实时荧光PCR检测鸡、鸭源性成分的试剂盒的制作方法

本实用新型涉及一种实时荧光PCR检测鸡源性、鸭源性成分的试剂盒，属于生物检测技术领域。

背景技术：

随着市场经济的发展，肉制品的生产与消费一直保持持续发展的态势。许多不法商贩为了牟取暴利，在羊肉、牛肉加工品中添加鸡肉和鸭肉成分，欺瞒消费者，严重损害了消费者的利益。

目前，国内外应用于检测动物源性成分的技术主要有三种:显微镜学方法、ELISA方法及PCR特异扩增法，在实际检测中应用最多的是PCR特异扩增法，PCR特异扩增法又有普通定性PCR、实时荧光PCR，巢式PCR等。实时荧光PCR技术是基于普通PCR技术基础上发展而来的，在扩增反应体系中添加一个特异性的荧光探针，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，即检测靶核苷酸序列扩增状态，以进行结果判定。它的主要优点是:（1）在闭管状态下进行扩增产物检测，无需PCR产物的后处理，避免了扩增产物污染而致的假阳性，保证了结果的可靠性；（2）探针杂交特异性更强、灵敏度更高，在普通PCR扩增的基础上又多了一条可以与模板互补配对的荧光探针，提高了特异性，荧光信号由仪器自动收集，进一步提高了灵敏度；（3）无酶切位点存在，无需进行酶切、电泳，节省了时间，PCR后无需后续处理，操作更简单快速；（4）安全无污染，DNA测序表明该方法准确性很高。目前针对检测用的各种物品（包括各类检测用液、移液器及与移液器相配的枪头或吸头还没有一个完整的盒体进行收纳，存放比较零散，使用不方便，不安全。

技术实现要素：

本实用新型的目的是提供一种结构简单、使用方便、快捷、安全可靠的实时荧光PCR检测鸡源性、鸭源性成分的试剂盒。

本实用新型的实时荧光PCR检测鸡、鸭源性成分的试剂盒，包括两个独立的盒A和盒B；

所述的盒A包括：盒A盒体和盒A上盖，盒A盒体里面设有固定台，底部设置有盒A减震泡沫垫和1份使用说明书；盒A固定台上开有八个与试剂瓶的外形相吻合的盒A凹槽；每个盒A凹槽内均放置有一个试剂瓶，所述试剂瓶分别为装有反应液及酶的试剂瓶、装有鸡源性引物的试剂瓶、装有鸡源性探针的试剂瓶、装有鸭源性引物的试剂瓶、装有鸭源性探针的试剂瓶、装有鸡源性阳性标准品的试剂瓶、装有鸭源性阳性标准品的试剂瓶、装有ddH₂O的试剂瓶；

所述的盒B包括: 盒B盒体和盒B上盖，盒B盒体里面设有盒B固定台，底部设置有盒B减震泡沫垫，固定台上开有4个凹槽，其中两个凹槽与移液器的形状相吻合，并分别装入第一移液器和第二移液器；另两个凹槽的形状与装入枪头的枪头盒的形状相吻合，并分别装入第一枪头盒和第二枪头盒，第一枪头盒连接有第一枪头盒盖，第二枪头盒连接有第二枪头盒盖。

所述鸡源性阳性标准品为鸡肉样品提取的DNA；所述鸭源性阳性标准品为鸭肉样品提取的DNA。

所述装有反应液及酶的试剂瓶为白色帽的白色PE塑料管，所述装有鸡源性引物的试剂瓶为红色帽的白色PE塑料管，所述装有鸡源性探针的试剂瓶为棕色帽的棕色PE塑料管，所述装有鸭源性引物的试剂瓶为粉色帽的白色PE塑料管，所述鸭源性探针的试剂瓶为橙色帽的棕色PE塑料管，所述鸡源性阳性标准品的试剂瓶为黄色帽的白色PE塑料管，所述装有鸭源性阳性标准品的试剂瓶为绿色帽的白色PE塑料管，所述装有ddH₂O的试剂瓶为蓝色帽的白色PE塑料管；所述第一移液器可调量程范围2-20μL，第二移液器可调量程范围0.2-2μL，第一枪头盒内放置96个已灭菌的2-20μL吸头，第二枪头盒内放置96个已灭菌的0.2-2μL吸头。

所述装有反应液及酶的试剂瓶的装入量为1200μL, 所述装有鸡源性引物的试剂瓶的装入量为55μL，所述装有鸡源性探针的试剂瓶的装入量为55μL，所述装有鸭源性引物的试剂瓶的装入量为55μL，所述装有鸭源性探针的试剂瓶的装入量为55μL；所述装有鸡源性阳性标准品的试剂瓶的装入量为55μL，所述装有鸭源性阳性标准品的试剂瓶的装入量为55μL，所述装有ddH₂O的试剂瓶的装入量为2000μL。

本实用新型的有益效果是：本试剂盒具有良好的灵敏性和特异性，操作方便快捷，检测结果准确可靠，可以简便、准确的鉴别检测鸡源性、鸭源性成分。本试剂盒具有便携性及安全性，本试剂盒是一个整体的盒体结构，包括盒A和盒B共2个部分，盒A盒体和盒B盒体里面设有固定台，固定台上开有与试剂瓶等物品外形相吻合的凹槽，此结构能够起到很好的固定作用。

附图说明

图1是本实用新型具体实施方式中盒A的主视剖视示意图；

图2是本实用新型具体实施方式中盒A去除上盖后的俯视示意图；

图3是本实用新型具体实施方式中盒B的立体结构示意图；

图4是鸡源性检测特异性的示意图；

图5是鸡源性检测灵敏度的示意图；

图6是鸭源性检测特异性的示意图；

图7是鸭源性检测灵敏度的示意图。

具体实施方式

如图1、2所示：本实用新型的实时荧光PCR检测鸡、鸭源性成分的试剂盒包括两个独立的盒A和盒B。

其中盒A包括：盒A盒体1和盒A上盖2，盒A盒体1里面设有纸板材料折叠成的固定台3，底部设置有盒A减震泡沫垫4和1份使用说明书。盒A固定台3上开有八个与试剂瓶的外形相吻合的盒A凹槽5。每个盒A凹槽5内均放置有一个试剂瓶，试剂瓶分别为装有反应液及酶的试剂瓶6、装有鸡源性引物的试剂瓶7、装有鸡源性探针的试剂瓶8、装有鸭源性引物的试剂瓶9、装有鸭源性探针的试剂瓶10、装有鸡源性阳性标准品的试剂瓶11、装有鸭源性阳性标准品的试剂瓶12、装有ddH₂O的试剂瓶13。

如图3所示：其中盒B包括: 盒B盒体14和盒B上盖15，盒B盒体14里面设有盒B固定台16，底部设置有盒B减震泡沫垫24，固定台16上开有4个凹槽23，其中两个凹槽23与移液器的形状相吻合，并分别装入第一移液器17和第二移液器18；另两个凹槽23的形状与装入枪头的枪头盒的形状相吻合，并分别装入第一枪头盒19和第二枪头盒21，第一枪头盒19连接有第一枪头盒盖20，第二枪头盒21连接有第二枪头盒盖22。

鸡源性阳性标准品为鸡肉样品提取的DNA；鸭源性阳性标准品为鸭肉样品提取的DNA。

装有反应液及酶的试剂瓶6为白色帽的白色PE塑料管，装有鸡源性引物的试剂瓶7为红色帽的白色PE塑料管，装有鸡源性探针的试剂瓶8为棕色帽的棕色PE塑料管，装有鸭源性引物的试剂瓶9为粉色帽的白色PE塑料管，鸭源性探针的试剂瓶10为橙色帽的棕色PE塑料管，鸡源性阳性标准品的试剂瓶11为黄色帽的白色PE塑料管，装有鸭源性阳性标准品的试剂瓶12为绿色帽的白色PE塑料管，所述装有ddH₂O的试剂瓶13为蓝色帽的白色PE塑料管；第一移液器17可调量程范围2-20μL，第二移液器18可调量程范围0.2-2μL，第一枪头盒19内放置96个已灭菌的2-20μL吸头，第二枪头盒21内放置96个已灭菌的0.2-2μL吸头。

装有反应液及酶的试剂瓶6的装入量为1200μL, 装有鸡源性引物的试剂瓶7的装入量为55μL，装有鸡源性探针的试剂瓶8的装入量为55μL，装有鸭源性引物的试剂瓶9的装入量为55μL，装有鸭源性探针的试剂瓶10的装入量为55μL；装有鸡源性阳性标准品的试剂瓶11的装入量为55μL，装有鸭源性阳性标准品的试剂瓶12的装入量为55μL，装有ddH₂O的试剂瓶13的装入量为2000μL。

利用本实用新型的试剂盒，对样品DNA进行实时荧光PCR检测，包括如下步骤：

1）样品DNA的提取与纯化：提取纯化样品DNA以便进行实时荧光PCR 检测。

2）建立实时荧光PCR扩增反应体系：

DNA聚合酶反应液 15μL

引物 2μL

探针 2μL

ddH₂O 5μL

DNA模板 1μL

总体积为 25μL

3）按照仪器操作要求选择相应的荧光通道，设置扩增反应条件95 ℃20s, 1个循环；95℃ 5s, 60℃31s, 40个循环，记录样品反应的Ct值。

4）所述确定质量控制指标是：

空白对照：以ddH₂O为模板，按照2）和3）所述条件，进行实时荧光PCR反应，检测Ct值大于或等于40；阴性对照：以非鸡源性、鸭源性物种基因组DNA为模板，按照2）和3）所述条件，进行实时荧光PCR反应，检测Ct值大于或等于40；阳性对照：以阳性标准品（9）为模板，按照2）和3）所述条件，进行实时荧光PCR反应，检测Ct值小于或等于34；

5）结果判定：

待测样品鸡源性或鸭源性成分因检测Ct值大于或等于40，阴性对照、阳性对照和空白对照结果正常者，判定该样品未检出鸡源性或鸭源性成分；

待测样品鸡源性或鸭源性成分检测Ct值小于或等于36，阴性对照、阳性对照和空白对照结果正常者，判定该样品检出鸡源性或鸭源性成分；

待测样品鸡源性或鸭源性成分检测Ct值在36-40之间，重做实时荧光PCR扩增，再次扩增后结果Ct值大于40，且阴性对照、阳性对照和空白对照结果正常，判定该样品未检出鸡源性或鸭源性成分；再次扩增后结果Ct值仍小于40，且阴性对照、阳性对照和空白对照结果正常，判定该样品检出鸡源性或鸭源性成分。每个试样必须有2个平行实验。

本实用新型鸡源性检测特异性结果说明：实时荧光PCR对几种动植物的DNA扩增，结果只有鸡被检测出，形成扩增曲线，其他（牛、羊、猪、马、狗、鱼、鸭、大豆、玉米）则没有特异性扩增曲线，表明本研究所设计的引物及探针特异性比较强，结果如图4。

本实用新型鸡源性检测灵敏度结果说明：通过对不同含量的鸡基因组DNA 模板(（100%、1%、0.1%、0.01%、0.001%、0.0001%）行PCR检测，得到本方法的检出限为0.001%，结果如图5。

本实用新型鸭源性检测特异性结果说明：实时荧光PCR对几种动植物的DNA扩增，结果只有鸭被检测出，形成扩增曲线，其他（牛、羊、猪、马、狗、鱼、鸡、大豆、玉米）则没有特异性扩增曲线，表明本研究所设计的引物及探针特异性比较强，结果如图6。

本实用新型鸭源性检测灵敏度结果说明：通过对不同含量的鸭基因组DNA 模板(（100%、1%、0.1%、0.01%、0.001%、0.0001%）行PCR检测，得到本方法的检出限为0.001%，结果如图7。