中，过滤除菌，滤液待用；4)称取糖蜜15g、果糖15g、k2hpo4·3h2o2g、乙酸钠5g、柠檬酸二铵2g、mgso4·7h2o0.5g、mnso4·h2o0.5g、吐温-801ml，溶于200ml蒸馏水中，加入1)、2)所得滤液，加入蒸馏水定容至990ml，混匀，121℃灭菌15分钟；5)将4)中溶液灭菌后，冷却至50℃，加入3)所得滤液，混匀。采用上述培养基进行乳酸菌培养及测试，具体为：1.1本实验受试菌株：唾液乳杆菌、植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、粪肠球菌。主要来源：本实验室从水产动物肠道内分离获得的菌种，并于自有实验室-80℃的甘油管保藏。1.2本实验所用指示菌：副溶血弧菌atcc17802。主要来源：购买于环凯试剂公司。1.3实验方案：先将上述四株乳酸菌用mrs培养基进行三区划线活化，37℃培养24h；然后挑取单菌落于mrs培养基2mlep管中，37℃培养18h；再以2％的接种量接于mrs培养基(100ml离心管)，37℃培养18h；最后以3％的接种量接种于本实施例制备得的培养基中，37℃培养，不同时间点进行取样，测定抑菌效果，并测定48h活菌数。1.4实验结果：a.48h唾液乳杆菌、植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、粪肠球菌活菌数分别为(单位cfu/ml，下同)：4.10×109、4.5×109、4.7×109、4.3×109，如表1所示；b.抑菌效果见图1所示。实施例21)本实施例的培养基配方如下：玉米粉27g/l、豆粕55g/l、糖蜜12g/l、果糖12g/l、k2hpo4·3h2o2g/l、乙酸钠5g/l、柠檬酸二铵2g/l、mgso4·7h2o0.5g/l、mnso4·h2o0.5g/l、吐温-801ml/l、抗坏血酸1g/l，以水配制。配制方法与实施例1相同。1.1本实验受试菌株：与实施例1相同。1.2本实验所用指示菌：与实施例1相同。1.3实验方案：本实施例与实施例1的区别在于：最后以3％的接种量接种于本实施例制备所得的培养基中，37℃培养，不同时间点进行取样，测定抑菌效果，并测定48h活菌数。1.4实验结果：a.48h唾液乳杆菌、植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、粪肠球菌活菌数分别为：4.35×109、4.7×109、4.5×109、4.3×109，如表1所示；b.抑菌效果见图2所示。实施例3本实施例的培养基配方如下：玉米粉35g/l、豆粕65g/l、糖蜜18g/l、果糖18g/l、k2hpo4·3h2o2g/l、乙酸钠5g/l、柠檬酸二铵2g/l、mgso4·7h2o0.5g/l、mnso4·h2o0.5g/l、吐温-801ml/l、抗坏血酸1g/l，以水配制。配制方法与实施例1相同。1.1本实验受试菌株：与实施例1相同。1.2本实验所用指示菌：与实施例1相同。1.3实验方案：本实施例与实施例1的区别在于：最后以3％的接种量接种于本实施例制备得到的培养基中，37℃培养，不同时间点进行取样，测定抑菌效果，并测定48h活菌数。1.4实验结果：a.48h唾液乳杆菌、植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、粪肠球菌活菌数分别为：4.2×109、4.8×109、4.9×109、4.4×109，如表1所示；b.抑菌效果见图3所示。实施例4本实施例的培养基配方如下：胰蛋白胨10.0g、牛肉膏10.0g、酵母提取物5.0g、糖蜜15g/l、果糖15g/l、k2hpo4·3h2o2g/l、乙酸钠5g/l、柠檬酸二铵2g/l、mgso4·7h2o0.5g/l、mnso4·h2o0.5g/l、吐温-801ml/l，以水按常规配制。1.1本实验受试菌株：与实施例1相同。1.2本实验所用指示菌：与实施例1相同。1.3实验方案：本实施例与实施例1的区别在于：最后以3％的接种量接种于本实施例制备得到的培养基中，37℃培养，不同时间点进行取样，测定抑菌效果，并测定48h活菌数。1.4实验结果：a.48h唾液乳杆菌、植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、粪肠球菌活菌数分别为：3.6×109、3.5×109、4.2×109、4.0×109，如表1所示；b.抑菌效果见图4所示.对照例1对照例为常用的mrs培养基，具体配方如下：胰蛋白胨10.0g，牛肉膏10.0g，酵母提取物5.0g，葡萄糖20.0g、k2hpo4·3h2o2g/l、乙酸钠5g/l、柠檬酸二铵2g/l、mgso4·7h2o0.5g/l、mnso4·h2o0.5g/l、吐温-801ml/l，以水配制。1.1本实验受试菌株：与实施例1相同。1.2本实验所用指示菌：与实施例1相同。1.3实验方案：本实施例与实施例1的区别在于：最后以3％的接种量接种于本实施例制备得到的培养基中，37℃培养，不同时间点进行取样，测定抑菌效果，并测定48h活菌数。1.4实验结果：a.48h唾液乳杆菌、植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、粪肠球菌活菌数分别为：3.3×109、3.2×109、3.9×109、3.6×109，如表1所示；b.抑菌效果见图1-图4中的mrs曲线。表1各实施例48h乳酸菌活菌数(cfu/ml)唾液乳杆菌植物乳杆菌鼠李糖乳杆菌粪肠球菌实施例14.10×1094.5×1094.7×1094.3×109实施例24.35×1094.7×1094.5×1094.3×109实施例34.2×1094.8×1094.9×1094.4×109实施例43.6×1093.5×1094.2×1094.0×109对照例13.3×1093.2×1093.9×1093.6×109由表1中可以看出，本发明的实施例1-3配方在测试中，48h活菌数均高于采用对照例1的mrs培养基培养。实施例4中，当使用胰蛋白胨10.0g、牛肉膏10.0g、酵母提取物5.0g替代玉米粉和豆粕，并且不添加抗环血酸下，与mrs培养基进行比较，只更改碳源，氮源不做任何调整，看其结果是否有所改变。测试结果实施例4的活菌数相比实施例1-3有所下降，但略好于采用对照例1中采用mrs培养基培养；从图1-图4可以看出本发明实施例1-4的抑菌效果均接近甚至高于对照例1中mrs培养基培养的抑菌效果。综上，在相同培养条件下，以玉米粉和豆粕为氮源，以果糖和糖蜜为碳源，不仅可以降低生产成本，还可以保持或提高多种乳酸菌的生长性能，以及保持或增加对副溶血弧菌的抑菌效果。以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。当前第1页1 2 3