一种Y染色体微缺失检测试剂盒的制作方法

本发明涉及染色体缺失检测领域，尤其涉及一种Y染色体微缺失检测试剂盒。

背景技术：

据估计不育症困扰着世界上超过10％的育龄夫妇,其中男性因素占了一半。引起男性不育的病因有很多,包括感染、生殖器官畸形、免疫功能异常、精索静脉曲张、勃起机能障碍、药物损伤以及染色体异常等。男性不育常伴随着精子数量减少,国内学者已对其进行了大量相关研究。Y染色体长臂无精子症因子(Azoospermia factor,AZF)微缺失是导致男性生精障碍主要的遗传学因素之一。研究表明,亚洲地区男性不育患者中AZF微缺失的发生率在2％～19.4％之间,与研究对象纳入标准、序列标签位点(Sequence Tag Site，STS)的选择、人群分布及遗传背景有关。AZF区微缺失的患者极少有自然生育能力,但近年来睾丸取精(Testicular sperm extraction,TESE)和卵母细胞质内单精子注射(Intracytoplasmic sperm injection,ICSI)技术的发展,给无精子症、少精子症患者能够生育带来了希望,但也增加了将微缺失传递给下一代的风险。因此,对男性不育患者尽早进行Y染色体微缺失筛查有着重要意义,不仅可以明确患者真正病因,避免不必要的检查及无效的治疗,还可预知或者防止遗传缺陷的传递。Y染色体微缺失一般在染色体核型分析时不易发现，目前主要通过AZF区域的序列标签位点来诊断，根据欧洲男科协会建议的六个STS位点进行Y染色体微缺失的分析，即AZFa亚区sY84和sY86位点，Y染色体AZFb亚区sY127和sY134位点，Y染色体AZFc亚区sY254和sY255位点，对上述位点的分析，Y染色体微缺失的检测准确率可以达到95％。

目前应用于检测Y染色体微缺失的技术主要为通过PCR方法对Y染色体AZF区域的序列标签位点进行特异性扩增，再用电泳或Southern blot杂交等方法对PCR产物进行检测，这两种检测方法虽技术成熟，但同时也都存在缺陷，电泳检测的方法准确率不高、灵敏度低，Southern blot杂交方法耗时耗力、成本较高且操作繁琐。

技术实现要素：

为解决上述技术问题，本发明提供一种Y染色体微缺失检测试剂盒。

本发明提供一种Y染色体微缺失检测试剂盒，所述试剂盒包括盒体1、海绵衬垫2，所述的海绵衬垫2置于盒体1内，海绵衬垫2上设有多个容器孔并装有多个装有检测试剂的试剂管，分别为装有PCR反应液I的试剂管3、装有PCR反应液II的试剂管4、装有阳性对照的试剂管5、装有阴性对照的试剂管6，装有空白对照的试剂管7。

本发明根据欧洲男科协会建议的六个STS位点和SRY及ZFY内参基因设计特异性引物和探针，通过Taqman荧光PCR法对其进行多重检测，可以快速、准确地检测Y染色体微缺失。

根据本发明的实施例，本发明提供一种用于Y染色体微缺失检测的引物和探针，所述引物和探针包括8组，可同时扩增检测Y染色体微缺失的六个STS位点和SRY及ZFY内参基因,所述引物探针组合包括用于检测SY84位点的引物探针组合、用于检测SY86位点的引物探针组合、用于检测SY127位点的引物探针组合、用于检测SY134位点的引物探针组合、用于检测SY254位点的引物探针组合、用于检测SY255位点的引物探针组合、用于检测SRY内参基因的引物探针组合以及用于检测ZFY内参基因的引物探针组合。

所述的该试剂盒中反应液分为反应液I和反应液II，其中反应液I中含有检测SY84位点、SY127位点、SY255位点、SRY和ZFY基因的引物探针组合，其中反应液II中含有SY86位点、SY134位点、SY254位点、SRY和ZFY基因的引物探针组合。

所述的PCR反应液I和PCR反应液II中SRY和ZFY基因的引物探针组合用于质控。

所述的PCR反应液I和PCR反应液II中用于检测SY84位点、SY86位点、SY254位点、SY255位点、SRY和ZFY基因的引物浓度均为200nM，探针浓度均为100nM，用于检测SY127位点、SY134位点的引物浓度均为200nM，探针浓度均为300nM。

所述的PCR反应液I和PCR反应液II中还包含有MgCL₂、Taq酶、dUTP、dATP、dCTP、dGTP、UDG酶、10×PCR Buffer。

所述的MgCL₂反应终浓度为4.5mM。

所述的Taq酶反应终浓度为5U。

所述的dUTP、dATP、dCTP、dGTP反应终浓度为0.5mM。

所述的UDG酶反应终浓度为0.3U。

所述的10×PCR Buffer反应终浓度为1×PCR Buffer。

进一步的本发明采用Taqman荧光探针PCR技术对Y染色体微缺失进行五重荧光检测。

本发明的有益效果是：本试剂盒和方法采用实时荧光定量PCR结合Taqman探针对Y染色体微缺失SY84位点、SY86位点、SY127位点、SY134位点、SY254位点、SY255位点进行多重荧光检测，内参基因SRY和ZFY基因检测的加入可有效控制本发明试剂盒和方法对Y染色体微缺失检测结果的有效性，该方法操作简单、检测通量高、快速、灵敏度高且特异性强，可有效缩短检测周期和成本。

附图说明

图1为本发明的Y染色体微缺失检测试剂盒结构示意图；

图2为PCR反应液I中SY84、SY127、SY255位点和SRY、ZFY基因的扩增曲线；

图3为PCR反应液II中SY86、SY134、SY254位点和SRY、ZFY基因的扩增曲线；

图4为PCR反应液I中SY127、SY255位点和SRY、ZFY基因的扩增曲线；

图5为PCR反应液II中SY134、SY254位点和SRY、ZFY基因的扩增曲线；

图6为PCR反应液I中SY84、SY255位点和SRY、ZFY基因的扩增曲线；

图7为PCR反应液II中SY86、SY254位点和SRY、ZFY基因的扩增曲线；

图8为PCR反应液I中SY84、SY127位点和SRY、ZFY基因的扩增曲线；

图9为PCR反应液II中SY86、SY134位点和SRY、ZFY基因的扩增曲线。

具体实施方式

本发明提供一种Y染色体微缺失检测试剂盒，如图1所示，所述试剂盒包括盒体1、海绵衬垫2，所述的海绵衬垫2置于盒体1内，海绵衬垫2上设有多个容器孔并装有多个装有检测试剂的试剂管，分别为装有PCR反应液I的试剂管3、装有PCR反应液II的试剂管4、装有阳性对照的试剂管5、装有阴性对照的试剂管6，装有空白对照的试剂管7。

本发明采用五重荧光PCR方法分两管对Y染色体微缺失进行检测，检测位点包括SY84位点、SY86位点、SY127位点、SY134位点、SY254位点、SY255位点，其中PCR反应液I检测位点为SY84位点、SY127位点、SY255位点和SRY以及ZFY内参基因，其中PCR反应液II检测位点为SY86位点、SY134位点、SY254位点、SRY和ZFY内参基因，阳性对照采用正常已育男性DNA样本，阴性对照采用女性DNA样本，空白对照采用灭菌水以防止体系被污染。

所述的SY84位点、SY86位点引物探针组合用于检测Y染色体AZFa区域是否存在缺失情况。

所述的SY127位点、SY134位点引物探针组合用于检测Y染色体AZFb区域是否存在缺失情况。

所述的SY254位点、SY255位点引物探针组合用于检测Y染色体AZFc区域是否存在缺失情况。

所述的SRY和ZFY基因的引物探针组合用于质控，检测反应体系即过程是否正常及检测结果可使用性。

所述的PCR反应液I和PCR反应液II中用于检测SY84位点、SY86位点、SY254位点、SY255位点、SRY和ZFY基因的引物浓度均为200nM，探针浓度均为100nM，用于检测SY127位点、SY134位点的引物浓度均为200nM，探针浓度均为300nM。

所述的PCR反应液I和PCR反应液II中还包含有MgCL₂、Taq酶、dUTP、dATP、dCTP、dGTP、UDG酶、10×PCR Buffer。

所述的MgCL₂反应终浓度为4.5mM。

所述的Taq酶反应终浓度为5U。

所述的dUTP、dATP、dCTP、dGTP反应终浓度为0.5mM。

所述的UDG酶反应终浓度为0.3U。

所述的10×PCR Buffer反应终浓度为1×PCR Buffer。

本发明所述的Y染色体微缺失检测包括以下步骤：

1.基因组DNA的提取：可通过柱式提取方法或Chelex法对EDTA抗凝全血或口腔拭子等来源的样本进行DNA提取。

2.荧光PCR扩增检测：所述的多重荧光PCR扩增检测包括本发明的PCR反应液I和PCR反应液II同时对待检样本DNA和阳性对照、阴性对照以及空白对照进行扩增检测。

3.PCR扩增检测反应条件：37℃5min；95℃5min；95℃15S，60℃60S,40cycles。

4.结果分析：根据扩增曲线的有无判断对应的SY84位点、SY86位点、SY127位点、SY134位点、SY254位点、SY255位点有无缺失。

实施例1

1.基因组DNA的提取：常规柱式提取方法或Chelex法提取200μl抗凝全血DNA作为模板。

2.荧光PCR扩增检测：以PCR反应液I和PCR反应液II同时对样本DNA和阳性对照、阴性对照以及空白对照进行扩增检测，其中PCR反应液I和PCR反应液II中用于检测SY84位点、SY86位点、SY254位点、SY255位点、SRY和ZFY基因的引物浓度均为200nM，探针浓度均为100nM，用于检测SY127位点、SY134位点的引物浓度均为200nM，探针浓度均为300nM。MgCL₂反应终浓度为4.5mM,Taq酶反应终浓度为5U,dUTP、dATP、dCTP、dGTP反应终浓度为0.5mM,UDG酶反应终浓度为0.3U,10×PCR Buffer反应终浓度为1×PCR Buffer，样本基因组DNA、阳性对照、阴性对照、空白对照均加入5μl，加去离子水补足体积至50μl。引物探针信息如下：

SY84上游引物为5’-AGGCAGACACTAAAGAAAGGGTCCCA-3’

SY84下游引物为5’-AAAGAGAAGGGTCCTGAAAGCA-3’

SY84探针为5’-JOE-AGGCAAGCCCTTGAGCAAATTCCCT-BHQ1-3’

SY86上游引物为5’-GTGACACACAGACTATGCTTC-3’

SY86下游引物为5’-ACACACAGAGGGACAACCCT-3’

SY86探针为5’-JOE-TACAAAGAAATCCCAAAGACTGGGCCCCT-BHQ1-3’

SY127上游引物为5’-GGCTCACAAACGAAAAGAAA-3’

SY127下游引物为5’-CTGCAGGCAGTAATAAGGGA-3’

SY127探针为5’-TAMRA-CAGCTTGTTTCCTTATATGGGTGAGCCAGAT-BHQ2-3’SY134上游引物为5’-GTCTGCCTCACCATAAAACG-3’

SY134下游引物为5’-CATCATGCTATGCACTTCAGAAACT-3’

SY134探针为5’-TAMRA-AACATCTGGAACATTCTACTTGAAGCGTTCTGT-BHQ2-3’

SY254上游引物为5’-GGGTGTTACCAGAAGGCAAA-3’

SY254下游引物为5’-GAACCGTATCTACCAAAGCAGC-3’

SY254探针为5’-FAM-TCATGAACAATGGGATGTGGGCCCTGT-3’

SY255上游引物为5’-TGCTGAGTTACAGGATTCGGC-3’

SY255下游引物为5’-CTCGTCATGTGCAGCCAC-3’

SY255探针为5’-FAM-CGCAGACGTTCTGAAACTGTGGTGGAGGA-3’

SRY基因上游引物为5’-CCTTCCTTTGCACTGAAAGCTGTA-3’

SRY基因下游引物为5’-ATTCTGGGATTCTCTAGAGCCATCT-3’

SRY基因探针为5’-ROX-AACGTCCAGGATAGAGTGAAGCGACCCA-3’

ZFY基因上游引物为5’-AAGTTTACATAACCACCTGGAGAGC-3’

ZFY基因下游引物为5’-CCACACTCCACACAAATATGAGGAA-3’

ZFY基因探针为5’-CY5-CGCCACCTCTTGGCAGTCCACAGCAA-3’

PCR扩增检测反应条件：37℃5min；95℃5min；95℃15S，60℃60S,40cycles。

3.结果分析：

(1)检测结果可用条件：PCR反应液I和PCR反应液II中待检样本和阳性对照内参基因SRY和ZFY均可检测出荧光信号，曲线拐点清楚，阳性对照SY84位点、SY86位点、SY127位点、SY134位点、SY254位点、SY255位点均可检测出荧光信号，曲线拐点清楚,阴性对照只有ZFY基因有扩增信号，空白对照无扩增信号。所有扩增检测曲线Ct值应处于17至32之间为正常，否则实验失败。

(2)对不同检测通道设置不同颜色，并根据不同通道扩增检测结果判定相应位点是否存在缺失情况。

图2和图3为正常男性样本检测结果，其中SY84位点、SY86位点、SY127位点、SY134位点、SY254位点、SY255位点、SRY和ZFY内参基因均有扩增曲线，阴性对照和空白对照无扩增曲线，阳性对照各检测通道均有扩增曲线，表明该样本检测成功，检测过程无污染，该样本无Y染色体微缺失。

图4和图5为一不育男性样本，其中SY127位点、SY134位点、SY254位点、SY255位点、SRY和ZFY内参基因均有扩增曲线，阴性对照和空白对照无扩增曲线，阳性对照各检测通道均有扩增曲线，表明该样本检测成功，检测过程无污染，该样本Y染色体存在SY84位点、SY86位点微缺失，其中图4显示SY84位点缺失,图5显示SY86位点缺失。

图6和图7为一不育男性样本，其中SY84位点、SY86位点、SY254位点、SY255位点、SRY和ZFY内参基因均有扩增曲线，阴性对照和空白对照无扩增曲线，阳性对照各检测通道均有扩增曲线，表明该样本检测成功，检测过程无污染，该样本Y染色体存在SY127位点、SY134位点微缺失，其中图6显示SY127位点缺失，图7显示SY134位点缺失。

图8和图9为一不育男性样本，其中SY84位点、SY86位点、SY127位点、SY134位点、SRY和ZFY内参基因均有扩增曲线，阴性对照和空白对照无扩增曲线，阳性对照各检测通道均有扩增曲线，表明该样本检测成功，检测过程无污染，该样本Y染色体存在SY254位点、SY255位点微缺失，其中图8显示SY254位点缺失，图9显示SY255位点缺失。

本发明的目的在于提供一种结合Taqman探针的多重荧光PCR方法对Y染色体微缺失进行检测的试剂盒和方法。实时荧光PCR通过对模板的扩增并对每一扩增循环产生的荧光信号进行收集，从而实现对起始模板的定量及定性分析。本发明通过两组反应液即PCR反应液I和PCR反应液II对SY84位点、SY86位点、SY127位点、SY134位点、SY254位点、SY255位点进行定性检测，PCR反应液I和PCR反应液II均同时检测SRY和ZFY内参基因作为质控，以正常男性样本作为阳性对照，以女性样本作为阴性对照，灭菌水作为空白对照以检测体系是否污染现象。

在此说明书中，本发明已参照其特定的实施例作了描述。但是，很显然仍可以作出各种修改和变换而不背离本发明的精神和范围。因此，说明书和附图应被认为是说明性的而非限制性的。