利用CRISPR‑CAS9技术对水稻BADH2基因定点突变的方法与流程
本发明涉及植物转基因技术领域和作物遗传育种领域，具体地说，涉及一种利用CRISPR-CAS9技术对水稻BADH2基因定点突变的方法。
背景技术：
香稻作为水稻家族中的特殊成员,其栽培历史相当悠久,世界上各水稻生产国或地区几乎都有香稻种植。香味是优质稻米重要特征，香稻育种已成为水稻遗传育种的重要内容之一。Bradbury等(2005)发现在香米和普通米之间一个存在序列差异的基因—BADH2，这一基因编码甜菜碱乙醛脱氢酶(betaine aldehyde dehydrogenase)，推测可能与米香的合成有关。Chen等(2008)对通过转基因互补实验证明了BADH2基因控制米香，香米品种BADH2基因的第二个或第七个外显子存在天然突变，没有全长的BADH2转录本，2AP(2-acetyl-1-pyrroline，水稻香米芳香成分之一)大量积累；而只有在普通稻米中存在全长的BADH2转录本，其中2AP含量极低。通过在香米品种中转入全长BADH2基因，其2AP含量显著降低，香气丢失。证明BADH2是控制米香的主效基因。
目前，香米品种的培育多是利用杂交方式将香米基因转入普通稻米中，尽管可以借助分子标记进行辅助选择，但这个过程复杂周期较长。以ZFN(zinc-finger nucleases)和TALEN(transcription activator-like effector nucleases)为代表的序列特异性核酸酶技术能够实现定点基因组编辑。在水稻中已实现利用TALEN技术敲除BADH2使水稻获得香味。但TALEN技术模块组装过程繁琐，需要大量测序工作，成本较高且具有细胞毒性。ZFN技术设计上依赖于上下游序列，脱靶率高，同样具有细胞毒性。
CRISPR/Cas技术摆脱了合成并组装具有特异性DNA识别能力蛋白模块的繁琐操作，其gRNA的设计和合成工作量远远小于TALEN和ZFN技术的DNA识别模块的构建过程，且毒性远远低于ZFN技术，有着靶向精确、脱靶率低、细胞毒性低、廉价简便等优点。CRISPR/Cas9技术自问世以来，就有着其它基因编辑技术无可比拟的优势，技术不断改进后，更被认为能够在活细胞中最有效、最便捷地“编辑”任何基因。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种利用CRISPR-CAS9技术对水稻BADH2基因定点突变的方法。
为了实现本发明目的，本发明提供的利用CRISPR-CAS9技术对水稻BADH2基因定点突变的方法，针对水稻BADH2基因设计基于CRISPR/Cas9的sgRNA序列，将含有编码所述sgRNA序列的DNA片段连接到携带CRISPR/Cas的载体中，转化水稻，实现对水稻BADH2基因的定点突变。
其中，sgRNA作用位点的核苷酸序列为5’-GAGTGGCGCGCCCCCGCGCT-3’。(SEQ ID NO:1)
前述的方法，构建载体pHZ1-CAS9-gRNA-BADH2，采用农杆菌介导法转化水稻，筛选阳性转基因植株。
所述载体pHZ1-CAS9-gRNA-BADH2的构建方法如下：
1)OsU6-BADH2-gRNA-polyT片段的构建
第一轮PCR以Cris-GL3质粒(由中国科学院遗传与发育生物学研究所徐冉博士惠赠)为模板，用引物CRI-F1和SQ3-R1扩增OsU6启动子与BADH2基因的20bp靶序列，片段大小329bp；同样以Cris-GL3质粒为模板，用引物SQ3-F2和CRI-R2扩增BADH2基因的20bp靶序列与gRNA-polyT，片段大小180bp；第二轮PCR是以第一轮PCR产物为模板，用引物CRI-F1和CRI-R2扩增即得OsU6-BADH2-gRNA-polyT片段，片段大小489bp，序列如SEQ ID NO:2所示；
2)载体pHZ1-CAS9-gRNA-BADH2的构建
将OsU6-BADH2-gRNA-polyT片段与经Hind III酶切后的PMDC99-Cas9载体分别进行琼脂糖凝胶电泳，切胶回收后进行无缝克隆，基于同源重组的原理，OsU6-BADH2-gRNA-polyT片段通过Infusion的方法融合到PMDC99-CAS9载体的Hind III位点，即构建得到pHZ1-CAS9-gRNA-BADH2载体。
其中，步骤1)中使用的引物序列如下：
CRI-F1：5’-CGACGGCCAGTGCCAAGCTTCTCGGATCCACTAGTAACGGC-3’
SQ3-R1：5’-AGCGCGGGGGCGCGCCACTCACACAAGCGACAGCGCGCGGG-3’
SQ3-F2：5’-GAGTGGCGCGCCCCCGCGCTGTTTTAGAGCTAGAAATAGCA-3’
CRI-R2:5’-ACCTGCAGGCATGCAAGCTTCGACCTCGAGCGGCCGCCAGT-3’
本发明的pHZ1-CAS9-gRNA-BADH2载体的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。
本发明还提供所述方法在水稻BADH2基因定点突变育种中的应用。
包括以下步骤：
(1)水稻‘日本晴’成熟胚诱导愈伤组织；
(2)将诱导的愈伤组织浸入携带pHZ1-CAS9-gRNA-BADH2载体的农杆菌菌液中侵染；优选使用农杆菌菌株为EHA105；
(3)将愈伤组织移至共培养培养基上培养，洗去农杆菌后移至预筛选培养基上培养，再移至筛选培养基上进行抗性愈伤组织筛选；
(4)将抗性愈伤组织移至再生培养上培养，形成再生幼苗；
(5)再生幼苗在生根培养基上生根后炼苗、移栽，得到转基因水稻；
(6)根据sgRNA作用位点的核苷酸序列设计引物，通过PCR法鉴定水稻植株突变位点。
前述应用中，步骤(1)具体为：成熟种子脱粒后去壳，用75％酒精洗2分钟，再浸入次氯酸钠溶液(活性氯5.5％)中，在摇床上摇30min，水洗5次，种子处理后置于NBi培养基中用于诱导愈伤，26℃光照14h/暗10h培养15-20天；剥取愈伤组织，移至新的NBi培养基上，26℃暗培养4天后用于侵染。
所述携带pHZ1-CAS9-gRNA-BADH2载体的农杆菌菌液的制备方法如下：从-80℃冰箱中取农杆菌感受态在冰上解冻，加入3-5μL质粒pHZ1-CAS9-gRNA-BADH2混匀，冰置30min，放入液氮中1min，然后37℃水浴锅中热激1min，在无菌操作台中对应加入1mL YEP培养基，28℃摇床上摇2-4h，取出，8000rpm/min离心1min，在无菌操作台中倒掉部分上清，用涂布器均匀地把剩下的悬浊液混匀涂在加有利福平和卡那霉素的YEP平板上，封口膜封口后放入28℃培养箱培养。2d后挑取单菌落，28℃摇菌24-36h后，进行菌落PCR，获得阳性菌落。
用移液枪从100mL农杆菌悬浮液(所述农杆菌悬浮液的配方按1L计为：20×N6母液50mL，100×EDTA-Fe母液10mL，100×B5微量元素母液10mL，100×B5维生素母液10mL，CEH 0.3g，肌醇2g，蔗糖30g，3’,5’-二甲氧基-4’-羟基苯乙酮100μM，pH 5.2～5.3)中吸取800μL冲洗农杆菌菌板三至四次，吸取菌液3～5滴到悬浮液中，稍有混浊即可(即菌液浓度达到OD600为0.3左右)，将愈伤组织用镊子夹入悬浮液中，计时15min，每隔三四分钟摇晃一次，使其充分接触。倒去菌液，将感染过的愈伤组织倒在无菌滤纸上，吸干其表面多余的菌液，10min后将愈伤移至NBco共培养基上，放至组培间26℃条件下，光照培养2～3d，直到愈伤组织周围看得见农杆菌长出。
将侵染过的愈伤放入灭菌的空三角瓶中，用无菌水冲洗数次，直到水变清澈为止，在100mL灭菌的无菌水中加入200μL头孢(cef，浓度0.25g/mL，终浓度500mg/L)，将愈伤用镊子夹入三角瓶，放于28℃摇床上摇15min，将装有头孢的水倒出，将愈伤拨到无菌滤纸上充分吹干，定期翻动愈伤，1-2小时后将愈伤放入NBps预筛选培养基上，26℃下暗培养7d。
将NBps预筛选培养基上的愈伤移到NBS筛选培养基上。1个月后，将长出的抗性愈伤依次编号置于再生培养基上，26℃下光照14h/暗10h培养3-4周左右。
待再生培养基中的抗性愈伤发育长出2-3厘米的小苗之后，即可用镊子轻轻夹出，放在灭过菌的空培养皿上，除去苗周围及根部的培养基和旧的愈伤，然后轻轻放入有3.5cm高的生根培养基的生根管中，每管中放一棵苗，编号与再生管编号一致。26℃下光照14h/黑暗10h培养3-4周，待小苗长出粗壮而发达的根系后即可开盖炼苗培养，定期向管中加水。小苗长至叶片直立且根系发达时，将小苗根部培养基洗净后继续放入生根管中并加入水，待小苗足够健壮后种于土中。
本发明中，所述共培养培养基的配方按2L计为：
20×N6母液100mL，100×EDTA-Fe母液20mL，100×B5微量元素母液20mL，100×B5维生素母液20mL，谷氨酰胺1g，脯氨酸1g，CEH 0.6g，肌醇0.2g，蔗糖60g，2,4-D 4mg，AS(即3’,5’-二甲氧基-4’-羟基苯乙酮)100μM，植物胶5.2g，pH 5.2～5.3。
所述预筛选培养基配方为：
含有500mg/L头孢霉素的NBi培养基，pH＝5.8。
所述筛选培养基的配方为：
含有终浓度为40mg/L的潮霉素和终浓度为500mg/L的头孢霉素的NBi培养基，pH 5.8。
所述再生培养的配方为：
不含2,4-D的NBi培养基，含有终浓度为3mg/L的6-BA、终浓度为0.5mg/L的NAA和终浓度为30mg/L的潮霉素，pH 5.8。
所述生根培养基的配方按2L计为：
20×MS大量元素母液50mL，100×EDTA-Fe母液10mL，100×MS微量元素母液10mL，100×B5维生素母液20mL，肌醇0.2g，葡萄糖14g，蔗糖6g，植物胶5.2g，潮霉素终浓度40mg/L，pH 5.8。
其中，所述NBi培养基的配方按2L计为：
20×N6母液100mL，100×EDTA-Fe母液20mL，100×B5微量元素母液20mL，100×B5维生素母液20mL，谷氨酰胺1g，脯氨酸1g，CEH 0.6g，肌醇0.2g，蔗糖60g，2,4-D 4mg，植物胶5.2g，pH 5.8。
所述20×N6母液的配方按1L计为：
KNO3：56.6g，(NH4)2SO4：9.26g，KH2PO4：8.00g，MgSO4·7H2O：3.70g，CaCl2·2H2O：3.32g。
所述100×EDTA-Fe母液的配方按1L计为：
FeSO4·7H2O 2.78g，Na2-EDTA 3.73g。
所述100×B5微量元素母液的配方按1L计为：
MnSO4·H2O 1.0g，ZnSO4·7H2O 0.2g，H3BO3 0.3g，CuSO4·5H2O 2.5mg，Na2MoO4·2H2O 25.0mg，CoCl2·6H2O 2.5mg，KI 75.0mg。
所述100×B5维生素母液的配方按500mL计为：
盐酸硫胺素VB1 500mg，盐酸吡哆醇VB6 50mg，烟酸VB5 50mg。
所述20×MS大量元素母液的配方按1L计为：
KNO3 38.0g，NH4NO3 33.0g，KH2PO4 3.4g，MgSO4·7H2O 7.4g，CaCl2·2H2O 8.8g。
所述100×MS微量元素母液的配方按1L计为：
MnSO4·H2O 1.56g，ZnSO4·7H2O 0.86g，H3BO3 0.62g，CuSO4·5H2O 2.5mg，Na2MoO4·2H2O 25.0mg，CoCl2·6H2O 2.5mg，KI 83.0mg。
前述应用中，步骤(6)选取靶位点上下游各200bp-400bp序列，设计引物，进行PCR扩增，扩增片段送测序，通过峰图判断靶位点是否发生突变。鉴定BADH2突变效果的引物序列如下，片段大小494bp。
JDSQ3F1：5’-ACCTATCGCTTTCCACCTCA-3’
JDSQ3R1：5’-CGGTTCCTCTTCAGCGCCTC-3’
本发明进一步提供用于水稻BADH2基因定点突变的CRISPR-CAS9载体，所述载体的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。
本发明通过CRISPR-CAS9技术对水稻内源基因BADH2进行编辑，获得了BADH2突变体，在创制香米种质资源上更为便捷高效。利用该方法成功实现了对水稻BADH2基因的定点突变，该方法具有实验周期短、操作简便等特点，为水稻改良育种提供了新方法，对于改良水稻性状具有重大实际意义。
附图说明
图1为本发明实施例1中OsU6-BADH2-gRNA-polyT片段的构建图。
图2为本发明实施例1中pHZ1-CAS9-gRNA-BADH2载体的双酶切电泳结果。
图3为本发明载体Cris-GL3的质粒图谱。
图4为本发明载体PMDC99-CAS9的质粒图谱。
图5为本发明载体pHZ1-CAS9-gRNA-BADH2的质粒图谱。
图6为本发明实施例2中转基因水稻BADH2基因敲除的PCR检测结果。
图7为本发明实施例2中转基因水稻植株FZCX3-1(A)和FZCX3-2(B)测序峰图。
图8为本发明实施例2中转基因水稻植株(T0代)FZCX3-1和FZCX3-2突变类型的预测结果。通过分析FZCX3-1、FZCX3-2植株测序峰图中的套峰情况，结合DSDecode预测结果，确认FZCX3-1、FZCX3-2植株中BADH2的突变类型都是一条链有4个碱基的缺失(缺失位置一致)，另一条链有5个碱基的突变(两个株系碱基突变位置不一致)。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular Cloning:a Laboratory Manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。
实施例1载体pHZ1-CAS9-gRNA-BADH2的构建
1、水稻BADH2(LOC_Os08g32870)基因中靶位点的选择
登录植物转录因子数据库(http://rice.plantbiology.msu.edu/analyses_search_locus.shtml)，查询水稻BADH2基因(LOC号：LOC_Os08g32870)的序列，设计基于CRISPR/Cas9的sgRNA序列。
sgRNA作用位点的核苷酸序列为5’-GAGTGGCGCGCCCCCGCGCT-3’。
2、载体pHZ1-CAS9-gRNA-BADH2的构建
1)OsU6-BADH2-gRNA-polyT片段的构建
第一轮PCR以Cris-GL3质粒为模板，用引物CRI-F1和SQ3-R1扩增OsU6启动子与BADH2基因的20bp靶序列，片段大小329bp；同样以Cris-GL3质粒为模板，用引物SQ3-F2和CRI-R2扩增BADH2基因的20bp靶序列与gRNA-polyT，片段大小180bp；第二轮PCR是以第一轮PCR产物为模板，用引物CRI-F1和CRI-R2扩增即得OsU6-BADH2-gRNA-polyT片段，片段大小489bp，序列如SEQ ID NO:2所示。(图1)
2)载体pHZ1-CAS9-gRNA-BADH2的构建
将OsU6-BADH2-gRNA-polyT片段与经Hind III酶切后的PMDC99-Cas9载体分别进行琼脂糖凝胶电泳，切胶回收后进行无缝克隆，基于同源重组的原理，OsU6-BADH2-gRNA-polyT片段通过Infusion的方法融合到PMDC99-CAS9载体的Hind III位点，即构建得到pHZ1-CAS9-gRNA-BADH2载体(序列如SEQ ID NO:3所示)。
其中，步骤1)中使用的引物序列如下：
CRI-F1：5’-CGACGGCCAGTGCCAAGCTTCTCGGATCCACTAGTAACGGC-3’
SQ3-R1：5’-AGCGCGGGGGCGCGCCACTCACACAAGCGACAGCGCGCGGG-3’
SQ3-F2：5’-GAGTGGCGCGCCCCCGCGCTGTTTTAGAGCTAGAAATAGCA-3’
CRI-R2:5’-ACCTGCAGGCATGCAAGCTTCGACCTCGAGCGGCCGCCAGT-3’。
载体pHZ1-CAS9-gRNA-BADH2的验证：用BamH I/Hind III双酶切。酶切结果见图2，第1泳道代表pHZ1-CAS9-gRNA-BADH2载体酶切结果，可获得9205bp、5180bp、447bp三个条带。第2泳道代表PMDC99-CAS9对照载体酶切结果，可获得9197bp、5180bp两个条带，M为2kb Marker，条带大小分别为2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp。
Cris-GL3质粒、PMDC99-CAS9载体和载体pHZ1-CAS9-gRNA-BADH2的质粒图谱分别见图3-图5。
实施例2水稻BADH2基因定点突变植株的制备方法
1、农杆菌转化及菌落PCR鉴定
从-80℃冰箱中取农杆菌感受态在冰上解冻，加入3-5μL质粒pHZ1-CAS9-gRNA-BADH2混匀，冰置30min，放入液氮中1min，然后37℃水浴锅中热激1min，在无菌操作台中对应加入1mL YEP培养基，28℃摇床上摇2-4h，取出，8000rpm/min离心1min，在无菌操作台中倒掉部分上清，用涂布器均匀地把剩下的悬浊液混匀涂在加有利福平和卡那霉素的YEP平板上，封口膜封口后放入28℃培养箱培养。2d后挑取单菌落，28℃摇菌24-36h后，进行菌落PCR，获得阳性菌落。
菌落PCR：模板的制备：从试管中吸取200μL的菌液于1.5mL离心管中，先8000rpm/min离心1min倒掉上清液，分别加入50μL的ddH2O悬浮沉淀，放入沸水中煮沸2min，12000rpm/min离心5min，吸取上清作为模板。阳性对照：以稀释20-50倍的质粒1μL为模板。阴性对照：以1μL ddH2O为模板。
2、农杆菌介导的水稻转化
(1)成熟胚诱导愈伤
水稻‘日本晴’成熟种子脱粒后需去壳，用75％酒精洗2分钟，再浸入次氯酸钠溶液(活性氯5.5％)中，在摇床上摇30min(可根据实际情况摇两次，每次20min)，水洗5次，种子处理之后放在NBi培养基中用于诱导愈伤，26℃下光照14h/暗10h培养。
(2)剥取愈伤组织
成熟胚诱导愈伤需15-20天长出，在超净台中无菌滤纸上，用镊子和钩子剥取愈伤组织，移至新的NBi培养基上，26℃下暗培养。愈伤剥下后在NBi培养基上培养4天即可用于侵染，不侵染的应定期在新NBi培养基上继代培养，长时间培养后侵染率会下降。
(3)侵染
用移液枪从100mL农杆菌悬浮液(所述农杆菌悬浮液的配方按1L计为：20×N6母液50mL，100×EDTA-Fe母液10mL，100×B5微量元素母液10mL，100×B5维生素母液10mL，CEH 0.3g，肌醇2g，蔗糖30g，AS 100μM，pH 5.2～5.3)中吸取800μL冲洗农杆菌菌板三至四次，吸取菌液3～5滴到悬浮液中，稍有混浊即可(即菌液浓度达到OD600为0.3左右)，将愈伤组织用镊子夹入悬浮液中，计时15min，每隔三四分钟摇晃一次，使其充分接触。倒去菌液，将感染过的愈伤组织倒在无菌滤纸上，吸干其表面多余的菌液，10min后将愈伤移至NBco共培养基上，放至组培间26℃条件下，光照培养2～3d，直到愈伤组织周围看得见农杆菌长出。
(4)清洗愈伤及预筛选
将侵染过的愈伤放入灭菌的空三角瓶中，用无菌水冲洗数次，直到水变清澈为止，在100mL灭菌的无菌水中加入200μL头孢(cef，浓度0.25g/mL，终浓度500mg/L)，将愈伤用镊子夹入三角瓶，放于28℃摇床上摇15min，将装有头孢的水倒出，将愈伤拨到无菌滤纸上充分吹干，定期翻动愈伤，1-2小时后将愈伤放入NBps预筛选培养基上，26℃下暗培养7d。
(5)筛选
将NBps预筛选培养基上的愈伤移到NBS筛选培养基上。
(6)再生培养
1个月后，将长出的抗性愈伤依次编号置于再生培养基上，26℃下光照14h/暗10h培养3-4周左右。
(7)生根培养
待再生培养基中的抗性愈伤发育长出2-3厘米的小苗之后，即可用镊子轻轻夹出，放在灭过菌的空培养皿上，除去苗周围及根部的培养基和旧的愈伤，然后轻轻放入有3.5cm高的生根培养基的生根管中，每管中放一棵苗，编号与再生管编号一致。26℃下光照14h/黑暗10h培养3-4周，待小苗长出粗壮而发达的根系后即可开盖炼苗培养，定期向管中加自来水。
(8)种苗
小苗长至叶片直立且根系发达时，将小苗根部培养基洗净后继续放入生根管中并加入自来水，待小苗足够健壮后种于土中。
3、BADH2敲除效果检测
选取靶位点上下游各200bp-400bp序列，设计引物，进行PCR扩增，扩增片段送测序，通过峰图判断靶位点是否发生突变。鉴定BADH2突变效果的引物序列如下，片段大小494bp。
JDSQ3F1：5’-ACCTATCGCTTTCCACCTCA-3’
JDSQ3R1：5’-CGGTTCCTCTTCAGCGCCTC-3’
扩增结果见图6，第1泳道表示BADH2转基因植株中第107号株系第1棵苗T0代植株，将其命名为FZCX3-1，第2泳道表示BADH2转基因植株中第132号株系第2棵苗T0代植株，将其命名为FZCX3-2；+表示日本晴基因组正对照，-表示ddH2O负对照，M为2kb Marker，条带大小分别为2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp。
将上述BADH2的PCR片段送测序，测序引物为JDSQ3F1，FZCX3-1、FZCX3-2植株(T0代)测序结果表明BADH2在PAM位点(即CGG序列)附近出现突变。
FZCX3-1和FZCX3-2植株测序峰图分别见图7A和图7B。将测序结果在DSDecode网站(http://dsdecode.scgene.com/home/)中进行突变类型的预测，结果见图8。
由此可知，FZCX3-1植株中BADH2是复合杂合子突变。其中一条链缺失4个碱基，另一条链是5个碱基的突变；FZCX3-2植株中BADH2也是复合杂合子突变。其中一条链缺失4个碱基，缺失位置与FZCX3-1中一样，另一条链是5个碱基的突变，突变位置部分不一样。
FZCX3-1与FZCX3-2中4个碱基的缺失造成移码，翻译提前终止，碱基序列及推导氨基酸序列如下：
ATGGCCACGGCGATCCCGCAGCGGCAGCTCTTCGTCGCCGGCGAGTGGCGCGCCCGCTCGGCCGCCGCCTCCCCGTCGTCAACCCCGCCACCGAGTCCCCCATCGGCGAGATCCCGGCGGGCACGGCGGAGGACGTGGACGCGGCGGTGGCGGCGGCGCGGGAGGCGCTGAAGAGGAACCGGGGCCGCGACTGGGCGCGCGCGCCGGGCGCCGTCCGGGCCAAGTACCTCCGCGCAATCGCGGCCAAGATAATCGAGAGGAAATCTGAGCTGGCTAGACTAGAGACGCTTGATTGTGGGAAGCCTCTTGATGAAGCAGCATGGGACATGGACGATGTTGCTGGATGCTTTGAGTACTTTGCAGATCTTGCAGAATCCTTGGACAAAAGGCAAAATGCACCTGTCTCTCTTCCAATGGAAAACTTTAAATGCTATCTTCGGAAAGAGCCTATCGGTGTAGTTGGGTTGATCACACCTTGGAACTATCCTCTCCTGATGGCAACATGGAAGGTAGCTCCTGCCCTGGCTGCTGGCTGTACAGCTGTACTAAAACCATCTGAATTGGCTTCCGTGACTTGTTTGGAGCTTGCTGATGTGTGTAAAGAGGTTGGTCTTCCTTCAGGTGTGCTAAACATAGTGACTGGATTAGGTTCTGAAGCCGGTGCTCCTTTGTCATCACACCCTGGTGTAGACAAGGTTGCATTTACTGGGAGTTATGAAACTGGTAAAAAGATTATGGCTTCAGCTGCTCCTATGGTTAAGCCTGTTTCACTGGAACTTGGTGGAAAAAGTCCTATAGTGGTGTTTGATGATGTTGATGTTGAAAAAGCTGTTGAGTGGACTCTCTTTGGTTGCTTTTGGACCAATGGCCAGATTTGCAGTGCAACATCGCGTCTTATTCTTCATAAAAAAATCGCTAAAGAATTTCAAGAAAGGATGGTTGCATGGGCCAAAAATATTAAGGTGTCAGATCCACTTGAAGAGGGTTGCAGGCTTGGGCCCGTTGTTAGTGAAGGACAGTATGAGAAGATTAAGCAATTTGTATCTACCGCCAAAAGCCAAGGTGCTACCATTCTGACTGGTGGGGTTAGACCCAAGCATCTGGAGAAAGGTTTCTATATTGAACCCACAATCATTACTGATGTCGATACATCAATGCAAATTTGGAGGGAAGAAGTTTTTGGTCCAGTGCTCTGTGTGAAAGAATTTAGCACTGAAGAAGAAGCCATTGAATTGGCCAACGATACTCATTATGGTCTGGCTGGTGCTGTGCTTTCCGGTGACCGCGAGCGATGCCAGAGATTAACTGAGGAGATCGATGCCGGAATTATCTGGGTGAACTGCTCGCAACCCTGCTTCTGCCAAGCTCCATGGGGCGGGAACAAGCGCAGCGGCTTTGGACGCGAGCTCGGAGAAGGGGGCATTGACAACTACCTAAGCGTCAAGCAAGTGACGGAGTACGCCTCCGATGAGCCGTGGGGATGGTACAAATCCCCTTCCAAGCTGTAA
MATAIPQRQLFVAGEWRARSAAASPSSTPPPSPPSARSRRARRRTWTRRWRRRGRR.RGTGAATGRARRAPSGPSTSAQSRPR.SRGNLSWLD.RRLIVGSLLMKQHGTWTMLLDALSTLQILQNPWTKGKMHLSLFQWKTLNAIFGKSLSV.LG.SHLGTILS.WQHGR.LLPWLLAVQLY.NHLNWLP.LVWSLLMCVKRLVFLQVC.T..LD.VLKPVLLCHHTLV.TRLHLLGVMKLVKRLWLQLLLWLSLFHWNLVEKVL.WCLMMLMLKKLLSGLSLVAFGPMARFAVQHRVLFFIKKSLKNFKKGWLHGPKILRCQIHLKRVAGLGPLLVKDSMRRLSNLYLPPKAKVLPF.LVGLDPSIWRKVSILNPQSLLMSIHQCKFGGKKFLVQCSV.KNLALKKKPLNWPTILIMVWLVLCFPVTASDARD.LRRSMPELSG.TARNPASAKLHGAGTSAAALDASSEKGALTTT.ASSK.RSTPPMSRGDGTNPLPSC
FZCX3-1中5个碱基的突变造成3个连续氨基酸突变，其碱基序列及推导氨基酸序列如下：
ATGGCCACGGCGATCCCGCAGCGGCAGCTCTTCGTCGCCGGCGAGTGGCGCGCCCCCGGGCGGCGGCGCCGCCTCCCCGTCGTCAACCCCGCCACCGAGTCCCCCATCGGCGAGATCCCGGCGGGCACGGCGGAGGACGTGGACGCGGCGGTGGCGGCGGCGCGGGAGGCGCTGAAGAGGAACCGGGGCCGCGACTGGGCGCGCGCGCCGGGCGCCGTCCGGGCCAAGTACCTCCGCGCAATCGCGGCCAAGATAATCGAGAGGAAATCTGAGCTGGCTAGACTAGAGACGCTTGATTGTGGGAAGCCTCTTGATGAAGCAGCATGGGACATGGACGATGTTGCTGGATGCTTTGAGTACTTTGCAGATCTTGCAGAATCCTTGGACAAAAGGCAAAATGCACCTGTCTCTCTTCCAATGGAAAACTTTAAATGCTATCTTCGGAAAGAGCCTATCGGTGTAGTTGGGTTGATCACACCTTGGAACTATCCTCTCCTGATGGCAACATGGAAGGTAGCTCCTGCCCTGGCTGCTGGCTGTACAGCTGTACTAAAACCATCTGAATTGGCTTCCGTGACTTGTTTGGAGCTTGCTGATGTGTGTAAAGAGGTTGGTCTTCCTTCAGGTGTGCTAAACATAGTGACTGGATTAGGTTCTGAAGCCGGTGCTCCTTTGTCATCACACCCTGGTGTAGACAAGGTTGCATTTACTGGGAGTTATGAAACTGGTAAAAAGATTATGGCTTCAGCTGCTCCTATGGTTAAGCCTGTTTCACTGGAACTTGGTGGAAAAAGTCCTATAGTGGTGTTTGATGATGTTGATGTTGAAAAAGCTGTTGAGTGGACTCTCTTTGGTTGCTTTTGGACCAATGGCCAGATTTGCAGTGCAACATCGCGTCTTATTCTTCATAAAAAAATCGCTAAAGAATTTCAAGAAAGGATGGTTGCATGGGCCAAAAATATTAAGGTGTCAGATCCACTTGAAGAGGGTTGCAGGCTTGGGCCCGTTGTTAGTGAAGGACAGTATGAGAAGATTAAGCAATTTGTATCTACCGCCAAAAGCCAAGGTGCTACCATTCTGACTGGTGGGGTTAGACCCAAGCATCTGGAGAAAGGTTTCTATATTGAACCCACAATCATTACTGATGTCGATACATCAATGCAAATTTGGAGGGAAGAAGTTTTTGGTCCAGTGCTCTGTGTGAAAGAATTTAGCACTGAAGAAGAAGCCATTGAATTGGCCAACGATACTCATTATGGTCTGGCTGGTGCTGTGCTTTCCGGTGACCGCGAGCGATGCCAGAGATTAACTGAGGAGATCGATGCCGGAATTATCTGGGTGAACTGCTCGCAACCCTGCTTCTGCCAAGCTCCATGGGGCGGGAACAAGCGCAGCGGCTTTGGACGCGAGCTCGGAGAAGGGGGCATTGACAACTACCTAAGCGTCAAGCAAGTGACGGAGTACGCCTCCGATGAGCCGTGGGGATGGTACAAATCCCCTTCCAAGCTGTAA
MATAIPQRQLFVAGEWRAPGRRRRLPVVNPATESPIGEIPAGTAEDVDAAVAAAREALKRNRGRDWARAPGAVRAKYLRAIAAKIIERKSELARLETLDCGKPLDEAAWDMDDVAGCFEYFADLAESLDKRQNAPVSLPMENFKCYLRKEPIGVVGLITPWNYPLLMATWKVAPALAAGCTAVLKPSELASVTCLELADVCKEVGLPSGVLNIVTGLGSEAGAPLSSHPGVDKVAFTGSYETGKKIMASAAPMVKPVSLELGGKSPIVVFDDVDVEKAVEWTLFGCFWTNGQICSATSRLILHKKIAKEFQERMVAWAKNIKVSDPLEEGCRLGPVVSEGQYEKIKQFVSTAKSQGATILTGGVRPKHLEKGFYIEPTIITDVDTSMQIWREEVFGPVLCVKEFSTEEEAIELANDTHYGLAGAVLSGDRERCQRLTEEIDAGIIWVNCSQPCFCQAPWGGNKRSGFGRELGEGGIDNYLSVKQVTEYASDEPWGWYKSPSKL
FZCX3-2中5个碱基的突变造成2个氨基酸突变，其碱基序列及推导氨基酸序列如下：
ATGGCCACGGCGATCCCGCAGCGGCAGCTCTTCGTCGCCGGCGAGTGGCGCGCCCCGGGGCTGCGGCGCCGCCTCCCCGTCGTCAACCCCGCCACCGAGTCCCCCATCGGCGAGATCCCGGCGGGCACGGCGGAGGACGTGGACGCGGCGGTGGCGGCGGCGCGGGAGGCGCTGAAGAGGAACCGGGGCCGCGACTGGGCGCGCGCGCCGGGCGCCGTCCGGGCCAAGTACCTCCGCGCAATCGCGGCCAAGATAATCGAGAGGAAATCTGAGCTGGCTAGACTAGAGACGCTTGATTGTGGGAAGCCTCTTGATGAAGCAGCATGGGACATGGACGATGTTGCTGGATGCTTTGAGTACTTTGCAGATCTTGCAGAATCCTTGGACAAAAGGCAAAATGCACCTGTCTCTCTTCCAATGGAAAACTTTAAATGCTATCTTCGGAAAGAGCCTATCGGTGTAGTTGGGTTGATCACACCTTGGAACTATCCTCTCCTGATGGCAACATGGAAGGTAGCTCCTGCCCTGGCTGCTGGCTGTACAGCTGTACTAAAACCATCTGAATTGGCTTCCGTGACTTGTTTGGAGCTTGCTGATGTGTGTAAAGAGGTTGGTCTTCCTTCAGGTGTGCTAAACATAGTGACTGGATTAGGTTCTGAAGCCGGTGCTCCTTTGTCATCACACCCTGGTGTAGACAAGGTTGCATTTACTGGGAGTTATGAAACTGGTAAAAAGATTATGGCTTCAGCTGCTCCTATGGTTAAGCCTGTTTCACTGGAACTTGGTGGAAAAAGTCCTATAGTGGTGTTTGATGATGTTGATGTTGAAAAAGCTGTTGAGTGGACTCTCTTTGGTTGCTTTTGGACCAATGGCCAGATTTGCAGTGCAACATCGCGTCTTATTCTTCATAAAAAAATCGCTAAAGAATTTCAAGAAAGGATGGTTGCATGGGCCAAAAATATTAAGGTGTCAGATCCACTTGAAGAGGGTTGCAGGCTTGGGCCCGTTGTTAGTGAAGGACAGTATGAGAAGATTAAGCAATTTGTATCTACCGCCAAAAGCCAAGGTGCTACCATTCTGACTGGTGGGGTTAGACCCAAGCATCTGGAGAAAGGTTTCTATATTGAACCCACAATCATTACTGATGTCGATACATCAATGCAAATTTGGAGGGAAGAAGTTTTTGGTCCAGTGCTCTGTGTGAAAGAATTTAGCACTGAAGAAGAAGCCATTGAATTGGCCAACGATACTCATTATGGTCTGGCTGGTGCTGTGCTTTCCGGTGACCGCGAGCGATGCCAGAGATTAACTGAGGAGATCGATGCCGGAATTATCTGGGTGAACTGCTCGCAACCCTGCTTCTGCCAAGCTCCATGGGGCGGGAACAAGCGCAGCGGCTTTGGACGCGAGCTCGGAGAAGGGGGCATTGACAACTACCTAAGCGTCAAGCAAGTGACGGAGTACGCCTCCGATGAGCCGTGGGGATGGTACAAATCCCCTTCCAAGCTGTAA
MATAIPQRQLFVAGEWRAPGLRRRLPVVNPATESPIGEIPAGTAEDVDAAVAAAREALKRNRGRDWARAPGAVRAKYLRAIAAKIIERKSELARLETLDCGKPLDEAAWDMDDVAGCFEYFADLAESLDKRQNAPVSLPMENFKCYLRKEPIGVVGLITPWNYPLLMATWKVAPALAAGCTAVLKPSELASVTCLELADVCKEVGLPSGVLNIVTGLGSEAGAPLSSHPGVDKVAFTGSYETGKKIMASAAPMVKPVSLELGGKSPIVVFDDVDVEKAVEWTLFGCFWTNGQICSATSRLILHKKIAKEFQERMVAWAKNIKVSDPLEEGCRLGPVVSEGQYEKIKQFVSTAKSQGATILTGGVRPKHLEKGFYIEPTIITDVDTSMQIWREEVFGPVLCVKEFSTEEEAIELANDTHYGLAGAVLSGDRERCQRLTEEIDAGIIWVNCSQPCFCQAPWGGNKRSGFGRELGEGGIDNYLSVKQVTEYASDEPWGWYKSPSKL.
本发明成功构建获得了杂合型BADH2突变体水稻植株FZCX3-1、FZCX3-2。利用载体pHZ1-CAS9-gRNA-BADH2对水稻BADH2基因定点突变的效率为50％。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 华智水稻生物技术有限公司
<120> 利用CRISPR-CAS9技术对水稻BADH2基因定点突变的方法
<130> KHP161117616.2
<160> 9
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 水稻
<400> 1
gagtggcgcg cccccgcgct 20
<210> 2
<211> 347
<212> DNA
<213> OsU6-BADH2-gRNA-polyT片段
<400> 2
ggatcatgaa ccaacggcct ggctgtattt ggtggttgtg tagggagatg gggagaagaa 60
aagcccgatt ctcttcgctg tgatgggctg gatgcatgcg ggggagcggg aggcccaagt 120
acgtgcacgg tgagcggccc acagggcgag tgtgagcgcg agaggcggga ggaacagttt 180
agtaccacat tgcccagcta actcgaacgc gaccaactta taaacccgcg cgctgtcgct 240
tgtgtgagtg gcgcgccccc gcgctgtttt agagctagaa atagcaagtt aaaataaggc 300
tagtccgtta tcaacttgaa aaagtggcac cgagtcggtg ctttttt 347
<210> 3
<211> 14832
<212> DNA
<213> pHZ1-CAS9-gRNA-BADH2载体
<400> 3
cgtaatcatg gtcatagctg tttcctgtgt gaaattgtta tccgctcaca attccacaca 60
acatacgagc cggaagcata aagtgtaaag cctggggtgc ctaatgagtg agctaactca 120
cattaattgc gttgcgctca ctgcccgctt tccagtcggg aaacctgtcg tgccagctgc 180
attaatgaat cggccaacgc gcggggagag gcggtttgcg tattggctag agcagcttgc 240
caacatggtg gagcacgaca ctctcgtcta ctccaagaat atcaaagata cagtctcaga 300
agaccaaagg gctattgaga cttttcaaca aagggtaata tcgggaaacc tcctcggatt 360
ccattgccca gctatctgtc acttcatcaa aaggacagta gaaaaggaag gtggcaccta 420
caaatgccat cattgcgata aaggaaaggc tatcgttcaa gatgcctctg ccgacagtgg 480
tcccaaagat ggacccccac ccacgaggag catcgtggaa aaagaagacg ttccaaccac 540
gtcttcaaag caagtggatt gatgtgataa catggtggag cacgacactc tcgtctactc 600
caagaatatc aaagatacag tctcagaaga ccaaagggct attgagactt ttcaacaaag 660
ggtaatatcg ggaaacctcc tcggattcca ttgcccagct atctgtcact tcatcaaaag 720
gacagtagaa aaggaaggtg gcacctacaa atgccatcat tgcgataaag gaaaggctat 780
cgttcaagat gcctctgccg acagtggtcc caaagatgga cccccaccca cgaggagcat 840
cgtggaaaaa gaagacgttc caaccacgtc ttcaaagcaa gtggattgat gtgatatctc 900
cactgacgta agggatgacg cacaatccca ctatccttcg caagaccttc ctctatataa 960
ggaagttcat ttcatttgga gaggacacgc tgaaatcacc agtctctctc tacaaatcta 1020
tctctctcga gctttcgcag atcccggggg gcaatgagat atgaaaaagc ctgaactcac 1080
cgcgacgtct gtcgagaagt ttctgatcga aaagttcgac agcgtctccg acctgatgca 1140
gctctcggag ggcgaagaat ctcgtgcttt cagcttcgat gtaggagggc gtggatatgt 1200
cctgcgggta aatagctgcg ccgatggttt ctacaaagat cgttatgttt atcggcactt 1260
tgcatcggcc gcgctcccga ttccggaagt gcttgacatt ggggagttta gcgagagcct 1320
gacctattgc atctcccgcc gtgcacaggg tgtcacgttg caagacctgc ctgaaaccga 1380
actgcccgct gttctacaac cggtcgcgga ggctatggat gcgatcgctg cggccgatct 1440
tagccagacg agcgggttcg gcccattcgg accgcaagga atcggtcaat acactacatg 1500
gcgtgatttc atatgcgcga ttgctgatcc ccatgtgtat cactggcaaa ctgtgatgga 1560
cgacaccgtc agtgcgtccg tcgcgcaggc tctcgatgag ctgatgcttt gggccgagga 1620
ctgccccgaa gtccggcacc tcgtgcacgc ggatttcggc tccaacaatg tcctgacgga 1680
caatggccgc ataacagcgg tcattgactg gagcgaggcg atgttcgggg attcccaata 1740
cgaggtcgcc aacatcttct tctggaggcc gtggttggct tgtatggagc agcagacgcg 1800
ctacttcgag cggaggcatc cggagcttgc aggatcgcca cgactccggg cgtatatgct 1860
ccgcattggt cttgaccaac tctatcagag cttggttgac ggcaatttcg atgatgcagc 1920
ttgggcgcag ggtcgatgcg acgcaatcgt ccgatccgga gccgggactg tcgggcgtac 1980
acaaatcgcc cgcagaagcg cggccgtctg gaccgatggc tgtgtagaag tactcgccga 2040
tagtggaaac cgacgcccca gcactcgtcc gagggcaaag aaatagagta gatgccgacc 2100
ggatctgtcg atcgacaagc tcgagtttct ccataataat gtgtgagtag ttcccagata 2160
agggaattag ggttcctata gggtttcgct catgtgttga gcatataaga aacccttagt 2220
atgtatttgt atttgtaaaa tacttctatc aataaaattt ctaattccta aaaccaaaat 2280
ccagtactaa aatccagatc ccccgaatta attcggcgtt aattcagtac attaaaaacg 2340
tccgcaatgt gttattaagt tgtctaagcg tcaatttgtt tacaccacaa tatatcctgc 2400
caccagccag ccaacagctc cccgaccggc agctcggcac aaaatcacca ctcgatacag 2460
gcagcccatc agtccgggac ggcgtcagcg ggagagccgt tgtaaggcgg cagactttgc 2520
tcatgttacc gatgctattc ggaagaacgg caactaagct gccgggtttg aaacacggat 2580
gatctcgcgg agggtagcat gttgattgta acgatgacag agcgttgctg cctgtgatca 2640
ccgcggtttc aaaatcggct ccgtcgatac tatgttatac gccaactttg aaaacaactt 2700
tgaaaaagct gttttctggt atttaaggtt ttagaatgca aggaacagtg aattggagtt 2760
cgtcttgtta taattagctt cttggggtat ctttaaatac tgtagaaaag aggaaggaaa 2820
taataaatgg ctaaaatgag aatatcaccg gaattgaaaa aactgatcga aaaataccgc 2880
tgcgtaaaag atacggaagg aatgtctcct gctaaggtat ataagctggt gggagaaaat 2940
gaaaacctat atttaaaaat gacggacagc cggtataaag ggaccaccta tgatgtggaa 3000
cgggaaaagg acatgatgct atggctggaa ggaaagctgc ctgttccaaa ggtcctgcac 3060
tttgaacggc atgatggctg gagcaatctg ctcatgagtg aggccgatgg cgtcctttgc 3120
tcggaagagt atgaagatga acaaagccct gaaaagatta tcgagctgta tgcggagtgc 3180
atcaggctct ttcactccat cgacatatcg gattgtccct atacgaatag cttagacagc 3240
cgcttagccg aattggatta cttactgaat aacgatctgg ccgatgtgga ttgcgaaaac 3300
tgggaagaag acactccatt taaagatccg cgcgagctgt atgatttttt aaagacggaa 3360
aagcccgaag aggaacttgt cttttcccac ggcgacctgg gagacagcaa catctttgtg 3420
aaagatggca aagtaagtgg ctttattgat cttgggagaa gcggcagggc ggacaagtgg 3480
tatgacattg ccttctgcgt ccggtcgatc agggaggata tcggggaaga acagtatgtc 3540
gagctatttt ttgacttact ggggatcaag cctgattggg agaaaataaa atattatatt 3600
ttactggatg aattgtttta gtacctagaa tgcatgacca aaatccctta acgtgagttt 3660
tcgttccact gagcgtcaga ccccgtagaa aagatcaaag gatcttcttg agatcctttt 3720
tttctgcgcg taatctgctg cttgcaaaca aaaaaaccac cgctaccagc ggtggtttgt 3780
ttgccggatc aagagctacc aactcttttt ccgaaggtaa ctggcttcag cagagcgcag 3840
ataccaaata ctgtccttct agtgtagccg tagttaggcc accacttcaa gaactctgta 3900
gcaccgccta catacctcgc tctgctaatc ctgttaccag tggctgctgc cagtggcgat 3960
aagtcgtgtc ttaccgggtt ggactcaaga cgatagttac cggataaggc gcagcggtcg 4020
ggctgaacgg ggggttcgtg cacacagccc agcttggagc gaacgaccta caccgaactg 4080
agatacctac agcgtgagct atgagaaagc gccacgcttc ccgaagggag aaaggcggac 4140
aggtatccgg taagcggcag ggtcggaaca ggagagcgca cgagggagct tccaggggga 4200
aacgcctggt atctttatag tcctgtcggg tttcgccacc tctgacttga gcgtcgattt 4260
ttgtgatgct cgtcaggggg gcggagccta tggaaaaacg ccagcaacgc ggccttttta 4320
cggttcctgg ccttttgctg gccttttgct cacatgttct ttcctgcgtt atcccctgat 4380
tctgtggata accgtattac cgcctttgag tgagctgata ccgctcgccg cagccgaacg 4440
accgagcgca gcgagtcagt gagcgaggaa gcggaagagc gcctgatgcg gtattttctc 4500
cttacgcatc tgtgcggtat ttcacaccgc atatggtgca ctctcagtac aatctgctct 4560
gatgccgcat agttaagcca gtatacactc cgctatcgct acgtgactgg gtcatggctg 4620
cgccccgaca cccgccaaca cccgctgacg cgccctgacg ggcttgtctg ctcccggcat 4680
ccgcttacag acaagctgtg accgtctccg ggagctgcat gtgtcagagg ttttcaccgt 4740
catcaccgaa acgcgcgagg cagggtgcct tgatgtgggc gccggcggtc gagtggcgac 4800
ggcgcggctt gtccgcgccc tggtagattg cctggccgta ggccagccat ttttgagcgg 4860
ccagcggccg cgataggccg acgcgaagcg gcggggcgta gggagcgcag cgaccgaagg 4920
gtaggcgctt tttgcagctc ttcggctgtg cgctggccag acagttatgc acaggccagg 4980
cgggttttaa gagttttaat aagttttaaa gagttttagg cggaaaaatc gccttttttc 5040
tcttttatat cagtcactta catgtgtgac cggttcccaa tgtacggctt tgggttccca 5100
atgtacgggt tccggttccc aatgtacggc tttgggttcc caatgtacgt gctatccaca 5160
ggaaagagac cttttcgacc tttttcccct gctagggcaa tttgccctag catctgctcc 5220
gtacattagg aaccggcgga tgcttcgccc tcgatcaggt tgcggtagcg catgactagg 5280
atcgggccag cctgccccgc ctcctccttc aaatcgtact ccggcaggtc atttgacccg 5340
atcagcttgc gcacggtgaa acagaacttc ttgaactctc cggcgctgcc actgcgttcg 5400
tagatcgtct tgaacaacca tctggcttct gccttgcctg cggcgcggcg tgccaggcgg 5460
tagagaaaac ggccgatgcc gggatcgatc aaaaagtaat cggggtgaac cgtcagcacg 5520
tccgggttct tgccttctgt gatctcgcgg tacatccaat cagctagctc gatctcgatg 5580
tactccggcc gcccggtttc gctctttacg atcttgtagc ggctaatcaa ggcttcaccc 5640
tcggataccg tcaccaggcg gccgttcttg gccttcttcg tacgctgcat ggcaacgtgc 5700
gtggtgttta accgaatgca ggtttctacc aggtcgtctt tctgctttcc gccatcggct 5760
cgccggcaga acttgagtac gtccgcaacg tgtggacgga acacgcggcc gggcttgtct 5820
cccttccctt cccggtatcg gttcatggat tcggttagat gggaaaccgc catcagtacc 5880
aggtcgtaat cccacacact ggccatgccg gccggccctg cggaaacctc tacgtgcccg 5940
tctggaagct cgtagcggat cacctcgcca gctcgtcggt cacgcttcga cagacggaaa 6000
acggccacgt ccatgatgct gcgactatcg cgggtgccca cgtcatagag catcggaacg 6060
aaaaaatctg gttgctcgtc gcccttgggc ggcttcctaa tcgacggcgc accggctgcc 6120
ggcggttgcc gggattcttt gcggattcga tcagcggccg cttgccacga ttcaccgggg 6180
cgtgcttctg cctcgatgcg ttgccgctgg gcggcctgcg cggccttcaa cttctccacc 6240
aggtcatcac ccagcgccgc gccgatttgt accgggccgg atggtttgcg accgtcacgc 6300
cgattcctcg ggcttggggg ttccagtgcc attgcagggc cggcagacaa cccagccgct 6360
tacgcctggc caaccgcccg ttcctccaca catggggcat tccacggcgt cggtgcctgg 6420
ttgttcttga ttttccatgc cgcctccttt agccgctaaa attcatctac tcatttattc 6480
atttgctcat ttactctggt agctgcgcga tgtattcaga tagcagctcg gtaatggtct 6540
tgccttggcg taccgcgtac atcttcagct tggtgtgatc ctccgccggc aactgaaagt 6600
tgacccgctt catggctggc gtgtctgcca ggctggccaa cgttgcagcc ttgctgctgc 6660
gtgcgctcgg acggccggca cttagcgtgt ttgtgctttt gctcattttc tctttacctc 6720
attaactcaa atgagttttg atttaatttc agcggccagc gcctggacct cgcgggcagc 6780
gtcgccctcg ggttctgatt caagaacggt tgtgccggcg gcggcagtgc ctgggtagct 6840
cacgcgctgc gtgatacggg actcaagaat gggcagctcg tacccggcca gcgcctcggc 6900
aacctcaccg ccgatgcgcg tgcctttgat cgcccgcgac acgacaaagg ccgcttgtag 6960
ccttccatcc gtgacctcaa tgcgctgctt aaccagctcc accaggtcgg cggtggccca 7020
tatgtcgtaa gggcttggct gcaccggaat cagcacgaag tcggctgcct tgatcgcgga 7080
cacagccaag tccgccgcct ggggcgctcc gtcgatcact acgaagtcgc gccggccgat 7140
ggccttcacg tcgcggtcaa tcgtcgggcg gtcgatgccg acaacggtta gcggttgatc 7200
ttcccgcacg gccgcccaat cgcgggcact gccctgggga tcggaatcga ctaacagaac 7260
atcggccccg gcgagttgca gggcgcgggc tagatgggtt gcgatggtcg tcttgcctga 7320
cccgcctttc tggttaagta cagcgataac cttcatgcgt tccccttgcg tatttgttta 7380
tttactcatc gcatcatata cgcagcgacc gcatgacgca agctgtttta ctcaaataca 7440
catcaccttt ttagacggcg gcgctcggtt tcttcagcgg ccaagctggc cggccaggcc 7500
gccagcttgg catcagacaa accggccagg atttcatgca gccgcacggt tgagacgtgc 7560
gcgggcggct cgaacacgta cccggccgcg atcatctccg cctcgatctc ttcggtaatg 7620
aaaaacggtt cgtcctggcc gtcctggtgc ggtttcatgc ttgttcctct tggcgttcat 7680
tctcggcggc cgccagggcg tcggcctcgg tcaatgcgtc ctcacggaag gcaccgcgcc 7740
gcctggcctc ggtgggcgtc acttcctcgc tgcgctcaag tgcgcggtac agggtcgagc 7800
gatgcacgcc aagcagtgca gccgcctctt tcacggtgcg gccttcctgg tcgatcagct 7860
cgcgggcgtg cgcgatctgt gccggggtga gggtagggcg ggggccaaac ttcacgcctc 7920
gggccttggc ggcctcgcgc ccgctccggg tgcggtcgat gattagggaa cgctcgaact 7980
cggcaatgcc ggcgaacacg gtcaacacca tgcggccggc cggcgtggtg gtgtcggccc 8040
acggctctgc caggctacgc aggcccgcgc cggcctcctg gatgcgctcg gcaatgtcca 8100
gtaggtcgcg ggtgctgcgg gccaggcggt ctagcctggt cactgtcaca acgtcgccag 8160
ggcgtaggtg gtcaagcatc ctggccagct ccgggcggtc gcgcctggtg ccggtgatct 8220
tctcggaaaa cagcttggtg cagccggccg cgtgcagttc ggcccgttgg ttggtcaagt 8280
cctggtcgtc ggtgctgacg cgggcatagc ccagcaggcc agcggcggcg ctcttgttca 8340
tggcgtaatg tctccggttc tagtcgcaag tattctactt tatgcgacta aaacacgcga 8400
caagaaaacg ccaggaaaag ggcagggcgg cagcctgtcg cgtaacttag gacttgtgcg 8460
acatgtcgtt ttcagaagac ggctgcactg aacgtcagaa gccgactgca ctatagcagc 8520
ggaggggttg gatcaaagta ctttgatccc gaggggaacc ctgtggttgg catgcacata 8580
caaatggacg aacggataaa ccttttcacg cccttttaaa tatccgttat tctaataaac 8640
gctcttttct cttaggttta cccgccaata tatcctgtca aacactgata gtttaaactg 8700
aaggcgggaa acgacaatct gatccaagct caagctgctc tagcattcgc cattcaggct 8760
gcgcaactgt tgggaagggc gatcggtgcg ggcctcttcg ctattacgcc agctggcgaa 8820
agggggatgt gctgcaaggc gattaagttg ggtaacgcca gggttttccc agtcacgacg 8880
ttgtaaaacg acggccagtg ccaagctctc ggatccacta gtaacggccg ccagtgtgct 8940
ggaattgccc ttggatcatg aaccaacggc ctggctgtat ttggtggttg tgtagggaga 9000
tggggagaag aaaagcccga ttctcttcgc tgtgatgggc tggatgcatg cgggggagcg 9060
ggaggcccaa gtacgtgcac ggtgagcggc ccacagggcg agtgtgagcg cgagaggcgg 9120
gaggaacagt ttagtaccac attgcccagc taactcgaac gcgaccaact tataaacccg 9180
cgcgctgtcg cttgtgtgag tggcgcgccc ccgcgctgtt ttagagctag aaatagcaag 9240
ttaaaataag gctagtccgt tatcaacttg aaaaagtggc accgagtcgg tgcttttttt 9300
gtcccttcga agggcaattc tgcagatatc catcacactg gcggccgctc gaggtcgaag 9360
cttgcatgcc tgcaggtcaa catggtggag cacgacacac ttgtctactc caaaaatatc 9420
aaagatacag tctcagaaga ccaaagggca attgagactt ttcaacaaag ggtaatatcc 9480
ggaaacctcc tcggattcca ttgcccagct atctgtcact ttattgtgaa gatagtggaa 9540
aaggaaggtg gctcctacaa atgccatcat tgcgataaag gaaaggccat cgttgaagat 9600
gcctctgccg acagtggtcc caaagatgga cccccaccca cgaggagcat cgtggaaaaa 9660
gaagacgttc caaccacgtc ttcaaagcaa gtggattgat gtgataacat ggtggagcac 9720
gacacacttg tctactccaa aaatatcaaa gatacagtct cagaagacca aagggcaatt 9780
gagacttttc aacaaagggt gatatccgga aacctcctcg gattccattg cccagctatc 9840
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gataaaggaa aggccatcgt tgaagatgcc tctgccgaca gtggtcccaa agatggaccc 9960
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gattgatgtg atatctccac tgacgtaagg gatgacgcac aatcccacta tccttcgcaa 10080
gacccttcct ctatataagg aagttcattt catttggaga ggacctcgac ctcaacacaa 10140
catatacaaa acaaacgaat ctcaagcaat caagcattct acttctattg cagcaattta 10200
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