一种同时检测柑橘黄化脉明病毒和衰退病毒的多重RT‑PCR方法及其应用与流程

本发明属于植物病理领域，具体涉及同时检测柑橘黄化脉明病毒和衰退病毒的多重RT-PCR方法及其应用。

背景技术：

柑橘黄化脉明病毒(Citrus yellow vein clearing virus，CYVCV)引起的柑橘黄脉病是我国新发生的一种病害，对柑橘产业尤其是柠檬产业构成严重威胁。CYVCV是由7529个核苷酸组成的正义单链RNA(+ssRNA)病毒，属于柑橘病毒属(Mandarivirus)的成员。CYVCV除了通过嫁接、摩擦接种传播以外，在菜豆(Phaseolus vulgaris)和豇豆(Vignaunguiculata)上还可通过绣线菊蚜(Aphis spiraecolaPatch)和豆蚜(A.CraccivoraKoch)进行传播。由柑橘衰退病毒(Citrus tristeza virus,CTV)引起的柑橘衰退病，是世界性的柑橘病毒病害，对全世界的柑橘产业造成严重经济损失。CTV是由19226～19296个核苷酸组成的正义单链RNA病毒，属于长线形病毒属(Closterovirus)，是目前已知植物病毒基因组中最大的病毒。CTV除了通过嫁接传播以外，在田间还可通过蚜虫如褐色橘蚜(Toxopteracitricida)、棉蚜(Aphid gossypii)和橘二叉蚜(T.aurantii)等以非循回型半持久方式进行传播。为了快速评价田间果树和苗木CYVCV和CTV的感病情况，亟需建立同时快速检测多种病毒的多重RT-PCR检测方法对于CYVCV和CTV的检测。有关CYVCV和CTV分别检测方法已有许多报道。采用指示植物鉴定法；电子显微镜检测法；使用酶联免疫吸附法(ELISA)检测，RT-PCR分子检测法等。多重RT-PCR技术具有灵敏、快速、经济等特点，广泛应用于植物病毒检测。CYVCV和CTV具有相似的传播途径，由于长期不规范的田间操作、苗木生产以及介体昆虫传播，导致这两种病毒广泛传播和流行，对柑橘产业造成严重的危害，田间常出现这两种病害混合侵染现象。而目前国内尚无CYVCV和CTV同时多重PCR检测方法的报道，因此建立一套同时检测这两种病毒的一步法多重RT-PCR检测体系，为评价这两种病毒在田间侵染情况以及在苗木脱毒过程中病毒的脱除情况，提供快速、简便、可靠的检测方法。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种同时检测大田CYVCV和CTV一步法多重RT-PCR方法，实现CYVCV和CTV同时、快速、灵敏检测，为提高CYVCV和CTV高效检测效率和及时有效防治赢取时间。

影响多重RT-PCR反应的因素很多，发明人综合考虑了引物浓度、Mg²⁺浓度、dNTP浓度、退火温度以及循环次数等变化的影响，首先对体系中Mg²+和dNTP的用量进行调整，增加Mg²⁺浓度，获得最适宜的扩增效果，提高了PCR反应的扩增效率，本体系采用Mg²⁺浓度为0.625 mmol/L和dNTP浓度为0.2～0.25 mmol/L。其次，本发明就影响一步法多重RT-PCR扩增的三对引物浓度进行了优化调整，为排除总RNA在提取中杂质和操作过程的影响，加入了高度保守的Ubiquitin序列作为内参基因，使此多重RT-PCR检测体系结果更真实可信。但UBQ引物在柑橘中特异性或其在引物间竞争扩增能力较弱，短片段的UBQ扩增效率比另外两个病毒的扩增效率低，UBQ的扩增片段较短且与引物二聚体接近，有时会导致UBQ扩增结果不易辨别，所以要协调三对引物在整个反应体系中的平衡关系，最后确定CYVCV引物浓度为0.15～0.2μmol/L，CTV引物浓度为0.1～0.13μmol/L，Ubiquitin引物浓度为0.5μmol/L。且多重PCR产物用琼脂糖凝胶电泳检测，不需要大型的检测仪器，常规实验操作方便，适合两种病毒在田间侵染情况的同时快速检测。

为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

同时检测柑橘黄化脉明病毒和衰退病毒的多重RT-PCR方法，提取待检叶片样品的总DNA为模板，以SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.6所示序列为引物进行多重RT-PCR扩增，其扩增产物用琼脂糖凝胶电泳判定结果，多重RT-PCR扩增的特定PCR反应程序为：50℃反转录30 min；94℃预变性4 min；94℃变性30 s，62℃～63℃退火50 s，72℃延伸1 min，35个循环；72℃10 min；10℃终止反应。

进一步，所述的引物对为：

SEQ ID NO.1 CYVCV F：TACCGCAGCTATCCATTTCC

SEQ ID NO.2 CYVCV R：GCAGAAATCCCGAACCACTA

SEQ ID NO.3 LD F：TCATTGCAAAGTGACGACGAC

SEQ ID NO.4 LD R：TGCCTGACATTGGTAACTACG

SEQ ID NO.5 UBQ F：GATCTTCGCCTTAACGTTGT

SEQ ID NO.6 UBQ R：GTTGATTTTTGCTGGGAAGC

多重PCR扩增总反应体系中，Mg²⁺浓度为0.625 mmol/L，dNTPs浓度为0.2～0.25 mmol/L，SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2引物浓度各为0.15～0.2μmol/L，SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4引物浓度各为0.1～0.13μmol/L，SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6引物浓度为0.5μmol/L。

多重RT-PCR检测方法在检测植物柑橘黄化脉明病毒和衰退病毒应用，其所述的植物种类为芸香科柑橘属植物。

进一步，所述的芸香科柑橘属植物为柚、甜橙、柠檬、沙柑、橘橙。

本发明的有益效果在于：本体系能同时从4ng/μL的样品总核酸中检测出CYVCV和CTV。与单一RT-PCR相比，操作简便、节约时间和成本，避免样品间的交叉污染导致假阳性，且能达到与单一PCR的灵敏度，可以同时准确的检测柑橘中CYVCV和CTV的侵染。并加入了高度保守的Ubiquitin序列作为内参基因，使此多重RT-PCR检测体系结果更真实可信。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：

图1为不同循环次数多重RT-PCR扩增结果；

图2为不同Mg²⁺和dNTPs用量组合多重RT-PCR扩增结果；

图3为不同退火温度多重RT-PCR扩增结果；

图4为CYVCV和CTV不同引物浓度多重RT-PCR扩增结果

图5为内参基因不同引物浓度多重RT-PCR扩增结果；

图6为2种柑橘病毒的多重RT-PCR检测结果；

图7为单一RT-PCR(A、B)和多重RT-PCR(C)灵敏度比较结果；

图8为多重RT-PCR对田间样品检测结果。

其中，图1中A为30个循环次数扩增结果；B为35个循环次数扩增结果；M：DL2 000分子量标准；1：健康甜橙；2：CYVCV+CTV混合甜橙；3：水对照；

图2中M:DL2 000分子量标准，1～7见表2；

图3中A为不同退火温度下健康对照扩增结果；B为不同退火温度下感病样品扩增结果；

M：DL2 000分子量标准，1-12分别为退火温度51.0、51.3、52.1、53.4、54.8、56.3、57.7、59.1、60.6、61.9、62.7和63℃；

图4中A为CTV不同引物浓度多重RT-PCR扩增结果1～3：CTV的引物浓度分别为0.1、0.13、0.15μmol/L；M：DL2 000分子量标准；B为CYVCV不同引物浓度多重RT-PCR扩增结果；1～3：CYVCV的的引物浓度分别为0.1、0.15、0.2μmol/L；M：DL2 000分子量标准；

图5中M：DL2 000分子量标准1，1～3：内参基因引物浓度分别为0.3μmol/L、0.4μmol/L、0.5μmol/L，4：水对照；

图6中M：DL2 000分子量标准1：CYVCV+CTV混合甜橙；2：CYVCV甜橙；3：CTV甜橙；4：健康甜橙；5：水对照；

图7中M：DL2 000分子量标准；H：健康对照；

图8中M：DL2 000分子量标准；1-11：田间样品；12：阳性对照13：水对照。

具体实施方式

下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。

实施例1

1.供试材料

感染CTV和CYVCV 2种病毒的供试材料为西蒙斯甜橙，由中国农业科学院柑桔研究所国家柑橘苗木脱毒中心提供。以此甜橙的叶片为阳性材料，以健康甜橙实生苗叶片为阴性对照材料。田间样品于2016年9月在重庆北碚随机采取叶片5-10片。

2.总核酸提取

用RNAiso Plus试剂盒(TaKaRa，日本)根据操作说明书提取甜橙叶片(直接从毒源或健康实生苗上收集或保存在-80℃冰箱)总核酸，40μL DEPC水溶解，并用分光光度计检测浓度和纯度，A280/A260比值范围为1.8～2.2，以所提取核酸作为一步法多重RT-PCR的模板。

3.一步法单一RT-PCR

CYVCV、CTV和内参基因的RT-PCR引物见表1。CYVCV一步法RT-PCR使用One Step RT-PCR Kit Ver.2试剂盒(TaKaRa，日本)参照Chen等^[20]的方法进行检测，CTV一步法RT-PCR经摸索可用相同方法进行扩增。PCR反应体系为10μL，含2×1Step Buffer 5μL，上、下游引物(表1)各0.2μL，PrimeScript 1Step Enzyme Mix 0.3μL，加入RNA模板1μL，最后加灭菌水补足10μL。PCR反应程序为：50℃反转录30min；94℃预变性2min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸45s，30个循环；72℃5min；12℃终止反应。

表1多重和单一RT-PCR引物

实施例2

一步法多重RT-PCR体系的建立

设计特异性引物，用One Step RT-PCR Kit Ver.2试剂盒(TaKaRa，日本)，就影响一步法多重RT-PCR扩增的CTV和CYVCV引物浓度进行了优化调整，通过比较3对引物不同浓度PCR产物的电泳结果确定最终适宜引物浓度。对PCR体系中另添加的Mg²⁺和dNTP最终浓度进行优化后，设定7种浓度组合(表2)，对PCR产物进行电泳确定最佳组合。根据3对引物的Tm值，通过梯度PCR仪(BiometraTgradient)对退火温度设置梯度温差为12℃，共12个退火温度(T1-T12)：51.0、51.3、52.1、53.4、54.8、56.3、57.7、59.1、60.6、61.9、62.7和63℃，通过PCR产物电泳结果确定最适温度梯度。

1.PCR循环次数的优化

以阳性甜橙叶片抽提的总核酸为模板，总反应体系10ul包括：2×1Step Buffer 5μL，CYVCV引物各0.2μL，CTV引物各0.13μL，内参引物各0.3μL，PrimeScript 1Step Enzyme Mix 0.3μL，总核酸模板1μL，Mg²⁺和dNTPs各0.2μL，灭菌纯水加到总体积10μL。PCR反应条件为：50℃30min；94℃4min；94℃30s，55℃50s，72℃1min，35个循环或30个循环；72℃10min；10℃终止反应，观察多重RT-PCR体系在30和35个循环次数时目的条带的扩增情况，30个循环时，内参基因的条带不清晰(图1，A)，35个循环时，扩增出的2种病毒和内参基因的目的条带均清晰(图1，B)，因此初步确定PCR循环次数为35。

2.Mg²⁺和dNTPs浓度的优化

以阳性甜橙叶片抽提的总核酸为模板，总反应体系10ul包括：2×1Step Buffer 5μL，CYVCV引物各0.2μL，CTV引物各0.13μL，内参引物各0.3μL，PrimeScript 1Step Enzyme Mix 0.3μL，总核酸模板1μL，Mg²⁺和dNTPs浓度为表2共7组组合，灭菌纯水加到总体积10μL。PCR反应条件为：50℃30min；94℃4min；94℃30s，55℃50s，72℃1min，35个循环或30个循环；72℃10min；10℃终止反应。

通过比较不同Mg²⁺和dNTPs浓度的共7组组合时的一步法多重RT-PCR反应的琼脂糖电泳结果(图2)，如图CYVCV、CTV和UBQ的特异性片段大小分别为614bp、373bp、194bp，7个组合都可以扩增出目的条带，根据目的条带的亮度，确定10μL体系中另需添加Mg²⁺和dNTPs的最佳组合浓度为0.625mmol/L和0.2mmol/L或0.625mmol/L和0.25mmol/L

表2一步法多重PCR体系中Mg²⁺和dNTPs的用量组合

3.退火温度的优化

以上述最佳的各组分用量和PCR循环次数，退火温度从51～63℃进行一步法多重温度梯度RT-PCR(图3)。观察比较健康对照和感病甜橙样品的总核酸在不同温度下的多重RT-PCR扩增结果，可以看出退火温度为51℃、54.8℃和56.3℃时，感病样品可同时扩增出3个清晰分明的特异性目的条带(图3，A)，但健康对照中非特异性扩增明显(图3，B)；退火温度为62.7℃时，虽然阳性样品中内参基因的目的条带较弱(图3，A)，但健康对照中无非特异性扩增且无拖尾现象(图3，B)，可以初步确定退火温度最佳范围是62～63℃。

4.引物浓度的优化

(1)CYVCV和CTV引物浓度

最初就影响一步法多重RT-PCR扩增的CTV和CYVCV引物浓度进行了优化调整，PCR反应条件为：50℃30min；94℃4min；94℃30s，55℃50s，72℃1min，35个循环,72℃10min；10℃终止反应。多重RT-PCR反应体系中CYVCV引物浓度为0.1μmol/L，Ubiquitin引物浓度为0.3μmol/L，CTV引物浓度从0.1μmol/L增加到0.15μmol/L，CTV的目的条带增亮，扩增效率增加，而CYVCV的扩增效率有所下降，CYVCV的目的条带变弱(图4A)。多重RT-PCR反应体系中CTV引物浓度为0.13μmol/L，Ubiquitin引物浓度为0.3μmol/L CYVCV引物浓度从0.1μmol/L增加到0.2μmol/L，CYVCV的目的条带逐渐增亮，扩增效率提高，而CTV的目的条带亮度变化不明显(图4B)。初步确定CYVCV引物浓度为0.15～0.2μmol/L，CTV引物浓度为0.1～0.13μmol/L，Ubiquitin引物浓度为0.3μmol/L。

(2)内参引物浓度

经过退火温度优化后，退火温度最佳范围62～63℃时，阳性样品中内参基因的目的条带较弱，进一步调整内参引物浓度，多重RT-PCR体系中CYVCV引物各0.2μL，CTV引物各0.13μL，Ubiquitin引物浓度分别为0.3、0.4和0.5μmol/L，在退火温度为63℃50s进行PCR反应。UBQ浓度为0.3μmol/L和0.4μmol/L时，内参基因的条带不清晰(图5)，UBQ浓度为0.5μmol/L时，扩增出的2种病毒和内参基因的目的条带均清晰(图5)，因此最终确定UBQ浓度为0.5μmol/L。

根据上述试验结果，最终确定感染CYVCV和CTV 2种病毒病的柑桔样品的一步法多重RT-PCR反应体系和一步法多重RT-PCR反应程序。一步法多重RT-PCR体系(10μL)为：2×1Step Buffer 5μL，25mmol/L的Mg²⁺0.25μL，10mmol/L的dNTPs 0.2～0.25μL，CYVCV引物0.15～0.2μL，CTV引物0.1～0.13μL，内参引物0.5μL，PrimeScript 1Step Enzyme Mix 0.3μL，总核酸模板1μL，用灭菌纯水将体积补至10μL。一步法多重RT-PCR反应程序为：50℃30min；94℃4min；94℃30s，62～63℃50s，72℃1min，35个循环；72℃10min；10℃终止反应。利用建立的多重体系对感病样品和健康样品进行一步法多重RT-PCR扩增，扩增结果显示2种病毒和内参基因的目的条带均清晰，这说明建立的一步法多重RT-PCR检测体系扩增效果较好(图6)。

实施例3

1.一步法单一和多重RT-PCR检测灵敏度比较结果

检测灵敏度测试结果表明，一步法单一RT-PCR体系对复合感染2种病毒的阳性样品能够检测出CYVCV的总核酸最大稀释倍数为10^-2倍(图7，A)，能够检测出CTV的总核酸最大稀释倍数为10^-2倍(图7，B)。一步法多重RT-PCR体系能够检测出CYVCV和CTV的总核酸最大稀释倍数为10^-2倍(图7，C)，达到单一RT-PCR体系的检测灵敏度。该一步法多重RT-PCR方法最低能从4ng/μL总核酸中检测出CYVCV和CTV，其灵敏度与单一RT-PCR检测灵敏度一致。

2.一步法多重RT-PCR产物克隆测序

多重RT-PCR扩增获得的DNA片段经电泳、分别切胶回收，克隆到T载体上，经公司测序后，序列用NCBI Blast进行同源性搜索比对。结果显示，CYVCV的特异片段与已提交的中国湖南分离物(KT124646)和中国重庆分离物(KP313240)同源性达到99％，与其他分离物同源性均在95％以上。CTV特异片段与中国分离物(FJ998200)和两个意大利分离物(KJ790175和KC748392)同源性均高达99％，与美国分离物(DQ363901)同源性为97％，与其他分类物同源性均96％以上。CYVCV和CTV的扩增片段与NCBI中登录的序列具有较高的同源性，表明扩增获得的DNA片段是目的条带。

3.一步法多重RT-PCR检测体系的实际运用

应用优化后建立的一步法多重RT-PCR检测体系对33个柑橘田间样品进行检测(图8)，快速评价这2种病毒在田间的侵染情况，结果表明(表3)，33个田间样品中，CYVCV感染率为54.5％，CTV感染率为66.7％，复合侵染的样品高达36.4％；CYVCV和CTV复合侵染的样品主要集中在甜橙和温州蜜柑中。对相应样品进行一步法RT-PCR检测，其结果与多重RT-PCR检测结果一致。

表3 33份田间不同柑橘样品的一步法多重RT-PCR检测

最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 西南大学

<120> 一种同时检测柑橘黄化脉明病毒和衰退病毒的多重RT-PCR方法及其应用

<130>

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<170> PatentIn version 3.3

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<212> DNA

<213> 人工序列

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taccgcagct atccatttcc 20

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<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

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gcagaaatcc cgaaccacta 20

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<212> DNA

<213> 人工序列

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tcattgcaaa gtgacgacga c 21

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<212> DNA

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tgcctgacat tggtaactac g 21

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<212> DNA

<213> 人工序列

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gatcttcgcc ttaacgttgt 20

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<211> 20

<212> DNA

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gttgattttt gctgggaagc 20