DNA合成的方法与流程

本发明涉及用于生产包含至少一个发夹的脱氧核糖核苷酸(dna)的体外无细胞方法、对应的dna产物及其用途、以及在本发明的方法中有用的寡核苷酸和试剂盒。
背景技术：
：用于从开始模板扩增闭合线性dna的体外无细胞方法已经描述在wo2010/086626和wo2012/017210中。希望提供其它方法，其可以合成闭合线性dna，且其也允许合成其它类型的包含一个或多个发夹的dna分子。技术实现要素：本发明提供了用于合成包含一个或更多个发夹的dna分子的方法，所述方法不需要使用任何微生物步骤来提供开始模板。所述方法也允许合成包含一个或多个发夹的环形单链dna或双链dna。这些产物包括这样的dna分子：发明人认为其具有以前在本领域中没有描述的结构，且其具有用于宽范围的应用的优点。根据本发明，在体外无细胞方法中进行包含发夹的dna分子的合成，所述方法从可以在所述方法的全部或部分中固定化至固体支持物的寡核苷酸开始。使用可以化学地合成的短模板寡核苷酸酶促地延伸所述寡核苷酸以合成所需dna序列，从而避免使用通常需要在细菌中增殖的编码整个所需序列的大开始模板。一旦合成了所需dna序列，它就可以以包含一个或多个发夹的单链或双链形式从固体支持物释放。有利地，用于在本发明的dna分子中提供发夹的序列也会提供在dna合成结束后合成的dna从固体支持物的酶促释放方式。将一种寡核苷酸固定化到固体支持物上并延伸以引入所需dna序列从而建立第一dna链，该链进一步包含在固体支持物近侧的原核端粒酶(protelomerase)靶序列的第一部分。还在延伸的第一链中或在互补的第二链上引入原核端粒酶的靶序列的第二部分，该第二部分与其第一部分互补。然后使用所述原核端粒酶的靶序列的第一部分和第二部分在固体支持物的近侧重新建立完整原核端粒酶靶序列，使得与原核端粒酶接触然后可以从固体支持物释放合成的dna，并在所述从固体支持物释放的dna分子中产生发夹。在其它方面，本发明提供了通过建立完整原核端粒酶靶序列或能够在合成的dna链的远侧延伸区域中形成发夹的其它序列而向产生的dna分子添加第二闭合末端发夹。这样的能够形成发夹的序列可以包括邻近互补序列或被非互补的序列隔开的两个互补序列。在其它方面，本发明提供了通过建立完整原核端粒酶靶序列或能够在合成的dna链中形成发夹的其它序列而向产生的单链dna分子添加第三、第四、第五或更多闭合末端发夹。根据本发明合成的dna分子可以用于多种应用，包括医学和诊断用途，以及用作其它dna扩增方法的开始模板。更详细地，本发明提供了：在第一方面，用于生产包含所需dna序列的脱氧核糖核酸(dna)的体外无细胞方法，所述方法包括：(a)使固定化在固体支持物上的寡核苷酸在有至少一种dna聚合酶存在下在促进所述固定化的寡核苷酸的模板依赖性延伸的条件下与一系列在序列上重叠的模板寡核苷酸接触以产生第一dna链，该链包含所需dna序列且进一步包含所述在固体支持物近侧的原核端粒酶靶序列的第一部分；(b)在(a)所产生的所述第一dna链的远侧部分中或在第二或其它链上引入包含(a)的原核端粒酶靶序列的第二部分的dna序列，使得所述原核端粒酶靶序列的第一部分和第二部分由此建立在所述固体支持物近侧的(a)的原核端粒酶的完整靶序列；和(c)使在所述固体支持物近侧的所述完整原核端粒酶靶序列在促进所述靶序列的切割和重连的条件下与原核端粒酶接触，由此从固定释放产生的dna。在一个实施方案中，所述原核端粒酶靶序列的第一部分和第二部分是在序列上互补的。在另一个方面，本发明涉及包含固定化的寡核苷酸的固体支持物，所述寡核苷酸包含原核端粒酶的靶序列的第一部分。在另一个方面，本发明涉及试剂盒，其包含含有原核端粒酶的靶序列的第一部分的寡核苷酸、一系列模板寡核苷酸和任选的关于在本发明的方法中使用的说明书。在第四方面，本发明涉及包含一个或多个发夹的单链环形dna，所述发夹中的至少一个包含原核端粒酶的靶序列的一部分。在第五方面，本发明涉及包含第一发夹和第二发夹的线性共价闭合双链dna，所述第一发夹包含第一原核端粒酶的靶序列的一部分，所述第二发夹具有不与所述第一发夹互补的序列。在一个实施方案中，这由包含第二原核端粒酶的靶序列的一部分的第二发夹实现，其中所述第一和第二原核端粒酶是不同的。在一个替代实施方案中，这由包含能够形成发夹的序列的第二发夹实现。这样的序列可以包括能够彼此退火的邻近的或分离的互补序列。在第六方面，本发明涉及用于扩增dna的体外无细胞方法，所述方法包括使单链环形dna模板在有一种或多种引物存在下在促进所述模板扩增的条件下与至少一种dna聚合酶接触，所述dna模板包含含有原核端粒酶的靶序列的一部分的发夹。在第七方面，本发明涉及用于生产线性共价闭合脱氧核糖核酸(dna)的体外无细胞方法，所述方法包括：(a)使包含第一发夹和第二发夹的线性共价闭合双链dna在促进dna扩增的条件下与dna聚合酶接触，所述第一发夹包含第一原核端粒酶的靶序列的一部分，所述第二发夹包含第二原核端粒酶的靶序列的一部分，和(b)使所述扩增的dna在促进线性共价闭合dna的产生的条件下与所述第一和第二原核端粒酶接触，其中所述第一和第二原核端粒酶是不同的。在第八方面，本发明涉及包含至少一个发夹的单链环形dna，所述发夹含有原核端粒酶的靶序列的一部分，所述dna用于用在治疗或诊断中，特别是用于用在治疗人或动物体的方法中，或用在在人或动物体上实施的诊断方法中。在第九方面，本发明涉及包含至少一个发夹的线性共价闭合双链dna，所述发夹包含第一原核端粒酶的靶序列的一部分，且其中第二发夹的序列不与第一发夹的序列互补，所述dna用在治疗或诊断中，特别是用于用在治疗人或动物体的方法中，或用在在人或动物体上实施的诊断方法中。在一个实施方案中，所述第二发夹包含第二原核端粒酶的靶序列的一部分，其中所述第一和第二原核端粒酶是不同的。在一个替代实施方案中，所述第二发夹由邻近的或分离的互补序列提供。在第十方面，本发明涉及治疗人或动物体的方法，所述方法包括给有此需要的人或动物施用治疗有效量的包含发夹的单链环形dna，所述发夹含有原核端粒酶的靶序列的一部分。在第十一方面，本发明涉及治疗人或动物体的方法，所述方法包括给有此需要的人或动物施用治疗有效量的包含至少一个发夹的线性共价闭合双链dna，所述发夹包含第一原核端粒酶的靶序列的一部分，且其中第二发夹的序列不与第一发夹的序列互补。在一个实施方案中，所述第二发夹包含第二原核端粒酶的靶序列的一部分，其中所述第一和第二原核端粒酶是不同的。在一个替代实施方案中，所述第二发夹由邻近的或分离的互补序列提供。在从属权利要求中限定了任选的特征。下面描述了其它优点。附图说明图1a至1c：描绘了可以作为开始和/或终止引物和模板起作用的各种单链寡核苷酸的实例的图示。每个以线性形式显示或具有在原核端粒酶靶序列的部分中形成的发夹(101或107)，且具有游离的3’(102)和5’(103)末端。图1a描绘了可以用作开始引物或用作末端寡核苷酸模板和引物的寡核苷酸(100)。所述寡核苷酸含有原核端粒酶靶序列的部分(101)，其侧接不会形成原核端粒酶靶序列的序列部分的3’序列(104)和5’序列(105)。寡核苷酸的整个序列(106)可以包括被设计成与模板寡核苷酸或合成的链互补的区域。图1b描绘了末端寡核苷酸引物(110)。在该实施例中，这含有原核端粒酶靶序列的部分(107)，该部分包含与在图1(a)中显示为(101)的序列不同且非互补的序列。该序列侧接没有形成原核端粒酶靶序列的部分的3’序列(109)和5’序列(111)。3’侧翼序列也含有具有与合成的链非互补的序列的区域(108)，而显示为112的寡核苷酸引物(110)的剩余序列可以在序列上与合成的链互补。图1c描绘了可以作为开始引物或模板，或末端寡核苷酸或模板起作用的寡核苷酸(120)。它包含可能含有原核端粒酶靶序列的部分的发夹结构(220)，其侧接3’序列(114)和5’序列(113)，所述侧翼序列没有形成原核端粒酶靶序列的部分，如果这存在的话。3’侧翼序列的区域可以包含不与5’侧翼序列互补且与模板寡核苷酸或合成的链互补的区域(115)。图2(图2a和2b)描绘了将寡核苷酸固定化至固体支持物的不同方式。图2a描绘了间隔分子(122)的应用，所述间隔分子经由合适的化学接头(分别是123和124)连接至固体支持物(121)和寡核苷酸(100)的5’末端(103)。图2b描绘了一种替代排列，其中间隔分子(122)经由化学接头连接至寡核苷酸(120)5’侧翼序列(113)。图3(图3a至3j)描绘了在本发明的一种方法中涉及的一些步骤的一个实施例，其中将寡核苷酸(100a)经由间隔分子(122)固定化至固体支持物(121)并与dna聚合酶一起加入一系列模板寡核苷酸(130)，以便延长所述寡核苷酸。延伸结束以后去除模板寡核苷酸，并加入另外的模板寡核苷酸直到已经获得所需序列(133)。在此时，加入作为模板和末端引物起作用的寡核苷酸(100b)，并合成dna的互补第二链(136)。一旦已经合成双链序列，使用原核端粒酶(未显示)使产物(140)从固体支持物释放并在固体支持物(138)上留下副产物。图3a显示了在有模板寡核苷酸(130)存在下包含经由间隔物(122)固定化至固体支持物(121)的原核端粒酶靶序列的第一部分(101a)的寡核苷酸(100a)。图3b显示了经由互补序列区域(131)结合至固定化的寡核苷酸(100a)的模板寡核苷酸(130)。模板寡核苷酸的5’末端悬突至固定化的寡核苷酸的3’末端，且可以充当用于延伸固定化的寡核苷酸(100a)的3’末端(102a)的模板。图3c显示了一旦dna聚合酶(未显示)已经催化与模板寡核苷酸序列(130)互补的序列延伸以后固定化的寡核苷酸(100a)在3’末端(102a)处的延伸。寡核苷酸链或第一链具有延伸的序列(132)，该序列与模板寡核苷酸的区域(130)互补。图3d显示了一旦已经去除模板寡核苷酸以后延伸的序列(132)。图3e显示了模板寡核苷酸的重复应用、延伸(使用dna聚合酶)和去除以后第一链(133)的延伸。第一链(133)的合成的序列与用于构建它的模板寡核苷酸互补，按照使用它们的次序。图3f显示了作为模板和末端引物起作用的寡核苷酸(100b)的存在，所述寡核苷酸(100b)包含原核端粒酶靶序列的第二部分(101b)。图3g显示了寡核苷酸(100b)经由互补序列区域(134)与第一链(133)的结合。两个3’末端(102b和141)都可用于通过dna聚合酶(未显示)实现的延伸。图3h显示了通过dna聚合酶(未显示)合成的与末端引物/模板互补的序列，互补序列在这里以短划线显示。与寡核苷酸(100b)互补的序列显示为短划线(135)，且与第一链(133)互补的序列也显示为短划线(136)。互补序列也被称作互补第二链(136)。图3i显示了第一链(133)和互补的第二链(136)。原核端粒酶靶序列的第一部分和第二部分(101a和101b)已经被dna聚合酶用作模板以形成两个完整原核端粒酶靶序列(137a和137b)。图3j显示了在图3i的第一链(133)和互补的第二链(136)上使用原核端粒酶的结果。完整原核端粒酶靶位(137a和b)被切割和连接，从而形成释放的产物(140)，其在这里显示为闭合线性dna，剩下与固体支持物(138)连接的副产物和另一种游离副产物(139)，后者是具有内部发夹和游离3’和5’末端的单链dna。图4(图4a至4f)描绘了经由关键步骤a至f生产共价闭合双链或单链dna的本发明的方法的另一个实施例。其它步骤未显示。如果创立的发夹结构不包括如在图4d中所示的单链dna环，将产生双链dna。但是，如果在图4d中的发夹(185)包括较长的插入单链序列，这可以是所述分子的主要段，且可能存在小量的双链序列，如在图4h中所示。图4a显示了包括原核端粒酶靶序列的第一部分(101a)的固定化的寡核苷酸(100a)，其经由与固体支持物(121)连接的间隔分子(122)固定化。所述固定化的寡核苷酸已经经由模板依赖性延伸进行延伸，以产生第一链(133)。显示了在3’末端(141)附近与第一链(133)结合的模板寡核苷酸(130)，包括序列段(181)。显示了模板寡核苷酸的一种示例性序列(183)。所述模板寡核苷酸结合在第一链的3’末端(141)。所述模板寡核苷酸的剩余部分悬突至第一链的3’末端。图4b描绘了一旦dna聚合酶已经使用模板寡核苷酸(130)催化第一链(133)的3’末端(141)的延伸以建立互补序列(短划线)以后的相同结构。该互补序列包括与模板寡核苷酸(130)中的示例性序列(183)互补的序列(184)。图4c显示了去除模板寡核苷酸(130)后与图4b相同的结构。将较早的模板寡核苷酸引入在第一链(133)中的序列(181)，所述序列与图4b的模板寡核苷酸引入的序列(184)互补。第一链因而包括自互补序列。第一链(133)的远侧3’末端可以向后成环，且互补序列(181和184)可以退火以形成双链体。如这里所示，在互补序列(181和184)之间不存在插入单链序列。图4d描绘了具有两个退火的互补序列(181和184)的图4c的结构。图4e显示了使用dna聚合酶延伸图4d中所示的第一链的3’末端(141)的结果。第一链(133)的在固体支持物和发夹之间的段充当第一链的第二段的模板(186-短划线)，直到dna到达间隔分子(122)。使用第一部分作为模板(101a)合成原核端粒酶靶序列的第二部分(101b)，从而导致整个原核端粒酶靶序列(137)的形成。图4f证实了向图4e的结构添加原核端粒酶的结果。释放闭合线性dna产物(187)，并使副产物(188)依然固定化至固体支持物。应当指出，所述闭合线性dna在一个末端处封闭，原核端粒酶靶序列的部分在一个末端(101)处，模板衍生的发夹在另一个末端(189)处。图4g描绘了一种替代实施方案，其中序列段(181)没有存在于第一链(133)的3’末端处，且末端模板寡核苷酸(130)没有与其退火。所述模板寡核苷酸结合至互补序列段(182)。图4h描绘了通过延伸图4g的第一链的3’末端而得到的结构。插入序列(185)形成在互补序列(181和184)之间，其作为任意特定长度的dna单链成环伸出。图5(图5a至5e)描绘了本发明的方法的另一个实施例。将寡核苷酸(120a)固定化，并使用多轮模板寡核苷酸依赖性的延伸来延伸3’末端(102)以形成第一链(133)。加入包含发夹(225)的最终模板寡核苷酸(120b)，其充当模板以在第一链的远侧3’末端中引入序列，所述序列由于自互补内部序列而能够形成发夹。第一链(211)的互补第二段的合成使用第一链的第一段作为模板。一旦双链序列是完整的，原核端粒酶(未显示)在完整原核端粒酶靶位(137)处起作用以切割所述序列并重新连接建立的游离末端，从而释放产物(212)和副产物(143)。图5a显示了延伸的固定化的寡核苷酸(120a)，其包括形成第一链(133)的原核端粒酶靶序列的第一部分(220a)，包括发夹结构(225)的寡核苷酸(120b)与该部分结合，其在该实施例中不是原核端粒酶靶序列的部分。图5b显示了图5a的结构，其中模板寡核苷酸(120b)处于展开的单链形式，且dna聚合酶(未显示)已经催化使用模板(120b)对第一链(133)的3’末端的延伸，从而导致显示为短划线的序列(210)的合成。图5c显示了图5b的结构，其中模板寡核苷酸(120b)被去除，且合成的序列(210)由于内部自互补序列形成发夹(未显示)。延伸的第一链(133)的3’末端(141)因而可用于延伸。图5d显示了图5c的结构，一旦dna聚合酶(未显示)已经催化使用第一链(133)的第一段作为模板对3’末端(141)的延伸，产生第一链(211)的互补第二段。第一链的第二段包括原核端粒酶靶序列的部分(220b)，从而形成在固体支持物近侧的整个原核端粒酶靶序列(137)。图5e描绘了向图5d的结构添加原核端粒酶(未显示)的结果。形成产物(212)以及副产物(143)，所述产物在该情况下是一种闭合线性dna，其一个末端用原核端粒酶靶序列的部分(220d)封闭，且发夹结构在另一端(225)。图6(图6a至6e)描绘了经由关键步骤a–e对共价闭合单链dna分子的合成。其它步骤未显示。图6a显示了包括原核端粒酶靶序列的第一部分(101a)的固定化的寡核苷酸(100a)，其经由连接至固体支持物(121)的间隔分子(122)固定化。所述固定化的寡核苷酸已经经由多轮模板依赖性延伸进行延伸以产生第一链(133)。显示了包括原核端粒酶靶序列的第二部分(101b)的第二寡核苷酸(100b)，其在3’末端(141)附近结合至第一链(133)。为每种寡核苷酸(100a/b)显示了原核端粒酶靶序列的部分(101a/b)的3’和5’侧接区域(104a/b和105a/b)中的示例性序列。图6b描绘了图6a的结构，在dna聚合酶已经催化3’末端(141)的延伸以产生与寡核苷酸模板(100b)互补的序列(135-短划线)后。形成了完整原核端粒酶靶序列(137)。模板寡核苷酸(100b)的3’末端(102b)也将被dna聚合酶延伸，除非它被修饰以阻止延伸，或它包括不与第一链互补的序列段，诸如在图1b中所示的结构。图6c描绘了一旦除去寡核苷酸模板(100b)后如在图6b中所示的寡核苷酸(133)的第一链。箭头描绘了第一链(133)的远侧3’末端(141)的向后折叠，使得3’末端紧密靠近固体支持物(121)。图6d描绘了在第一链(133)的近侧端部处的互补侧翼序列(104a和105a)与在第一链(133)的远侧端部处的侧翼序列(151和152)的退火，以形成双链dna双链体和完整原核端粒酶靶序列(137)。原核端粒酶靶序列的远侧部分形成原核端粒酶靶序列的第二部分。由于第一链(133)的剩余部分的序列不是互补的，它保持以单链形式作为成环的结构(153)。图6e描绘了将原核端粒酶(未显示)应用于图6d的结构的结果。将整个原核端粒酶靶序列切割并连接游离末端，从而释放在固体支持物上的具有单个发夹(225)的共价闭合单链dna(155)和副产物(154)。图7(图7a至7e)描绘了经由关键步骤a-e生产共价闭合单链dna的替代方法。其它步骤未显示。图7a显示了包含原核端粒酶靶序列的第一部分(101a)的固定化的寡核苷酸(100a)，其经由连接至固体支持物(121)的间隔分子(122)固定化。所述固定化的寡核苷酸已经经由模板依赖性延伸进行延伸，以产生第一链(133)。显示了在3’末端(141)附近与第一链(133)结合的模板寡核苷酸(130)。显示了模板寡核苷酸中的示例性序列(161)。模板寡核苷酸的3’(160)部分与第一链(133)中的互补序列退火，且单链模板段(164)悬突至包括示例性序列(161)的第一链的3’末端。图7b描绘了图7a的结构，在dna聚合酶已经催化第一链(133)的3’末端(141)的延伸，以产生与寡核苷酸模板(130)互补的序列(短划线)，包括与示例性序列(161)互补的序列(162)后。图7c描绘了已经去除模板寡核苷酸的如在图7b中所示的寡核苷酸(133)的第一链。箭头描绘了第一链(133)的3’末端(141)的向后折叠，使得远侧3’末端紧密靠近固体支持物(121)和固定化的寡核苷酸的近侧端部(100a)。图7d描绘了在原核端粒酶靶序列的第一部分(101a)的5’侧接区域(104a)中的互补序列与第一链(133)的远侧端部上的序列(162)的退火，从而形成双链体。由于第一链(133)的剩余部分的序列不是互补的，它保持以单链形式作为成环的结构(153)。图7e描绘了图7d的结构，其中dna聚合酶已经催化使用寡核苷酸(100a)作为模板对第一链(133)的3’末端(141)的延伸以产生互补序列(166-短划线)，以产生原核端粒酶靶序列的第二部分(101b)。构建整个原核端粒酶结构(137)。应当指出，该结构与图6d的结构相同，并且当应用原核端粒酶时产生的产物的结构与在图6e中所示相同。图8(图8a至8f)描绘了经由关键步骤a至f生产共价闭合单链dna的本发明的方法的一个实施例。其它步骤未显示。图8a显示了包括原核端粒酶靶序列的第一部分(101a)的固定化的寡核苷酸(100a)，其经由连接至固体支持物(121)的间隔分子(122)固定化。所述固定化的寡核苷酸已经经由模板依赖性延伸进行延伸，以产生第一链(133)。显示了在3’末端(141)附近结合至第一链(133)的模板寡核苷酸(110)。这包括原核端粒酶靶序列的第一部分(107a)，该部分不与固定化的寡核苷酸的部分(101a)互补。仅模板寡核苷酸的侧翼序列(109)与第一链(133)的互补序列退火，模板寡核苷酸(108)的3’段的剩余部分不与第一链(133)互补且不退火。单链模板段保留，包括原核端粒酶靶序列的部分(107a)和5’侧翼序列(111)。图8b描绘了图8a的结构，其中dna聚合酶已经催化第一链(133)的3’末端(141)的延伸，以产生与模板寡核苷酸(110)互补的序列(171-短划线)。合成原核端粒酶靶序列的第二部分(107b)，从而创立整个原核端粒酶靶序列(200)。图8c显示了应用对在图8b中创立的整个原核端粒酶靶序列(200)特异的原核端粒酶的结果。释放副产物(172)，其为可以形成发夹结构的dna的单链碎片(piece)。第一链(133)现在包括发夹结构(230)。dna链的3’末端现在是来自寡核苷酸(110)的非互补序列段(108)，且这形成延伸的第一链的非互补第二段的起点。应该理解，可以在任意合适的时间应用相应原核端粒酶。图8d描绘了使用先前所述的模板依赖性技术延伸被延伸的第一链(173)的第二段的3’末端(141)的结果。设计模板，使得延伸的第一链(173)的第二段的末端序列(174)与固定化的寡核苷酸(100a)互补，且包括原核端粒酶靶序列的第二部分(101b)、3’侧接区域(175)和5’侧接区域(176)，它们与固定化的寡核苷酸(100a)互补。图8e显示了在延伸的第一链(173)的第二段中的序列(175、176和101b)和在第一链(133)的第一段中的序列(104a、105a和101a)的退火。创立整个原核端粒酶靶序列(137)作为并置的第一部分(101a)和第二部分(101b)。显示的核苷酸序列仅仅是示例性的。图8f描绘了应用对完整原核端粒酶靶序列(137)特异的原核端粒酶的结果。释放单链环形结构(177)。该环形结构可以在所述环周围的两个点(179和180)处形成发夹结构，但是也可以在没有这些折叠的情况下存在(未显示)。被发夹结构隔开的两条链(133和173)是非互补的，且不会退火以形成双链结构或双链体。副产物(178)保持固定化至固体支持物。图9描绘了根据本发明的方法可以合成的单链dna(240)的示例性结构。该结构是dna的单链，包括被发夹结构(231-236)分开的单链区段(241-246)。根据本发明的任意方法可以引入发夹。图10描绘了根据本发明的一个方面的固定化的寡核苷酸。原核端粒酶靶序列的第一部分(在这里显示了原核端粒酶teln的原核端粒酶靶序列的一条链-seqidno.17)(101a)侧接3’序列(104a)和5’序列(105a)。侧翼序列的顺序是无关的，且显示为x和x’以将它们与原核端粒酶靶序列的部分(101a)区分开。5’侧翼序列的5’末端(105a)连接至固定化至固体支持物(121)的间隔分子(122)。显示了形成原核端粒酶靶序列的部分(101a)的残基之间的碱基配对，尽管假定在发夹尖部处的碱基配对可能由于结构变形而被破坏。图11a描绘了模板依赖性延伸已经发生以后图10的结构。已经延伸第一链(133)，且已经合成第二互补链(136)。第二链(136)的延伸包括使用原核端粒酶靶序列的第一部分(101a)和侧接区域(104a和105a)作为模板。这导致第二链(136)中互补序列的合成，其包括3’和5’侧接区域(104b和105b)和原核端粒酶靶序列的第二部分(101b)。因而，使用固定化的寡核苷酸(100a)作为模板通过dna聚合酶的作用形成整个原核端粒酶靶序列(137)。图11b显示了没有发夹结构的线性形式的图11a的序列。可以看出，原核端粒酶靶序列的第一部分(101a)具有与原核端粒酶靶序列的第二部分(101b)互补的序列。在原核端粒酶靶序列(190)的中心处(在该实施例中)是原核端粒酶将切割所述序列的位点，该位点是在telo序列(201)的中心。完整原核端粒酶靶序列(137)由酶teln的telrl组成。显示了形成telr(203)和tell(202)的序列。图11c显示了原核端粒酶催化反应以后对图11a/11b的序列发生的内容。所述序列在指示的点(190)处被切割，且每个被切割的末端用相对链重新连接以形成两个单独的发夹结构。在该情况下，使副产物(191)与固体支持物退火并释放产物(192)，所述产物由于原核端粒酶的作用而具有封闭末端。图12显示了2％琼脂糖凝胶的凝胶照片，其显示了来自实施例1的结果。照片都包括在左手侧的分子量量表(泳道1)和在底部的泳道中泳动的产物的指示。teln＝用teln消化的滚环扩增(rca)的产物，teln/exoiii＝用teln和exoiii消化的rca产物。图13显示了用于选择原核端粒酶的完整天然靶序列，显示了互补dna的两条链的序列。显示了靶序列：seqidno:15的序列(大肠杆菌(e.coli)n15teln原核端粒酶)，seqidno:16的序列(克雷伯氏菌属(klebsiella)噬菌体phik02原核端粒酶)，seqidno:17的序列(耶尔森氏菌属(yersinia)噬菌体py54原核端粒酶)，seqidno:18的序列(弧菌属(vibrio)噬菌体vp882原核端粒酶)，seqidno:19的序列(布氏疏螺旋体(borreliaburgdorferi)原核端粒酶)，seqidno:20的序列(根癌土壤杆菌(agrobacteriumtumefaciens)tela原核端粒酶)和seqidno:21的序列(副溶血弧菌(vibrioparahaemolyticus)质粒vp58.5原核端粒酶)。在已知相应原核端粒酶的最小序列长度要求的情况下，这已经通过将所述序列涂成灰色来指示，尽管所述酶可能接受在该核心靶序列内的一些序列变异。用粗体和下划线表示的核苷酸指示回文对称序列中的不完整性。穿过序列的垂直线代表完美反向序列的中心以及原核端粒酶切割和连接靶序列的点。图14是在实施例2中产生的凝胶的照片。凝胶具有5个有标记的泳道，dsdna是全长线性dna，teln是用teln处理过的dsdna，vp58.5是可替换地用vp58.5处理过的dna，同时二者指示应用两种原核端粒酶。t5代表加入t5外切核酸酶以后的样品。凝胶因而显示了从通过模板引物延伸构建dsdna至用一种或两种原核端粒酶切割的反应的行进，并最终使用t5外切核酸酶提纯以去除任何不希望的开放片段。照片是暴露于490nm的蓝光的凝胶，以仅显示荧光标记的分子。箭头指示描绘了尚未引入全长产物中的dntp和荧光标记的寡核苷酸的带。图15是与图14相同的凝胶的照片，例外是它已经用gelred染色并暴露于300nm的紫外线。这显示了在实施例2的反应过程中产生的所有寡核苷酸和片段。图16是凝胶的照片，其中已经执行用gelred染色并暴露于在300nm的紫外线以显示存在于10％tbe凝胶中的所有寡核苷酸和dna。显示了10个泳道，包括分子梯度(lr)以允许确定dna/寡核苷酸的近似分子量。所述标记与用于图14的那些一致。通过在凝胶照片上标记的带的存在，证实闭合线性dna(dbdna)的产生。图17a至17c描绘了在实施例4中使用的方法的示意图。将寡核苷酸连接至5’标签(301)且可以包括原核端粒酶靶位的部分(101a)以及被插入序列(133)分开的两个反向互补序列(302和303)。这显示在图17a上。图17b描绘了互补序列(302和303)的向后成环和退火，剩下游离3’末端(304)可用于使用第一链作为模板的延伸。图17c表明，整个原核端粒酶靶位通过dna聚合酶(137)的作用来合成，这允许原核端粒酶在该点切割分子，释放5’标签(301)，并剩下具有一个原核端粒酶衍生的发夹的环形单链dna结构。图18a是使用实施例4得到的凝胶的照片。这显示了使用dna聚合酶延伸和补全原核端粒酶位点的温度循环反应以后在指示的不同浓度的dna寡核苷酸dna-t和dna-v。凝胶的左手侧(lh)显示了成环的延伸的dna-t和dna-v(都是159个核苷酸)，其尚未暴露于它们的相应原核端粒酶或t5外切核酸酶。凝胶的右手侧(rh)显示了成环的延伸的dna-t和dna-v，其已经仅暴露于t5外切核酸酶。这攻击了具有游离末端的dna结构，因而没有看到结构。图18b是使用实施例4得到的凝胶的照片。这显示了使用dna聚合酶延伸和补全原核端粒酶位点的温度循环反应以后在指示的不同浓度的dna寡核苷酸dna-t和dna-v。凝胶的左手侧(lh)显示了已经用相应原核端粒酶(对于dna-t而言为teln，对于dna-v而言为vp58.5)处理过的成环的延伸的dna-t和dna-v。这会催化切割/连接，从而产生指示的环形dna产物和副产物。凝胶的右手侧(rh)显示了已经暴露于相应原核端粒酶且然后暴露于t5外切核酸酶的成环的延伸的dna-t和dna-v。具体实施方式本发明的方法利用寡核苷酸作为聚合酶介导的延伸的基础来产生单链dna，其然后可以转化成双链dna。可以在聚合酶介导的延伸开始之前将寡核苷酸固定化至固体支持物，或者可以在溶液中的聚合酶介导的延伸以后将寡核苷酸固定化。如果聚合酶介导的延伸在固定化之前在溶液中发生，优选的是发生1-5轮延伸，即在聚合酶介导的延伸中使用1-5种单独的模板寡核苷酸。在所述方法中在适当的点将寡核苷酸固定化。通过与原核端粒酶接触，单链dna或双链dna以包含至少一个发夹的封闭形式从固体支持物释放。本发明的方法在体外无细胞环境中进行。因而，所述方法在没有宿主细胞存在下进行，且通常包含经纯化的酶组分的应用。因此，dna的合成和通过原核端粒酶进行的加工通常如下进行：在合适的容器中在溶液中接触反应组分。特定组分以可固定化的或固定化的形式提供，所述形式包括用于连接至固体支持物的手段(means)。发夹是由于多核酸的单链的邻近互补序列之间的碱基配对而形成的多核酸(诸如dna或rna)中的结构。所述邻近互补序列可以被几个核苷酸(例如1-10个或1-5个核苷酸)分开。其一个实施例描绘在图10中。如果在互补序列的两段之间包括非互补序列的环，这形成发夹环。所述环可以具有任意合适的长度。固定化的寡核苷酸本发明的固定化的寡核苷酸或开始引物能够被延伸。所述固定化的寡核苷酸可以化学地合成，或可以通过最初(较短)引物的模板依赖性延伸(例如在溶液中)来制备。因而可以将寡核苷酸固定化至固体支持物以进行其它模板依赖性延伸，并允许要从固体支持物释放的所需序列的产生的完成。不同寡核苷酸的实例显示在图1中，且不同固定化点描绘在图2中。在某些实施方案中，要在固体支持物上延伸的固定化的寡核苷酸包含原核端粒酶的靶序列的第一部分。所述原核端粒酶的靶序列的第一部分可以源自任何原核端粒酶靶序列。设计在开始引物中包括的原核端粒酶的靶序列的第一部分，使得与如下面讨论所提供的原核端粒酶的靶序列的第二互补部分组合，可以形成完整原核端粒酶序列。技术人员能够将原核端粒酶靶序列分成第一部分和第二部分，所述部分能够在并置在一起时重新建立完整靶序列，参考下面提供的完整靶序列的特征的讨论。使用如下面讨论的原核端粒酶活性的合适测定方法，也可以经验地验证原核端粒酶靶序列的第一部分和第二部分的适当配对的提供。应当理解，原核端粒酶靶序列的第一部分和第二部分可以各自提供为dna的单链。所述第一部分可以在不同dna链上提供给第二部分，或它们二者可以在相同dna单链上提供，前提条件是，存在足够的插入序列以允许第二部分与第一部分并置。原核端粒酶靶序列的第一部分和第二部分因此可以由互补序列形成，从而允许它们彼此退火。更详细地，被如本文中所述的它的相应原核端粒酶切割的完整原核端粒酶靶序列作为第一dna序列和互补第二dna序列的双链体存在，所述第一dna序列包含原核端粒酶靶序列的正向(或有义)部分，所述互补第二dna序列含有原核端粒酶靶序列的反向(或反义)部分。第二dna序列可以包含被包含在第一dna序列中的原核端粒酶靶序列的反向互补体。换而言之，在第一链中被包括在固体支持物近侧的原核端粒酶靶序列的第一部分与在第一链的远侧端部处或在互补的第二链上提供的原核端粒酶靶序列的第二部分形成互补双链体。如在图11b中所示，尽管原核端粒酶靶序列的两个部分(101a和101b)由于所述部分的序列的互补性质形成双链体，因为原核端粒酶靶序列的复发性质，每个部分具有折叠进发夹中的能力(由于在靶序列的部分内的内部自互补序列)。这显示在图11a中。当固定化的寡核苷酸在延伸之前包含原核端粒酶的靶序列的第一部分时，它可以进一步包含其5’和/或3’侧接区域。所述5’和/或3’侧接区域可以具有任意序列。在寡核苷酸含有5’和3’侧接区域的情况下，它们优选地不是自互补的。换言之，5’和3’侧接区域优选地是充分非互补的，使得寡核苷酸的3’区域保持可用于在促进寡核苷酸的模板依赖性延伸条件下的延伸。在某些实施方案中，所述寡核苷酸的3’和/或5’侧接区域包含特定序列，例如，这样的序列：其被设计成提供与在第一链或互补的第二链中合成的序列互补的序列。所述寡核苷酸可以包含天然的或经修饰的脱氧核糖核苷酸和核糖核酸或它们的组合。可以对碱基(包括但不限于腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶和尿嘧啶)、核糖糖主链和α磷酸酯基团做出化学修饰。合适的经修饰的脱氧核糖核苷酸的例子包括，锁核酸(lna)、桥连核酸(bna)、肽核酸(pna)、解锁核酸(una)和三唑-连接的脱氧核糖核苷酸。对增强可延伸的(引物)寡核苷酸与它们的模板的结合和在需要在单个dna链的远侧端部处的核苷酸序列与在固定化至表面的近侧端部处的互补序列退火的条件下，经修饰的脱氧核糖核苷酸的应用和引入是特别有用的。所述固定化的寡核苷酸可以具有任意合适的长度。具体地，所述固定化的寡核苷酸可以具有5-500个碱基、5至400个碱基、5至300个碱基、5至250个碱基、或5至200个碱基的长度。具体地，所述固定化的寡核苷酸具有15-300个碱基的长度，更具体地15-250个碱基的长度或15-250个碱基、15至200个碱基、15至150个碱基、15至100个碱基、15至75个碱基、15至50个碱基的长度。在某些实施方案中，所述固定化的寡核苷酸具有5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90或95个碱基的长度。在替代实施方案中，所述寡核苷酸具有30-100个、优选40和90个碱基的长度。所述固定化的寡核苷酸可以包括原核端粒酶靶序列的第一部分，或这可以通过固定化的寡核苷酸的延伸而被包括。原核端粒酶靶序列的第一或第二部分的长度取决于相应原核端粒酶为了结合、切割和重新连接游离末端所识别的最小序列。几个完整原核端粒酶靶序列描绘在图13中，且每条链代表相应原核端粒酶的靶序列的部分。相应原核端粒酶的原核端粒酶靶序列的第一部分和第二部分的长度可以是相同的或接近相同，因为它们能够退火以形成双链体。原核端粒酶靶序列的每个部分可以是20-100个碱基的长度，更具体地是30-100个碱基的长度。特定相应原核端粒酶的原核端粒酶靶序列的第一或第二部分可以侧接一个或更多个没有形成原核端粒酶靶序列的部分的序列。这些侧翼序列可以具有任意长度，且可以包括特异性序列。这些特异性序列可以包括被设计成与第一模板寡核苷酸互补的段、间隔序列、被设计成与以后包括在dna的延伸第一链中的序列互补的段或dna的延伸的其它链。所述侧翼序列可以包括希望在dna产物中包括的序列。用于固定化的寡核苷酸可以包括充当临近于固体支持物的间隔物的序列段。该间隔物可以具有任意合适的长度，且可以存在以避免固体支持物或连接实体对在本发明的方法中涉及的酶的任何位阻。理想地，所述间隔物具有多达250个碱基的长度，多达200、175、150、125、100、75、50、25、20、15、10或5个碱基的长度。如果固定化的寡核苷酸包括原核端粒酶靶序列的第一部分，所述间隔物可以被包括作为5’侧翼序列(104)的部分或全部。用于固定化的寡核苷酸可以包括充当寡核苷酸模板的互补序列的序列段。优选地，该段可以具有任意合适的长度。所述段可以是5-50个碱基或5-45个碱基、5至40个碱基、5至35个碱基、5至30个碱基、5至30个碱基、3至25个碱基或5至20个碱基的长度。理想地，所述段将是5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18或19个碱基的长度。本领域技术人员将理解，该序列段的长度将取决于在固定化的寡核苷酸和模板寡核苷酸之间设计的互补序列的重叠。此外，应当理解，该序列段的长度将取决于使用的dna聚合酶以及在该序列段和模板寡核苷酸之间形成的互补序列的解链温度。相同的考虑因素和序列长度适用于延长的链中的每个序列段，所述链要用作互补序列，用于模板寡核苷酸的退火。固定化至固体支持物所述寡核苷酸可以通过任何方式固定化至固体支持物，前提条件是，所述寡核苷酸能够从它的3’末端延伸。所述寡核苷酸可以直接地或间接地连接至固体支持物。选择固定化至固体支持物的方式，使得寡核苷酸和固体支持物之间的连接在引物延伸所用的条件下保持稳定。优选地，所述连接在变性条件下是稳定的。所述连接可以是可逆的或不可逆的。直接连接的寡核苷酸可以共价地或非共价地结合至固体支持物。任意合适的连接化学可以用于使寡核苷酸共价结合至固体支持物。所述寡核苷酸可以经由它的5’末端连接至固体支持物(图2a)。可替换地，所述寡核苷酸可以通过在内部位置处的连接固定化至固体支持物(图2b)。通常，在要固定化的寡核苷酸包括原核端粒酶序列的第一部分的情况下，所述连接存在于所述寡核苷酸内、靶序列之外(诸如在间隔序列中)的位置。在这样的一个实施方案中，所述连接优选地是在所述寡核苷酸在原核端粒酶的靶序列的第一部分的5’侧接区域。但是，在所述寡核苷酸在原核端粒酶的靶序列的第一部分的3’侧接区域中的连接也是可能的(即图2b)。所述接头可以包括间隔物以增加固体支持物和寡核苷酸之间的距离。共价连接可以如下发生：经由与偶联剂的缀合，经由标准氨基亚磷酸酯化学，颠倒酰胺化物化学(reverseamiditechemistry)或经由5’氨基接头。非共价连接包括静电相互作用、氢键和受体/配体或抗体/抗原偶联。非共价连接的一个例子是生物素/抗生蛋白链菌素系统。所述固体支持物可以用抗生蛋白链菌素包被以连接生物素化的寡核苷酸。所述间隔物可以是包含例如碳链的分子，所述碳链由多个亚甲基桥或乙二醇单元组成。间隔物长度在碳和氧原子二者数目方面可以是约3至约20个原子，约3至约15个原子，最佳地约5至约10个原子，和通常至少3个原子。通常，将多个寡核苷酸固定化至固体支持物，从而允许在单个固体支持物上平行的多个独立合成反应。所述固体支持物可以包含每平方毫米至少103、至少106、至少109、至少1012或至少1015个固定化的寡核苷酸的密度。优选的密度是每平方毫米109-1012个固定化的寡核苷酸，这取决于要合成的产物。除了关于密度的考虑以外，还重要的是，固定化的寡核苷酸均匀地分布在固体支持物的表面上，以阻止不希望的分子间相互作用和抑制寡核苷酸合成的位阻。确保寡核苷酸在固体表面上的均匀分布的方法是本领域已知的。寡核苷酸通常以阵列的形式连接至固体支持物。寡核苷酸阵列的构建是本领域众所周知的。寡核苷酸可以通过滴沉积或喷墨技术形成在固体支持物上，或预合成的寡核苷酸可以沉积在阵列上并偶联在所需位置。根据本发明的固体支持物是要延伸的寡核苷酸可以连接、键合、偶联或栓系的任何表面。固体支持物的例子包括平板、珠子、微珠、杂交芯片、膜、晶体和陶瓷制品。固体支持物材料的例子包括玻璃、塑料、合成的聚合物、硝酸纤维素、尼龙、陶瓷制品、金属、树脂、凝胶和膜。固定化的寡核苷酸的延伸如下延伸固定化的寡核苷酸：通过使用一系列在序列上重叠的模板寡核苷酸以形成与希望合成的序列互补的序列。换言之，模板寡核苷酸对应于要延伸的链的互补链。所述模板寡核苷酸系列包括第一模板寡核苷酸，其包含固定化的寡核苷酸的互补序列，通常是固定化的寡核苷酸的3’区域中的段的互补序列。第一模板寡核苷酸与固定化的寡核苷酸退火，且包括与固定化的寡核苷酸的3’末端重叠的序列，并为固定化的寡核苷酸的模板依赖性延伸提供模板，其因而充当引物。一旦已经执行第一模板寡核苷酸的模板依赖性延伸，就将第一模板寡核苷酸去除。第二模板寡核苷酸包含与第一模板寡核苷酸的序列重叠的序列，且因而其与引入使用第一模板寡核苷酸作为模板延伸的寡核苷酸中的序列互补。因此，所述第二模板寡核苷酸与延伸的寡核苷酸退火，且再次为固定化的寡核苷酸的进一步延伸提供模板。提供足够数目的另外模板寡核苷酸，从而将希望合成的完整序列引入固定化的寡核苷酸中从而产生第一dna链。该过程的一个实施例描绘在图3中，该图显示了在互补序列区域(131)3’末端(102a)附近与固定化的寡核苷酸(100a)退火的模板寡核苷酸(130)。模板寡核苷酸悬突至固定化的寡核苷酸的3’末端，并且可用于充当固定化的寡核苷酸的3’末端的聚合酶依赖性延伸的模板。所述聚合酶产生模板寡核苷酸的互补序列(132)。然后通过适当的方式去除模板寡核苷酸，并将另外模板寡核苷酸接连地加入、用于指导延伸和去除，剩下延伸的第一链(133)。通过一种或多种模板寡核苷酸对固定化的寡核苷酸进行的模板依赖性延伸，可以将原核端粒酶靶序列的第一部分引入第一链中。通常，原核端粒酶靶序列的第一部分在固体支持物的近侧位置处引入第一链中。适当地，原核端粒酶靶序列的第一部分可以位于与固体支持物足够远处，以使完整原核端粒酶靶序列的切割对与固体支持物的连接的干扰最小化。在某些实施方案中，这可能意味着，在与固体支持物和原核端粒酶靶序列的第一部分的连接之间不需要序列。例如，可以利用如上所述的化学间隔物。在一个替代实施方案中，原核端粒酶靶序列的第一部分与固体支持物的连接点间隔至少5个碱基。在一个替代实施方案中，原核端粒酶靶序列的第一部分间隔5-250个碱基，更优选地5-200、5-150、5-100、5-75、5-50个碱基。所述第一部分可以与固体支持物间隔5、10、15、20或25个碱基或任意插入长度。在某些实施方案中，在固定化到固体支持物上用于进一步延伸之前，可用一种或更多种模板寡核苷酸通过模板依赖性延伸来延伸寡核苷酸。在固定化之前的初始延伸步骤可以在溶液中进行。模板寡核苷酸包含与系列中的至少一个其它模板寡核苷酸重叠的序列。重叠的长度是足够的，以允许与延伸的寡核苷酸中的对应互补序列退火和所述寡核苷酸的模板依赖性延伸。所述重叠序列通常具有至少5个核苷酸的长度，且可以是至少10个、至少12个或更优选地至少15个核苷酸的长度。所述重叠序列可以是约5至约10、约10至约30、约10至约25、约10至约20或约15至约25个核苷酸的长度。优选地，所述重叠序列是约5至约20个核苷酸的长度。模板寡核苷酸通常是至少30个核苷酸的长度，且可以是30-40、30-50、30-60、30-80、30-100、100-130、130-160、160-200、100-200或40-60个核苷酸的长度。模板寡核苷酸可以是多达200个核苷酸的长度。模板寡核苷酸可以是约40至约50个核苷酸的长度，具有约5至约20个核苷酸的重叠。根据希望合成的序列的长度和本文描述的典型重叠、总长度，选择模板寡核苷酸的数目。希望合成的序列的长度的范围可以是从约100至约150个碱基(对于适体)至约1千碱基至约15千碱基(对于疫苗和其它治疗性dna产物)。在所需dna序列包含一个或多个适体序列的情况下，适体长度的范围可以是约15至约20、约20至约30、约30至约40、约40至约60、约60至约100、约100至150个碱基或更长。适体序列的长度可以是在约15至约150个碱基的范围内。从以下通式可以为每种产物估计在本发明的方法中合成所需的模板寡核苷酸的数目：2+(序列长度/30)。优选地，一种或多种模板寡核苷酸是不可延伸的，从而减少使用模板寡核苷酸作为模板的固定化的寡核苷酸的延伸与使用固定化的寡核苷酸作为模板的模板寡核苷酸的延伸之间的竞争。在某些实施方案中，所有模板寡核苷酸是不可延伸的。在其它实施方案中，所有模板寡核苷酸是可延伸的。技术人员能够改变条件，诸如试剂浓度、dna聚合酶、ph、离子强度、二价和单价离子的类型、温度，或包含二级结构去稳定剂(例如来自hiv-1的核衣壳蛋白)、分子拥挤试剂(例如海藻糖、葡聚糖、dmso、bsa或聚乙二醇)或dna凝聚剂(例如多价阳离子的带电荷的配体)，以有利于固定化的寡核苷酸的延伸(在使用可延伸的模板寡核苷酸的情况下)。将固定化的寡核苷酸在促进模板依赖性延伸的条件下与模板寡核苷酸系列一起温育。这样的条件包括至少一种dna聚合酶的存在。可以使用任何dna聚合酶。任何商购可得的dna聚合酶均适合用在本发明的方法中。可以使用2、3、4、5种或更多种不同的dna聚合酶，例如一种提供校正读码功能的dna聚合酶和一种或多种不提供该功能的其它dna聚合酶。可以使用具有不同机制的dna聚合酶，例如链置换型聚合酶和通过其它方法复制dna的dna聚合酶。不具有链置换活性的dna聚合酶的合适例子是t4dna聚合酶。优选的是，dna聚合酶是高度稳定的，使得它的活性在工艺条件下基本上不会被长期温育降低。因此，所述酶优选地在工艺条件范围下具有长半衰期，所述工艺条件包括但不限于温度和ph。还优选的是，dna聚合酶具有一种或多种适合于生产工艺的特征。所述dna聚合酶可能具有高保真度，例如通过具有校正读码活性。所述dna聚合酶优选地具有链置换活性，因为这可能辅助复制具有内部发夹的序列。此外，可能优选的是，dna聚合酶表现出高持续合成能力。优选的是，dna聚合酶不表现出非特异性的外切核酸酶活性。通过与商购可得的dna聚合酶(例如phi29、、嗜热脂肪芽孢杆菌(bacillusstearothermophilus，bst)dna聚合酶和史氏芽孢杆菌(bacillussmithii，bsm)的dna聚合酶的大片段和枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis，bsu)dna聚合酶i的大片段)所表现出的性能进行对比，技术人员可以确定给定的dna聚合酶是否表现出如上定义的特征。这些酶可商购得自几种来源，包括newenglandbiolabs,inc.、lucigen和thermoscientific。在提及高持续合成能力的情况下，这通常表示dna聚合酶与模板的每次结合/解离所添加的核苷酸的平均数目，即从单个结合事件得到的引物延伸的长度。链置换型聚合酶是优选的。链置换聚合酶可以辅助穿过存在于原核端粒酶靶序列中的发夹结构的延伸。优选的链置换型聚合酶是phi29、deepbsu、bsm和bstdna聚合酶i或其中任一种的变体。术语“链置换”在本文中用于描述dna聚合酶在dna合成过程中遇到双链dna的区域后置换互补链的能力。应当理解，链置换扩增方法与基于pcr的方法的差异在于，变性循环不是有效的dna扩增所必需的，因为双链dna不是新dna链的继续合成的障碍。相反，pcr方法在扩增工艺过程中需要变性循环(即将温度升高至94摄氏度或以上)以熔化双链dna和提供新的单链模板。在本发明的方法中使用的链置换dna聚合酶优选地具有至少20kb的持续合成能力(引物延伸长度)，更优选地，至少30kb、至少50kb或至少70kb或更大。在特别优选的实施方案中，所述链置换dna聚合酶具有相当于或大于phi29dna聚合酶的持续合成能力。链置换dna聚合酶的一种优选类型是滚环扩增(rca)聚合酶，诸如phi29dna聚合酶。促进固定化的寡核苷酸的模板依赖性延伸的条件是合适的以允许它与模板寡核苷酸退火，且包括合适的温度和缓冲液。可以根据经验选择适当的退火/杂交条件。在本发明中使用的优选退火条件的一个例子包括包含30mmtris-hclph7.4、30mmkcl、7.5mmmgcl2、10mm(nh4)2so4和1mmdtt的缓冲液。所述退火可以如下进行：在变性以后逐渐冷却至所需反应温度。变性可以如下辅助延伸：促进以前的模板寡核苷酸的置换，有利于新模板寡核苷酸的结合。因此，本发明的方法可以包含以下一个或多个步骤：在模板依赖性延伸以后，在变性条件下温育与模板寡核苷酸结合的固定化的寡核苷酸。本发明的方法可以包含以下步骤：在用模板寡核苷酸对固定化的寡核苷酸的每个模板依赖性延伸以后在变性条件下温育。合适的变性条件包括化学变性，诸如通过调节ph，由增加的温度引起的热变性，和离子强度的变化，诸如通过去除阳离子，例如通过在去离子水中温育。适当地，与要延伸的寡核苷酸的热稳定固定化联合采用热变性。变性的合适ph是ph11，然后调至ph7.5，以随后允许延伸。本发明的方法也可以包含一个或多个、诸如1-5个、优选地至少2个在加入新模板寡核苷酸之前洗涤延伸的引物以去除以前的模板寡核苷酸的步骤。本发明的方法可以包含在用模板寡核苷酸对引物的每个模板依赖性延伸以后的洗涤步骤以去除模板寡核苷酸。本发明的方法也可以包含使引物分别或依次与模板寡核苷酸系列的每个成员接触。在下面更详细地描述了示例性的变性、洗涤和延伸条件。促进模板依赖性延伸的条件也包含促进dna聚合酶活性的条件。所述条件包含使用允许dna聚合酶活性的任意温度，通常在20-90摄氏度的范围内。一种优选的温度范围可以是约20至约40摄氏度或约25至约35摄氏度。通常，基于特定dna聚合酶具有最佳活性时的温度来选择适当温度。该信息是通常可得到的，并形成技术人员的一般知识的部分。例如，在使用phi29dna聚合酶的情况下，合适的温度范围可以是约25至约35摄氏度，优选约30摄氏度。技术人员常规地能够鉴别用于根据本发明的方法的有效扩增的合适温度。例如，所述方法可以在温度范围内进行，并可以监测扩增的dna的收率以鉴别给定的dna聚合酶的最佳温度范围。促进固定化的寡核苷酸的模板依赖性延伸的其它条件包括所有四种dntp(atp、ttp、ctp和gtp)、合适的缓冲剂/ph和酶性能或稳定性所需的其它因子的存在。合适的条件包括本领域已知的用于提供dna聚合酶的活性的任意条件。例如，所述ph可以是在3-10的范围内，优选地5-8或约7，诸如约7.5。通过使用一种或多种缓冲剂，可以将ph维持在该范围内。这样的缓冲剂包括但不限于mes、bis-tris、ada、aces、pipes、mobs、mops、mopso、bis-trispropane、bes、tes、hepes、dipso、tapso、trizma、heppso、popso、tea、epps、tricine、gly-gly、bicine、hepbs、taps、ampd、tabs、ampso、ches、capso、amp、caps、cabs、磷酸盐、柠檬酸-磷酸氢钠、柠檬酸-柠檬酸钠、醋酸钠-乙酸、咪唑和碳酸钠-碳酸氢钠。所述反应也可以包含二价金属的盐，诸如但不限于镁(mg2+)和锰(mn2+)的盐，包括氯化物、乙酸盐和硫酸盐。也可以包括单价金属的盐，诸如钠盐和钾盐，例如氯化钾。可以包括的其它盐是铵盐，尤其是硫酸铵。还可以包括去污剂。合适的去污剂的例子包括tritonx-100、吐温20和其中任一种的衍生物。在反应中还可以包括稳定剂。可以使用任意合适的稳定剂，具体地，牛血清白蛋白(bsa)和其它稳定蛋白。通过加入松弛dna和使模板变性更容易的试剂，也可以改善反应条件。这样的试剂包括例如二甲亚砜(dmso)、甲酰胺、甘油和甜菜碱。应当理解，技术人员基于他们的一般知识能够改变和优化用于本发明的方法的扩增和温育条件。同样，特定试剂的具体浓度可以基于本领域中的以前实施例进行选择，并基于一般知识进一步优化。作为一个实施例，在本领域的基于rca的方法中使用的合适反应缓冲液是50mmtris-hcl(ph7.4)、10mmmgcl2、20mm(nh4)2so4、5％甘油、0.2mmbsa、1mmdntp。在本发明的rca扩增中使用的一种优选反应缓冲液是30mmtris-hcl(ph7.4)、30mmkcl、7.5mmmgcl2、10mm(nh4)2so4、1mmdtt、2mmdntp。该缓冲液特别适合用于与phi29rca聚合酶一起使用。反应条件还可以包含一种或多种另外蛋白的使用。可以在有至少一种焦磷酸酶(诸如酵母无机焦磷酸酶)存在下扩增dna模板。可以使用2、3、4、5种或更多种不同的焦磷酸酶。这些酶能够降解在链复制过程中由dna聚合酶从dntp产生的焦磷酸盐。焦磷酸盐在反应中的积累可以造成dna聚合酶的抑制和降低dna扩增的速率和效率。焦磷酸酶可以将焦磷酸盐分解成非抑制性的磷酸盐。用于用在本发明的方法中的合适焦磷酸酶的一个例子是酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)焦磷酸酶，其可商业得自newenglandbiolabsinc.。任何单链结合蛋白(ssbp)可以用在本发明的方法中，以稳定单链dna。ssbp是活细胞的基本组分，并参与涉及ssdna的所有过程，诸如dna复制、修复和重组。在这些过程中，ssbp结合短暂形成的ssdna且可以帮助稳定ssdna结构。用于用在本发明的方法中的合适ssbp的一个例子是t4基因32蛋白，其可商业得自newenglandbiolabsinc.。洗涤条件可以是允许从固定化的寡核苷酸和反应混合物去除模板寡核苷酸的任意合适条件。理想地，洗涤的过程包括或造成变性步骤。用于变性的合适ph是ph11，诸如通过用碱诸如氢氧化钠的溶液(即10mm)洗涤所提供的ph，然后合乎需要的是，将所述条件调至ph7.4以随后允许延伸，例如通过使用反应缓冲液作为最终的洗涤溶液。可以使用任意合适的洗涤条件。在固体支持物上生产双链dna可以改变本发明的方法以从固体支持物生产和释放双链dna。产生的双链dna通常是线性共价闭合双链dna。所述双链dna因而在两个末端处被发夹封闭，其中至少一个发夹包含原核端粒酶的靶序列的一部分。图3a-3j、4a至4f、4g、4h和5a至5e显示了适合用于生产双链dna的方法的实例。为了生产双链dna，在一个实施方案中，如以上所讨论的合成包含所需dna序列的延伸的第一链，且将该延伸的第一链用作模板用于使用与延伸的第一链互补的引物(末端模板寡核苷酸或反向引物)延伸互补的第二链。适合用于延伸互补第二链的条件可以选自上面关于第一链的延伸描述的那些条件。将互补第二链延伸以包括位于固体支持物近侧的原核端粒酶靶序列的第二互补部分，其因而可以与靶序列的对应第一部分配对和形成双链体，以建立在固体支持物近侧的原核端粒酶的完整靶序列。通常，在双链dna中包括远侧原核端粒酶靶序列以允许第二封闭末端的形成。因此，用于从固体支持物生产双链dna的方法通常包含用包含原核端粒酶的靶序列的第一部分的模板寡核苷酸对第一链的模板依赖性延伸，通常作为第一链的最终延伸。所述延伸的第一链因而包含在所述固体支持物远侧的原核端粒酶的靶序列的第一部分。因而延伸的第一链然后可以用作模板用于延伸互补的第二链，通常使用反向引物，其包含位于第一链的远侧端部处的原核端粒酶靶序列的第二部分。因此，将完整的、远侧的、原核端粒酶靶序列引入双链dna中。近侧的和远侧的原核端粒酶靶序列可以是相同的或不同的原核端粒酶靶序列的靶序列，且可以各自选自下面讨论的任何原核端粒酶靶序列。近侧的和远侧的原核端粒酶靶序列可以选自：seqidno:10的细菌噬菌体n15teln或其变体的靶序列，seqidno:12的根癌土壤杆菌tela或其变体的靶序列，或seqidno:14的细菌噬菌体vp58.5gp40或其变体的靶序列。近侧的和远侧的靶原核端粒酶靶序列可以包含seqidno:10的细菌噬菌体n15teln或其变体的一个靶序列和/或seqidno:12的根癌土壤杆菌tela或其变体的一个靶序列和/或seqidno:14的细菌噬菌体vp58.5gp40或其变体的靶序列。图3a至3j描绘了这样的方法的一个实例。使用模板寡核苷酸系列(130)如前面所述(图3a至3e)延伸固定化的寡核苷酸(100a)。在图3f和3g中，加入最终的模板寡核苷酸(或反向引物)(100b)，并且其在互补序列区域(134)中在第一dna链(133)的3’末端附近退火。最终的模板寡核苷酸包含原核端粒酶靶序列的部分(101b)。dna聚合酶延伸所述延伸的第一链的3’末端(141)和最终的模板寡核苷酸的3’末端(102b)，从而在第一链(133)的远侧延伸末端处建立完整原核端粒酶靶序列(137b)，并且也建立互补的第二链(136)。互补的第二链使用第一链(133)作为模板，并因而在固体支持物近侧建立完整原核端粒酶靶序列(137a)。这些完整原核端粒酶靶序列可以具有相同的或不同的序列，使用相同的或不同的相应原核端粒酶。使用相应原核端粒酶可以切割和连接靶序列，从而从固体支持物(140)释放双链闭合线性dna。图5a至5e描绘了使用在内部核苷酸处固定化的寡核苷酸的类似方法。在一个替代实施方案中，通过包括能够在第一dna链中形成发夹的合适序列，可以生产双链闭合线性dna。所述双链dna可以从dna的单链形成。这样的方法描绘在图4a至4f和4g/4h中。例如，可以将两个彼此互补的序列(181和184)以特定方式引入在第一链的远侧端部处或附近，所述方式使得它们在相同链内退火在一起以形成发夹。适当地，所述两个自互补序列是邻近的(如在图4a至4f上所示)，从而导致发夹的形成。可替换地，所述两个自互补序列被插入序列区域(185)隔开，所述插入序列区域可以在发夹形成后在外面成环(如在图4g和4h上所示)。为了生产双链dna，使用在固体支持物和发夹之间的第一链的段作为模板延伸发夹的3’末端，以形成第一链(133)的互补第二段(186)。互补第二段(186)包括原核端粒酶靶序列的第二部分(101b)，从而形成在固体支持物近侧的完整原核端粒酶靶序列(137)。这可以被相应原核端粒酶切割，从而释放双链封闭末端dna分子(187)。在该实施方案中，一个闭合末端通过原核端粒酶对它的相应靶序列的作用而形成，且其它闭合末端通过在第一链的序列中包括自互补序列而形成。其它闭合末端可以由发夹环形成，所述环是单链dna。在一个替代实施方案中，包含发夹的寡核苷酸模板可以用作末端模板寡核苷酸用于延伸第一链。模板寡核苷酸中的发夹可以是原核端粒酶靶序列的部分，或可以由邻近互补序列组成。所述邻近互补序列可以包含除了原核端粒酶靶序列的序列以外的序列。所述模板寡核苷酸与延伸的第一链退火，如在图5a中所示。使用模板寡核苷酸进一步延伸第一链的3’末端(图5b)。然后去除模板寡核苷酸，并由于互补序列的引入在第一链中形成发夹(图5c)。然后使用第一链作为模板进一步延伸3’末端，包括原核端粒酶靶序列的第一部分。这会产生原核端粒酶靶序列的第二部分，并从而产生在固体支持物近侧的完整原核端粒酶靶序列(图5d)。加入相应原核端粒酶后，产生闭合线性dna(图5e)。在固体支持物上生产单链dna可以改变本发明的方法以从固体支持物生产和释放单链dna。产生的单链dna通常是包含发夹的单链环形dna，所述发夹包含原核端粒酶的靶序列的一部分。该单链环形dna在本文中也被描述为缩紧的单链环形dna(诸如图6e的155和图9的240)。已经延伸固定化的寡核苷酸以产生包含所需dna序列的第一链以后，该链可以以不同的方式作为单链dna释放。合成单链dna的方法的例子包括在图4a至4g、6a-6e、7a-7e和8a至8f中描绘的那些。在一个实施方案中，在促进序列在它的远侧3’末端与位于固体支持物近侧的相同链中的互补序列退火的条件下温育延伸的第一链。这可以如下实现：使用在固体支持物近侧的寡核苷酸中的任何序列(诸如原核端粒酶靶序列的第一部分、3’侧翼序列和/或5’侧翼序列)作为与引入第一链的远侧3’末端中的那些序列互补的序列。其一个实施例描绘在图6a至6e中。可以以许多方式实现促进延伸的第一dna链(133)的远侧3’末端与它的近侧端部的退火，以允许建立在固体支持物近侧的完整原核端粒酶靶序列。首先，在延伸的第一dna链的远侧端部处，在固体支持物近侧的相同链中的序列的互补序列可以共价地连接至生物素分子。生物素分子具有与抗生蛋白链菌素的高亲和力结合。因而，可以使用模板依赖性延伸将生物素化的核苷酸序列引入在第一链的远侧端部处。在使用具有多个生物素结合位点的抗生蛋白链菌素将寡核苷酸固定化至固体支持物的情况下，还可以使用它吸引与延伸的引物的远侧端部连接的高亲和力生物素的结合。其次，可以将磁性颗粒提供在固体支持物的近侧，并且也连接至序列，与在近侧端部处的序列互补的延伸的dna链的远侧端部。在该情况下，使用磁场的适当应用将第一链的近侧端部和远侧端部拉到一起以允许建立完整原核端粒酶靶序列。互补序列的退火会建立dna环，其包含以前引入延伸的第一链中的所需dna序列。与在固体支持物近侧的第一链中的序列互补的序列因而通过模板依赖性延伸引入延伸的第一链的3’远侧端部中。在该实施方案中，本发明的方法可以包含使用模板寡核苷酸对第一dna链的模板依赖性延伸，所述模板寡核苷酸包含这样的序列：其对应于位于固体支持物近侧的原核端粒酶的靶序列的第一部分的3’侧接区域中的序列。因而，使用模板依赖性延伸在第一dna链的远侧3’末端处引入原核端粒酶的靶序列的第一部分的3’侧接区域的互补序列。可替换地，或另外，本发明的方法可以包含第一dna链的远侧端部的模板依赖性延伸，以在其中引入原核端粒酶的靶序列的第二部分，所述第二部分与其位于固体支持物近侧的第一部分互补。任选地，原核端粒酶的靶序列的第一部分的5’侧接区域的互补序列也可以通过模板依赖性延伸引入在第一dna链的远侧端部处。3’和/或5’侧接区域的互补序列、和/或位于固体支持物近侧的原核端粒酶的靶序列的第二互补部分可以通过一种或多种模板寡核苷酸引入。上面的模板依赖性延伸可以是第一dna链的模板依赖性延伸的最终步骤。以上互补序列在延伸的第一链的远侧端部处的引入可以产生远侧端部，其在第一链的远侧端部和近侧端部的退火后建立在固体支持物近侧的原核端粒酶的完整靶序列。可替换地，可以如下在固体支持物近侧建立原核端粒酶的完整靶序列：使第一链的远侧端部与它的近侧端部退火，并随后使用近侧端部(包括原核端粒酶靶序列的第一部分)作为模板进行远侧端部的模板依赖性延伸。上面定义的通过使远侧3’末端与互补序列退火来建立在固体支持物近侧的完整原核端粒酶靶序列的方法可以用于创立的任何单链dna，包括其中其它发夹可能已经引入第一链中的那些。在另一个实施方案中，使用延伸的第一链来建立包含两个或更多个发夹的单链环形dna，其中至少一个包含原核端粒酶的靶序列的一部分。所述发夹可以位于环周围的任何点处，但是如果存在两个，它们通常位于单链环形dna的相对侧(图8f,177)。为了在延伸的dna链上引入一个或多个发夹，可以将发夹或用于制备发夹的物件(即完整原核端粒酶靶序列)引入第一链的远侧端部中，即在第一链的3’末端处。一旦该发夹或用于制备发夹的物件已经引入，第一dna链的延伸可以继续。在第一链的远侧端部处的发夹可以通过完整原核端粒酶靶序列的引入而形成，如在图8b中所描绘的，或者从能够形成发夹的另一个合适序列形成，如在图4c中描绘的。两种技术的混合物可以用于制备具有多个发夹的封闭单链dna。如果使用内部自互补序列引入发夹，可以建立单链dna的插入段。这描绘在图4h中。例如，两个彼此互补的序列(181和184)可以以特定方式引入在第一链的远侧端部处，所述方式使得它们在相同链内退火在一起以形成发夹。适当地，所述两个自互补序列被插入序列区域(185)隔开，所述插入序列区域在发夹形成后在外面成环，从而形成单链dna段。该发夹环可以包含所需序列，诸如适体或用于表达的序列。因而，所述环可以具有任意合适的长度。优选的是，所述环具有多达500个碱基、或多达400个碱基、多达300个碱基或多达250个碱基的长度。理想地，对于应用诸如较短的适体，所述环可以是10-100个碱基，即10-90、10-80、10-70、10-60或10-50个碱基。所述环可以是10、15、20、25、30、35、40、45、50、55或60个碱基的长度。可替换地，所述环(185)可以含有最小量的核酸残基。使用第一链的第一段作为模板，或使用一系列模板寡核苷酸(其形成与第一链的第一段的至少一部分非互补的序列)，可以将发夹的3’末端延伸为第一dna链的第二段。可替换地，可以将完整原核端粒酶靶序列引入在第一dna链的远侧端部处。使用包含原核端粒酶靶序列的一部分的模板寡核苷酸，诸如在图1a和1c(100和120)中描绘的那些，可以如以前所讨论的引入完整原核端粒酶靶序列。在第一链的远侧端部处产生引入的发夹的这种含义上，将原核端粒酶靶序列的第一部分引入在固体支持物远侧的延伸的第一链，通常在第一链的模板依赖性延伸中。然后使如此延伸的第一链与模板寡核苷酸(其包含位于延伸的第一链的远侧端部处的原核端粒酶的靶序列的一部分)退火，以由此在聚合酶介导的延伸已经发生以后建立原核端粒酶的完整靶序列。然后将包含原核端粒酶的靶序列部分的模板寡核苷酸延伸作为第一dna链的第二段。在第一链的远侧端部或3’末端处的该完整原核端粒酶靶序列可能具有与在固体支持物近侧的完整原核端粒酶靶序列相同或不同的相应原核端粒酶。优选的是，用于在第一链的远侧或3’末端处引入完整原核端粒酶靶序列的模板寡核苷酸包括不与第一链的第一段互补的3’侧翼序列的部分。所述第一链的第一段是在固体支持物和完整原核端粒酶靶序列之间的序列。这样的模板寡核苷酸(120)显示在图1b和8a中。如果要延伸该寡核苷酸的3’末端，所述第一链的第一段没有用作模板，但是如前所述的聚合酶介导的延伸需要模板寡核苷酸。已经将第一发夹或用于产生发夹的物件包括在第一链中以后，发夹的3’末端的进一步延伸会产生第一链的第二段。可以将另一个发夹或用于产生发夹的物件引入在第一链的第二段的远侧端部处，该发夹的3’末端的进一步延伸导致第一链的第三段的延伸，以此类推。因而，已经将发夹或用于产生发夹的物件引入在第一链的远侧端部处以后，发夹的3’末端的延伸会导致该链的新段的进一步延伸。可以重复该过程以插入所需要数目的发夹或用于产生发夹的物件。引入第一链中的完整原核端粒酶靶序列可以被相同的或不同的相应原核端粒酶识别。已经将完整原核端粒酶靶序列包括在第一链中以后，可以将它立即或在所述方法中的任意其它适当点(包括单链dna的释放以后)使用它的相应原核端粒酶进行处理。在一个实施方案中，用于创立引入的发夹的完整原核端粒酶靶序列不同于在固体支持物近侧使用的完整原核端粒酶靶序列。在另一个实施方案中，引入第一链中的每个完整原核端粒酶靶序列被不同的相应原核端粒酶识别。可替换地，原核端粒酶靶序列的第一部分和第二部分都可以引入在所述链的远侧端部中，使得互补部分在相同链内退火在一起且可以在被相应原核端粒酶切割以后在远侧端部处形成发夹。在通过不同区段(各自被发夹隔开)提供第一链的进一步延伸的任何以上实施方案中，所述延伸可以用一系列在序列上重叠的模板寡核苷酸实现，以形成与第一链的较早段非互补的序列。有利地，这允许除了在第一链的较早段中包括目标dna序列以外在合成的dna中包括其它目标单链dna序列。第一链的进一步延伸可以使用如上所述的模板寡核苷酸、延伸条件以及洗涤和变性步骤。为了形成环形单链结构和从固体支持物释放dna，在固体支持物的近侧需要完整原核端粒酶靶序列。这可以使用任何以前讨论的手段引入。有利地，第一链的其它模板依赖性延伸进一步包含将在延伸的第一链中的互补序列引入至在固体支持物近侧的第一链的第一段中的序列，使这些互补序列退火，和创立在固体支持物近侧的原核端粒酶的完整靶序列。以此方式，第一延伸链建立非互补的单链区域，其侧接在近侧端部处的近侧完整原核端粒酶序列和一个或更多个完整原核端粒酶靶序列或能够在延伸的第一链内形成发夹的其它序列。换而言之，所述延伸的第一链可以含有在固体支持物近侧的完整原核端粒酶靶序列(近侧的完整原核端粒酶靶序列)，其允许从固体支持物释放，以及其它完整原核端粒酶靶序列或能够形成发夹的其它序列，诸如具有邻近互补序列的区域。这使释放的序列能含有多个发夹，同时由dna的单链组成。由于原核端粒酶在近侧的完整原核端粒酶靶序列上的作用，单链dna不具有游离末端，且如果使发夹变性，单链dna是环形的。在使用近侧的和一个或多个远侧的原核端粒酶靶序列的情况下，它们可以是相同的或不同的原核端粒酶的靶序列，且可以各自选自在下面讨论的或在图13上显示的原核端粒酶靶序列中的任一种。所述近侧的和远侧的原核端粒酶靶序列都可以是seqidno:10的细菌噬菌体n15teln或其变体的靶序列、seqidno:12的根癌土壤杆菌tela或其变体的靶序列、或seqidno.14的细菌噬菌体vp58.5gp40或其变体的靶序列。所述近侧的和远侧的靶原核端粒酶靶序列可以包含选自以下的序列：seqidno:10的细菌噬菌体n15teln或其变体的靶序列、seqidno:12的根癌土壤杆菌tela或其变体的靶序列或seqidno:14的细菌噬菌体vp58.5gp40或其变体的靶序列。如上所述，与固体支持物近侧的第一链中的序列(其可以用于促进完整原核端粒酶靶序列的创立)互补的序列可以包含与位于固体支持物近侧的原核端粒酶的靶序列的第一部分的3’侧接区域互补的序列、近侧的原核端粒酶靶序列的第二互补部分和任选的与近侧的原核端粒酶靶序列的第一部分的5’侧接区域互补的序列。以上互补序列可以使用一种或多种模板寡核苷酸引入在延伸的第一链的远侧端部上，或可以使部分互补序列退火，并然后使用第一链作为模板进行延伸以建立在固体支持物近侧的完整原核端粒酶靶序列。可以在所述方法的任何适当点使完整原核端粒酶靶序列与相应原核端粒酶接触。图8b和8c描绘了将完整原核端粒酶靶序列引入第一链的远侧端部中以后，在所述链的进一步延伸开始之前使它与相应原核端粒酶接触。但是，这可以被延迟直到第一链已经进一步被延伸，如下面讨论的。链延伸以后，使在固体支持物远侧(在采用的情况下，可替换地置换另一种发夹形成序列)和近侧的完整原核端粒酶靶序列各自与相应原核端粒酶接触，由此产生包含两个或更多个发夹的单链环形dna，其中至少一个包含原核端粒酶的靶序列的一部分。发夹的数目取决于引入延伸链中的完整原核端粒酶靶序列的数目和/或其它发夹形成序列的包含。所述发夹位于引入在第一链中的所需dna序列之间，且因而将第一链分成单链dna的区段，其每一个均侧接发夹。在上面讨论的用于生产单链dna的所有实施方案中，如下所述，通过使在固体支持物近侧的完整原核端粒酶靶序列与原核端粒酶接触，使单链dna分子从固体支持物释放。原核端粒酶靶序列根据本发明使用原核端粒酶靶序列作为原核端粒酶的底物，以提供合成的dna从固体支持物的释放和/或产生合成的dna的闭合末端。在本发明中使用的原核端粒酶靶序列从在单独步骤中合成的靶序列的第一部分和第二部分建立，无论是在相同dna链上还是在单独dna链上。本发明的方法可以包含在固体支持物近侧的单个原核端粒酶靶序列的建立或在所述固体支持物近侧和远侧的原核端粒酶靶序列的建立。完整原核端粒酶靶序列是这样的任意dna序列：其在dna模板中的存在提供原核端粒酶的酶活性对模板的切割和重新连接以形成至少一个发夹。天然完整原核端粒酶靶序列的例子给出在图13中。完整原核端粒酶靶序列可以是相应原核端粒酶的作用所需的最小序列，且不可能代表整个天然识别序列。在模板是双链的情况下，完整原核端粒酶序列允许它转化成闭合线性dna。换而言之，完整原核端粒酶靶序列是原核端粒酶对双链dna的切割和重新连接以形成共价闭合线性dna所需要的。完整原核端粒酶靶序列因而含有所述序列的靶标识别、切割和重新连接所需的最小量的序列。通常，原核端粒酶靶序列包含任何完美回文序列，即具有双重旋转对称的任何双链dna序列，在本文中也描述为完美反向重复。如在图13中所示，来自各种嗜温细菌噬菌体和细菌质粒的原核端粒酶靶序列都共享包含完美反向重复的共同特征。完美反向重复的长度随具体生物体而变化。在布氏疏螺旋体中，所述完美反向重复是14个碱基对的长度。在不同的嗜温细菌噬菌体中，所述完美反向重复是22个碱基对或更大的长度。并且，在某些情况下，例如大肠杆菌n15，中央完美反向回文对称侧接反向重复序列，即形成较大不完美反向回文对称的部分。在本发明中使用的完整原核端粒酶靶序列优选地包含至少14个碱基对长度的双链回文(完美反向重复)序列，因而原核端粒酶靶序列的每个部分包含至少14个碱基长度。如在图13中所示，完美反向重复的碱基对在不同细菌噬菌体之间的某些位置处是保守的，而序列的柔性(flexibility)在其它位置处是可能的。来自原核端粒酶靶序列的完美反向重复的一个例子是seqidno:22，其特别优选地用于与根癌土壤杆菌tela一起使用，其也是原核端粒酶tela结合、切割和重新连接开放末端所需的最小序列。这在图13上以灰色显示。所述完美反向重复可以侧接额外的反向重复序列。所述侧接反向重复可以是完美或不完美重复，即可以是完全对称的或部分对称的。所述侧接反向重复可以与或不与中央回文对称邻接。所述原核端粒酶靶序列可以包含不完美反向重复序列，其包含至少14个碱基对长度的完美反向重复序列。所述不完美反向重复序列可以包含至少22个碱基对长度的完美反向重复序列。特别优选的原核端粒酶靶序列包含seqidno:15-21的序列或其变体。seqidno:15-21的序列包含完美反向重复序列，且另外包含来自有关生物的侧翼序列。包含seqidno:15的序列或其变体的原核端粒酶靶序列优选地用于与seqidno:10的大肠杆菌n15teln原核端粒酶及其变体联合使用。包含seqidno:16的序列或其变体的原核端粒酶靶序列优选地用于与seqidno:12的克雷伯氏菌属噬菌体phik02原核端粒酶及其变体联合使用。包含seqidno:17的序列或其变体的原核端粒酶靶序列优选地用于与seqidno:4的耶尔森氏菌属噬菌体py54原核端粒酶及其变体联合使用。包含seqidno:18的序列或其变体的原核端粒酶靶序列优选地用于与seqidno:8的弧菌属噬菌体vp882原核端粒酶及其变体联合使用。包含seqidno:19的序列或其变体的原核端粒酶靶序列优选地用于与布氏疏螺旋体原核端粒酶联合使用。包含seqidno:20的序列或其变体的原核端粒酶靶序列优选地用于与seqidno:12的根癌土壤杆菌tela及其变体联合使用。包含seqidno:21的序列或其变体的原核端粒酶靶序列优选地用于与seqidno:14的副溶血弧菌质粒vp58.5联合使用。由于完美反向重复段的中央段(其可能被不完美重复段包围)的存在，原核端粒酶靶位可能不是对称的。如果这是事实，所述位点可以视作两半，诸如在图11中关于原核端粒酶teln显示的原核端粒酶靶序列的tell和telr段。如果使它完全对称，所述原核端粒酶将仍然识别所述位点，即teln将识别tell/tell位点和telr/telr位点。以上描述的任何回文对称或原核端粒酶靶序列的变体也可以用在本发明中，包括其同系物或突变体。突变体包括关于天然序列的截短、置换或缺失，且因而也可以包括所述序列的片段。变体序列是这样的任意序列：其在dna模板中的存在允许通过原核端粒酶的酶活性对它的切割和重新连接以形成至少一个发夹，或者在双链dna的情况下将合成的dna转化成闭合线性dna。这可以通过使用关于模板的切割和重新连接或关于闭合线性dna的形成的适当测定容易地确定。可以使用在本领域中描述的任意合适测定。合适测定的一个例子描述在deneke等人,pnas(2000)97,7721-7726中。在本发明的方法中关于原核端粒酶活性的合适测定的一个例子是监测合成的dna从固体支持物的释放。优选地，变体序列允许与用天然序列观察到的那些可比较的原核端粒酶结合和活性。本文描述的回文对称序列的优选变体的例子包括截短的回文对称序列，其保留完美重复结构且仍然能够允许模板的切割和重新连接以形成发夹或允许形成闭合线性dna。但是，可以修饰变体原核端粒酶靶序列，使得它们不再保留完美回文对称，前提条件是，它们能够充当原核端粒酶活性的底物。应当理解，技术人员基于上述的结构原理能够容易地鉴别用于本发明中的另外合适原核端粒酶靶序列。可以使用上述关于原核端粒酶活性的测定针对它们的促进模板切割和重新连接以形成发夹或形成闭合线性dna的能力来筛选候选原核端粒酶靶序列。通过原核端粒酶的作用形成的发夹通常不包括非互补序列的区域，即所述序列通常是完全互补的。参考显示teln在telrl位点上创立的发夹的图11c，在发夹内的整个序列是互补的，且在由非互补序列组成的发夹的末端处不存在环结构。但是，某种结构变形可能对在发夹尖部处的碱基配对产生某种应变，这意味着，这些不可用于碱基配对，尽管它们具有互补性质。优选的是，由原核端粒酶形成的发夹在尖部处不包括任何非互补的环段。在发夹的长度内的非互补碱基的某些“摆动”不可能影响结构。但是，优选的是，所述发夹是完全自互补的。互补性描述了序列(5’至3’)中的每个多核苷酸的碱基如何与反向平行(3’至5’)链上的互补碱基进行氢键配对：a与t(或u)和c与g，它们可以是相同链(内部互补序列)或在不同链上。优选的是，所述发夹中的序列具有90％互补性，优选地91％、92％、93％、94％、95％、96％、98％、99％或100％互补性。发夹的形成和从固体支持物释放根据本发明从固体支持物合成的dna包含一个或多个发夹，所述发夹包含原核端粒酶靶序列的部分。在双链闭合线性dna的情况下，这些可以起作用以封闭dna的末端。以上发夹通过与原核端粒酶接触而产生，所述原核端粒酶也起作用以从固体支持物释放合成的dna。在本发明中使用的原核端粒酶是能够切割和重连包含相应原核端粒酶靶序列的模板以便形成发夹或产生共价闭合dna的任何多肽。因而，所述原核端粒酶具有dna裂解和连接功能。具有原核端粒酶型活性的酶还已经被描述为端粒解离酶(例如在布氏疏螺旋体中)。如果dna包含原核端粒酶靶序列，所述酶可以在该序列处切割dna并连接末端以建立可以共价地封闭dna的发夹。在模板中的原核端粒酶靶序列是在固体支持物近侧的情况下，得到的发夹之一将保持结合至固体支持物，且所述模板也将以包含原核端粒酶靶序列的部分的发夹的形式(诸如共价闭合dna)从固体支持物释放。上面讨论了关于原核端粒酶靶序列的要求。也如上所述，使用本领域中描述的任意合适测定，可以确定给定的多肽切割和重连原核端粒酶靶序列的能力。已经描述了细菌噬菌体中的原核端粒酶。在某些溶原性细菌中，细菌噬菌体作为染色体外dna存在，所述染色体外dna包含具有共价闭合末端的线性双链。该dna的复制和共价闭合末端(或末端着丝粒末端)的维持依赖于酶原核端粒酶的活性。该催化活性的一个例子由来自感染大肠杆菌的细菌噬菌体n15的酶teln提供。teln识别特定核苷酸序列；被称作telrl(包含两半telr和tell)的稍微不完美的反向回文结构，其侧接22碱基对反向完美重复(telo)(参见图11b)。原核端粒酶已经对telrl靶位起作用以后，telr和tell包含dna的闭合末端(图11c)。本发明的方法需要至少一种原核端粒酶的应用。本发明的方法可以包含超过一种原核端粒酶(诸如2、3、4、5或更多种不同的原核端粒酶)的应用。合适的原核端粒酶的例子包括来自细菌噬菌体的那些，诸如来自海水盐单胞菌(halomonasaquamarina)的phihap-1(seqidno:2)、来自小肠结肠炎耶尔森氏菌(yersiniaenterolytica)的py54(seqidno:4)、来自产酸克雷伯氏菌(klebsiellaoxytoca)的phiko2(seqidno:6)和来自弧菌属(vibriosp.)的vp882(seqidno:8)、来自大肠杆菌的n15(seqidno:10)、根癌土壤杆菌tela(seqidno:12)、来自副溶血弧菌的vp58.5(seqidno:14)或其中任一种的变体。大肠杆菌细菌噬菌体n15原核端粒酶(seqidno:10)或其变体、副溶血弧菌细菌噬菌体vp58.5gp40(seqidno:14)或其变体和/或根癌土壤杆菌tela(seqidno:12)或其变体的应用是特别优选的。seqidno:2、4、6、8、10、12和14的变体包括其同系物或突变体。突变体包括关于天然序列的截短、置换或缺失。变体必须从如上所述的包含原核端粒酶靶序列的模板切割和重新连接(形成发夹)或产生闭合线性dna。在本文中提及的dna聚合酶或原核端粒酶的任何同系物通常是功能同系物，且通常与天然蛋白的有关区域具有至少40％同源性。使用已知方法可以测量同源性。例如，uwgcgpackage提供了可以用于计算同源性的bestfit程序(例如以它的默认设置使用)(devereux等人(1984)nucleicacidsresearch12,387-395)。pileup和blast算法可以用于计算同源性或比对序列(通常以它们的默认设置)，例如如在altschuls.f.(1993)jmolevol36:290-300；altschul,s,f等人(1990)jmolbiol215:403-10中所述。用于执行blast分析的软件可从国家生物技术信息中心(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)公开得到。blast算法执行两个序列之间的相似性的统计分析；参见例如，karlin和altschul(1993)proc.natl.acad.sci.usa90:5873-5787。由blast算法提供的一种相似性量度是最小总和概率(p(n))，它提供两个核苷酸或氨基酸序列之间偶然产生匹配的概率的指示。例如，如果在第一个序列与第二个序列的对比中的最小总和概率小于约1，优选地小于约0.1，更优选地小于约0.01，和最优选地小于约0.001，那么认为一个序列与另一个序列类似。变体多肽包含与天然蛋白具有至少40％同一性的序列(或由其组成)。在优选的实施方案中，变体序列可以在至少20个、优选地至少30个、例如至少40、60、100、200、300、400或更多个连续氨基酸上、或甚至在变体的整个序列上与天然蛋白的特定区域具有至少55％、65％、70％、75％、80％、85％、90％和更优选地至少95％、97％或99％同源性。可替换地，变体序列可以与全长天然蛋白具有至少55％、65％、70％、75％、80％、85％、90％和更优选地至少95％、97％或99％同源性。通常，变体序列与天然蛋白的有关区域相差至少或少于2、5、10、20、40、50或60个突变(其中的每个可以是置换、插入或缺失)。本发明的变体序列可以在上述序列的任意长度上与全长天然蛋白的特定区域具有一定同一性百分比，其与任何具体同源性百分比值相同(即它可以具有至少40％、55％、80％或90％和更优选地至少95％、97％或99％同一性)。天然蛋白的变体也包括截短体。可以使用任何截短体，只要所述变体仍然能够产生如上所述的闭合线性dna。通常制备截短体来去除催化活性非必需和/或不会影响折叠的蛋白的构象(尤其是活性部位的折叠)的序列。还可以选择截短体来提高原核端粒酶多肽的溶解度。通过从n-或c-端系统地截短不同长度的序列，可以常规地鉴别适当的截短体。天然蛋白的变体还包括这样的突变体：其相对于天然蛋白的特定区域具有一个或多个(例如，2、3、4、5-10、10-20、20-40或多个)氨基酸插入、置换或缺失。优选地在催化结构域之外造成缺失和插入。通常在源自天然蛋白的序列的n-或c-端末端处造成插入，例如为了重组表达的目的。通常还在催化活性非必需和/或不会影响折叠的蛋白的构象的区域中做出置换。可以做出这样的置换以提高所述酶的溶解度或其它特征。尽管通常不是优选的，还可以在活性部位中或在第二个球(即影响或接触活性部位中的一个或多个氨基酸的位置或取向的残基)中做出置换。可以做出这些置换以改善催化性能。置换优选地引入一个或多个保守变化，其将氨基酸用具有类似化学结构、类似化学性质或类似侧链体积的其它氨基酸替换。引入的氨基酸可以具有与它们所替换的氨基酸类似的极性、亲水性、疏水性、碱度、酸度、中性或电荷。可替换地，所述保守变化可以引入另一种芳族或脂族氨基酸来替代预先存在的芳族或脂族氨基酸。保守氨基酸变化是本领域众所周知的，且可以根据在表a中定义的20种主要氨基酸的性质进行选择。表a-氨基酸的化学性质特别优选的是，所述变体能够以与天然蛋白相当或相同的效率切割和重新连接、从固体支持物释放或产生如上所述的共价闭合dna。在促进原核端粒酶活性的条件下将在固体支持物上合成的dna与至少一种原核端粒酶一起温育。换而言之，所述条件促进包含原核端粒酶靶序列的dna的切割和重新连接以形成包含一个或多个发夹(其包含原核端粒酶靶序列的部分)的dna，诸如具有发夹末端的共价闭合dna。促进原核端粒酶活性的条件包含允许原核端粒酶活性的任意温度的使用，通常在20-90摄氏度的范围内。所述温度可以优选地在25-40摄氏度的范围内，诸如约25至约35摄氏度，或约30摄氏度。根据上面关于dna聚合酶的温度条件所述的原理，可以为特定原核端粒酶选择适当的温度。用于与seqidno:10的大肠杆菌细菌噬菌体teln原核端粒酶一起使用的合适温度是约25至约35摄氏度，诸如约30摄氏度。促进原核端粒酶活性的条件也包含合适的缓冲剂/ph和酶性能或稳定性所需的其它因子的存在。合适的条件包括本领域已知的用于提供原核端粒酶的活性的任何条件。例如，在使用大肠杆菌细菌噬菌体teln原核端粒酶的情况下，合适的缓冲液可以是30mmtris-hclph7.4、30mmkcl、7.5mmmgcl2、10mm(nh4)2so4和1mmdtt，其可以稀释2-8倍，这取决于使用的原核端粒酶的浓度。用于维持最佳活性和稳定性的试剂和条件也可以选自关于dna聚合酶列出的那些。在制备近侧和远侧原核端粒酶靶序列(其为不同原核端粒酶的靶序列)的情况下，可以使远侧原核端粒酶靶序列与它的相应原核端粒酶接触以形成远侧共价闭合dna末端，然后使所述在固体支持物近侧的原核端粒酶靶序列与它的相应原核端粒酶接触。因而，在延伸第二个非互补链或互补链之前，或在从固体支持物释放dna之前，可以用原核端粒酶封闭dna的远侧端部。在必要的情况下，可以改变反应条件以允许两种不同的原核端粒酶靶序列被它们的相应原核端粒酶进行最佳处理。在某些实施方案中，可能使用与第一和第二dna链的延伸所用条件相同的原核端粒酶活性条件。在其它实施方案中，在用于提供最佳dna聚合酶活性的条件导致次优原核端粒酶活性的情况下，可能必须改变反应条件。通过本领域已知的过滤、透析和其它方法可以实现特定试剂的去除和反应条件的变化。技术人员能够容易地鉴别允许最佳dna聚合酶活性和/或原核端粒酶活性的条件。在一个特别优选的实施方案中，为了通过rcadna聚合酶、优选phi29合成dna，如下进行dna合成：在基本上等于30mmtris-hcl(ph7.4)、30mmkcl、7.5mmmgcl2、10mm(nh4)2so4、1mmdtt、1-4mmdntp(诸如2mmdntp)或基本上由其组成的缓冲液条件下，在25-35摄氏度的温度，诸如约30摄氏度。使用原核端粒酶的处理步骤然后可以优选地用teln进行，和/或优选地在基本上等于以下条件或基本上由其组成的缓冲液条件下：用于dna聚合酶的缓冲液30mmtris-hcl(ph7.4)、30mmkcl、7.5mmmgcl2、10mm(nh4)2so4和1mmdtt的2-8倍稀释液，在25-35摄氏度的温度，诸如约30摄氏度。可以重组地生产用于本发明的方法中的所有酶和蛋白，例如在细菌中。可以使用技术人员已知的允许重组表达的任何方式。可以将质粒或包含编码目标蛋白的核酸序列的表达载体的其它形式引入细菌中，使得它们表达编码的蛋白。例如，关于seqidno:2、4、6、8、10、12或14的表达，所述载体可以分别包含seqidno:1、3、5、7、9、11或13的序列。然后通常将表达的蛋白以足够的量纯化，例如通过使用亲和标签，并以适合用在本发明的方法中的形式提供。这样的重组蛋白生产方法常规地是技术人员基于他们的一般知识可得到的。以上讨论适用于本文中讨论的任何蛋白的提供。dna的纯化和制剂在通过原核端粒酶的作用从固体支持物释放包含一个或多个发夹的dna产物以后，本发明的方法还可以包含纯化dna产物的步骤。通常执行上面提及的纯化以去除任何不希望的产物。可以通过本领域已知的任意合适的方法进行纯化。例如，处理可以包括苯酚/氯仿核酸纯化或使用选择性地结合核酸的柱，诸如可商购得自qiagen的那些。技术人员可以常规地鉴别用于分离dna的合适纯化技术。一旦dna产物已经生成并且以足够的量纯化，所述方法还可以包括将其配制为dna组合物，例如治疗性dna组合物。治疗性dna组合物将包含下面提及的类型的治疗性dna分子。这样的组合物将包含治疗有效量的dna，其呈适合通过所需途径施用的形式，例如气雾剂、可注射的组合物或适合口服、粘膜或局部施用的制剂。通过使用本领域技术人员可得到的标准药物制剂化学和方法，可以将dna配制为常规药物制剂。可以使用任何药学上可接受的载体或赋形剂。辅助物质(诸如润湿剂或乳化剂、ph缓冲物质等)可以存在于赋形剂或媒介物中。这些赋形剂、媒介物和辅助物质通常为药学试剂，它们可以在不引起不适当毒性的情况下施用，并且在疫苗组合物的情况下不会在接受该组合物的个体中诱导免疫应答。合适的载体可以是脂质体或dna纳米颗粒。通过使用压紧剂(compactionagents)(诸如阳离子聚合物)将dna浓缩成纳米颗粒，可以制备dna纳米颗粒。可以将dna浓缩聚合物缀合至充当核定位信号(nls)的肽以克服dna递送的细胞内和细胞外屏障。药学上可接受的赋形剂包括但不限于液体，诸如水、盐水、聚乙二醇、透明质酸、甘油和乙醇。在其中还可以包括药学上可接受的盐，例如，无机酸盐诸如盐酸盐、氢溴酸盐、磷酸盐、硫酸盐等；和有机酸盐，诸如乙酸盐、丙酸盐、丙二酸盐、苯甲酸盐等。尽管不需要，还优选的是，如果要在所述组合物中包含肽、蛋白或其它类似的分子，所述制剂将含有充当稳定剂(特别是针对这些分子的稳定剂)的药学上可接受的赋形剂。也充当肽的稳定剂的合适载体的例子包括但不限于制药级的葡萄糖、蔗糖、乳糖、海藻糖、甘露醇、山梨醇、肌醇、葡聚糖等。其它合适的载体包括但不限于，淀粉、纤维素、磷酸钠或磷酸钙、柠檬酸、酒石酸、甘氨酸、高分子量聚乙二醇(peg)和它们的组合。药学上可接受的赋形剂、媒介物和辅助物质的深入讨论可在通过引用并入本文的remington’spharmaceuticalsciences(mackpub.co.,n.j.1991)中得到。用于合成dna的寡核苷酸和试剂盒本发明还提供了适合用在本发明的方法中的寡核苷酸。所述寡核苷酸包含原核端粒酶的靶序列的第一部分，其侧接5’和3’区域。所述侧翼5’和3’区域优选地是非互补的。本发明还提供了固定化至固体支持物的本发明的寡核苷酸。所述固体支持物可以是如上所述的任何固体支持物。所述寡核苷酸可以通过如上所述的任何连接或间隔物固定化至固体支持物。所述固体支持物通常包含多个如上所述的寡核苷酸。本发明另外提供了试剂盒，其包含本发明的寡核苷酸和至少一种其它组分，所述组分选自固体支持物、一系列在序列上重叠的模板寡核苷酸和关于用在本发明的dna的合成方法中的说明书。所述试剂盒可以包含以上其它组分中的两种或所有三种。所述试剂盒还可以包含dna聚合酶和/或原核端粒酶，各自选自上述这些酶中的任一种。所述dna聚合酶优选地是phi29或其变体。所述原核端粒酶优选地是seqidno:10的细菌噬菌体n15teln或其变体、seqidno:14的细菌噬菌体vp58.5gp40或其变体、或seqidno:12的根癌土壤杆菌tela或其变体。所述试剂盒可以包含连接至固体支持物的本发明的寡核苷酸。包含发夹的dna分子本发明另外提供了单链和双链dna分子，其可以使用本发明的方法合成为产物本身。因此，本发明提供了单链环形dna，其包含含有原核端粒酶的靶序列的一部分的发夹。该产物也在本文中描述为缩紧的单链环形dna和/或lbdna。本发明还提供了包含(至少)两个发夹的单链环形dna，其中至少一个发夹包含原核端粒酶的靶序列的一部分。所述发夹通常彼此被单链区段隔开，所述单链区段是彼此非互补的。所述非互补的单链区段可以各自包含至少一个所需序列，诸如适体序列或用于表达的序列。不同的所需dna序列，诸如不同的适体序列，可以提供在每个非互补的单链区段中。优选地，包含原核端粒酶的靶序列的一部分的发夹含有seqidno:10的细菌噬菌体n15teln或其变体的靶序列的部分、seqidno14的细菌噬菌体vp58.5gp40或其变体的靶序列的部分、或seqidno:12的根癌土壤杆菌tela或其变体的靶序列的部分。在两个或更多个包含原核端粒酶的靶序列的一部分的发夹存在于单链环形dna中的情况下，它们可以各自包含相同原核端粒酶的靶序列的部分。可替换地，每个发夹可以包含不同原核端粒酶的靶序列的部分。一个发夹可以包含seqidno:10的细菌噬菌体n15teln或其变体的靶序列的部分，另一个发夹可以包含seqidno:12的根癌土壤杆菌tela或其变体的靶序列的部分，且另一个发夹可以包含seqidno14的细菌噬菌体vp58.5gp40或其变体的靶序列的部分。可替换地，除了包含原核端粒酶靶序列的部分的发夹以外，单链环形dna可以包含不是由原核端粒酶靶序列的部分形成的发夹。以上替代类型的发夹可以由相同链内的可以退火到一起的任何两个互补序列区域形成。连接发夹的两个臂的环可以包含所需dna序列，诸如如本文中所述的适体序列，并因而形成发夹环。所述单链环形dna可以包含在发夹内的适体序列和一个或多个在发夹的任一侧的非互补单链区段中的适体序列。可替换地，包含发夹的dna序列是完全互补的，且没有序列段在发夹的末端处成环。本发明另外提供了线性共价闭合双链dna，其在一个末端处被包含第一原核端粒酶的靶序列的一部分的发夹封闭，且在第二个末端处被包含第二原核端粒酶的靶序列的一部分的发夹封闭，其中所述第一和第二原核端粒酶是不同的。换言之，所述线性共价闭合dna(或闭合线性dna)包含第一发夹和第二发夹，所述第一发夹包含第一原核端粒酶的靶序列的一部分，所述第二发夹包含第二原核端粒酶的靶序列的一部分。所述第一原核端粒酶可以是seqidno:10的细菌噬菌体n15teln或其变体，且所述第二原核端粒酶可以是seqidno:12的根癌土壤杆菌tela或其变体。可替换地，所述第一和/或第二原核端粒酶可以是seqidno14的细菌噬菌体vp58.5gp40或其变体。本发明的单链环形和双链闭合线性dna分子具有作为治疗剂(即可以用于在体内表达基因产物的dna药物)的特定效用。这是因为它们的共价闭合结构阻止诸如外切核酸酶的酶的攻击，从而导致与具有暴露的dna末端的“开放”dna分子相比增强的稳定性和持久基因表达。已经证实线性双链的末端开放的盒当引入宿主组织中时就基因表达而言是无效的。这已经归因于由外切核酸酶在细胞外空间中的作用引起的盒不稳定性。在共价闭合结构内隔离dna末端也具有其它优点。dna末端被阻止与基因组dna整合，所以闭合线性dna分子具有提高的安全性。并且，闭合线性结构会阻止dna分子在宿主细胞内的多联化(concatamerisation)，因而可以以更敏感的方式调节基因产物的表达水平。另外，发明人认为本发明的单链环形dna分子会给用于表达的线性共价闭合dna分子提供优点，因为它们的结构是更开放的，因而预期更容易转录。本发明的dna分子可以包括编码治疗产物的dna序列(在上面描述为所需dna序列)。所述治疗产物可以是dna适体、蛋白、肽或rna，诸如小干扰rna。上面讨论了dna适体的示例性长度。为了提供治疗效用，这样的dna分子可以包含表达盒，其包含一个或多个启动子或增强子元件和编码目标mrna或蛋白的基因或其它编码序列。所述表达盒可以包含与编码目标蛋白的序列有效连接的真核启动子和任选的增强子和/或真核转录终止序列。本发明的dna分子可以用于生产在宿主细胞中表达的dna，特别是用于生产dna疫苗。dna疫苗通常编码传染性生物的dna的修饰形式。将dna疫苗施用给受试者，它们然后在此处表达传染性生物的选定蛋白，从而开始针对通常保护性蛋白的免疫应答。dna疫苗也可以在癌症免疫疗法方案中编码肿瘤抗原。任何dna疫苗可以用在本发明的dna分子中。并且，本发明的方法可以生产其它类型的治疗性dna分子，例如在基因治疗中使用的那些。例如，这样的dna分子可以用于表达功能基因，其中受试者具有由该基因的功能失调形式造成的遗传性障碍。这样的疾病的例子是本领域众所周知的。本发明的新结构还可以具有非医疗用途，包括在材料科学中、在数据存储中等。医学应用本发明的产品对于医学应用而言是特别优选的，因为例如考虑到它们会提供体内稳定性的优点。因此，本发明提供了本发明的单链环形dna或本发明的线性共价闭合双链dna，其用于用在治疗人或动物体的方法中，或用在在人或动物体上实施的诊断方法中。本发明还提供了治疗人或动物体的方法，所述方法包括给有此需要的人或动物施用治疗有效量的本发明的单链环形dna或本发明的线性共价闭合双链dna。在特定治疗方面，本发明的dna分子可以用作dna疫苗或用于基因治疗。所述dna分子可以用于诱导针对目标抗原的免疫应答，通常通过表达编码所述抗原的dna序列。本发明因而提供了在宿主中诱导针对抗原的免疫应答的方法，所述方法包括以特定方式给所述宿主施用编码所述所述抗原的本发明的单链环形dna或线性共价闭合双链dna，所述方式使得所述抗原在所述宿主中表达并诱导针对所述抗原的免疫应答。所述抗原可以选自任意合适的抗原。在其它实施方案中，本发明的dna分子可以包括一个或多个适体序列，其可以用于为了治疗目的特异性地识别靶分子。在dna分子中可以包括任何目标靶分子的适体序列。本发明的dna分子可以为了如上所述的治疗目的而配制，且例如提供在合适的载体诸如脂质体或dna纳米颗粒中。通过使用多种已知的途径和技术，可以将包含本发明的dna分子的药物制剂在体内递送给受试者。例如，可以将药物制剂提供为可注射的溶液、混悬液或乳剂，并使用常规针头和注射器、显微操作针和注射器或使用液体喷射注射系统经由胃肠外、皮下、表皮、真皮内、肌肉内、淋巴内、动脉内、腹膜内或静脉内注射进行施用。可以使用诸如microtine贴剂的贴剂进行所述施用。还可以将药物制剂局部地施用至皮肤或粘膜组织，诸如鼻、扁桃体内、气管内、肠、直肠地或阴道，或提供为适合用于呼吸或肺施用的精细粉碎的喷雾剂。其它施用模式包括口服施用、栓剂、舌下施用和主动或被动透皮递送技术。可以根据经验确定要施用的dna分子的合适量。施用剂量将取决于许多因素，包括dna分子的性质和作用模式、药物制剂、施用途径以及施用方案的计划和时机。本文描述的dna分子的合适剂量可以是微克(μg)、毫克(mg)或多达克(g)的量级。dna分子的单次施用可以足以对患者具有有益效果，但是应当理解，可能有益的是，将dna分子施用超过一次，在该情况下，典型施用方案可以是，例如，每周一次或两次持续2-4周(每6个月)，或每天1次持续1周(每4-6个月)。新结构的合成优选地，使用本发明的方法合成本文中公开的新结构。合成这样的结构的替代方法是可想象的，且包括不使用固定化的模板依赖性延伸，或可替换地，将初始寡核苷酸连接至5’标签。模板依赖性延伸可能涉及热循环以逐步方式替代模板，因为这允许“用过的”模板的变性和新鲜模板的退火以允许延伸。可替换地或额外地，制备新结构的方法可能涉及不同的酶诸如解螺旋酶，即大肠杆菌rep和嗜热脂肪芽孢杆菌pcra。可以使用任意合适的制备这些新结构的方法，所述新结构包含至少一种原核端粒酶衍生的发夹。合成模板的下游扩增在固体支持物上进行的本发明的方法的新结构和/或产物可以用作模板用于进一步的dna扩增。这会提供大规模dna生产的方法，其可以完全在体外无细胞环境中进行，不需要在细菌中扩增开始模板。本发明因而提供了使用本发明的单链环形dna或本发明的线性共价闭合双链dna作为模板扩增dna的体外无细胞方法。以上方法还可以包含根据在固体支持物上进行的本发明的dna生产方法初步生产dna模板。在扩增之前，可以将本发明的单链环形dna转化成双链dna，该过程需要非链置换dna聚合酶和连接酶。使用任一种模板的以上方法包括，在有一种或多种引物存在下，在促进模板扩增的条件下，使所述模板与至少一种dna聚合酶接触。所述dna聚合酶可以选自以上关于用于在本发明的固体支持物上生产dna的方法描述的任何dna聚合酶。但是，所述dna聚合酶优选地是链置换型聚合酶，更优选滚环扩增(rca)聚合酶。一种优选的rca聚合酶是phi29或其变体。促进模板扩增的条件通常选自以上关于固定化的寡核苷酸在固体支持物上的模板依赖性延伸所述的那些。在模板是线性共价闭合双链dna的情况下，可以在促进模板dna扩增的条件之前或过程中将它在变性条件下温育以形成单链环形dna。所述一种或多种引物可以是与dna模板杂交并产生引发dna合成反应的dna:引物杂交物的寡核苷酸。所述引物可以是非特异性的(即在序列上是随机的)，或可以是对在dna模板内包含的一个或多个序列特异的。优选的是，所述引物具有随机序列，从而允许在dna模板的任何位点处的非特异性起始。这允许通过来自每个模板链的多个起始反应实现高扩增效率。随机引物的例子是六聚体、七聚体、八聚体、九聚体、十聚体或在长度上更大的序列，例如12、15、18、20或30个核苷酸的长度。随机引物可以具有6-30、8-30或12-30个核苷酸的长度。通常将随机引物提供为寡核苷酸的混合物，其代表dna模板中例如六聚体、七聚体、八聚体或九聚体的所有潜在组合。在其它实施方案中，所述引物是特异性的。这意味着它们的序列与dna模板中希望从其开始扩增的序列互补。在该实施方案中，单一引物或引物对可以用于特异性地扩增dna模板以分别产生单链或双链dna。在另一个实施方案中，可以使用能够特异性地结合在dna模板内包含的原核端粒酶靶序列所含的回文序列的引物。这样的引物能够结合模板的每个互补链，并从而引发在两条链上的扩增，使得每个模板仅需要一种引物分子。如果所述模板是单链的，将仅需要一种引物。在dna模板是缩紧的单链环形dna的情况下，可能使用单种引物。该引物可以结合单链dna内的靶序列，或可替换地特异性地结合在发夹内的原核端粒酶靶序列的部分。引物可以是未标记的，或可以包含一种或多种标记，例如放射性核素或荧光染料。引物也可以包含化学修饰的核苷酸。引物也可以包含用于固定化至固体支持物的非互补间隔序列的部分。通常可以基于温度考虑来选择引物长度/序列，即能够在扩增步骤所用的温度结合模板。dna模板与dna聚合酶和一种或多种引物的接触在促进引物与dna模板的退火的条件下发生。所述条件包括允许引物杂交的单链dna的存在。所述条件也包括允许引物与模板的退火的温度和缓冲液。可以根据引物的性质选择适当的退火/杂交条件。在本发明中使用的优选退火条件的一个例子包括缓冲液30mmtris-hclph7.5、20mmkcl、8mmmgcl2。所述退火可以通过在变性以后逐渐冷却至所需反应温度来进行。从本发明的dna模板进行扩增的以上方法可能产生包含多联体的扩增的dna，所述多联体包含扩增的dna序列的重复单元，通常其中使用rca扩增。如果模板是根据本发明的具有至少一个发夹的单链dna(其中引物选自在原核端粒酶靶序列之外的区域)，通过扩增该结构制备的多联体将是具有原核端粒酶靶序列的插入部分的单链dna(其在序列上与模板dna互补)的多个重复。在一个实施方案中，将所述单链dna合成为反义链，使得所述多联体形成有义链。如果用于rca扩增的引物选自原核端粒酶靶序列内，那么得到的产物将是双链多联体，因为扩增的dna的初始链将可用于引发。通过多种方法可以将通过新结构的扩增产生的单链dna多联体拆分成包含所需目标序列的扩增的dna的单个单元。通过一种或多种核酸酶，诸如内切核酸酶，可以拆分多联体。在特定实施方案中，单链环形dna模板可以包含(在一个或两个末端)侧接目标序列诸如dna适体的内切核酸酶位点，使得所述适体序列可以以线性形式特异性地释放和/或从扩增的dna序列的剩余部分切离。通过原核端粒酶的作用可以将双链多联体拆分成闭合线性dna。在另一个实施方案中，在将本发明的线性共价闭合双链dna用作模板的情况下，第一和第二原核端粒酶的原核端粒酶靶序列存在于所述模板中，使得扩增的dna可以与第一和第二原核端粒酶接触以从扩增的dna释放单个线性共价闭合dna单元。所述第一和第二原核端粒酶优选地选自seqidno:15的细菌噬菌体n15teln或其变体、副溶血弧菌细菌噬菌体vp58.5gp40(seqidno:14)或其变体和/或seqidno:31的根癌土壤杆菌tela或其变体。可以如上所述纯化和配制从以上dna扩增方法得到的扩增的dna。本发明还提供了制备药物组合物的方法，其包括进行如上所述的用于生产dna或用于扩增dna的方法，并用药学上可接受的载体或稀释剂配制得到的dna产物或扩增的dna。实施例实施例1试剂dynabeadsmyone抗生蛋白链菌素c1(lifetechnologies),nxgenphi20dna聚合酶(lucigen),内部生产(producedinhouse)的原核端粒酶teln(储备液浓度20.5μm),外切核酸酶iii(enzymatics),dntp混合物(含有锂盐)(bioline),不含核酸酶的水(sigmaaldrich),naoh(fisherscientific),qubitdsdnabr(宽范围)测定试剂盒(lifetechnologies),qubitdsdnahs(高灵敏度)测定试剂盒(lifetechnologies),safewhitenucleicacidstain(nbsbiologicals),琼脂糖(nbsbiologicals),寡核苷酸s1,seqidno.23,(oligofactory),低分子量dna梯度(newenglandbiolabs),10xtlg缓冲试剂:300mmtrishclph7.4(sigmaaldrich),300mmkcl(sigmaaldrich),75mmmgcl2(sigmaaldrich),50mm(nh4)2so4(sigmaaldrich),不含核酸酶的水(sigmaaldrich)iba寡核苷酸(5’至3’)：pegs1:与seqidno.24连接的生物素c6,pegs2:seqidno.25,pegs3:seqidno.26,pegs4:seqidno.27,pegs5:seqidno.28,pegs6:seqidno.29,pegs7:seqidno.30。寡核苷酸设计设计寡核苷酸模板以生产包含194bp序列的共价闭合线性dna构建体，其含有在每个末端处终止的cmv启动子序列的前108bp，具有包含原核端粒酶teln靶序列的部分的发夹环(图11b)。使用seqbuilder(http://www.dnastar.com/t-seqbuilder.aspx)设计7个寡核苷酸序列，将其用于通过模板依赖性的引物延伸构建闭合线性dna。寡核苷酸pegs1(具有71个碱基的长度)编码原核端粒酶teln靶序列的第一部分，且具有在5’末端上的生物素c6修饰，这使它能够固定化至抗生蛋白链菌素包被的磁珠上。寡核苷酸pegs2至pegs6(分别是45个碱基、45个碱基、35个碱基、40个碱基和30个碱基的长度)共同地编码cmv启动子序列并充当第一个固定化的寡核苷酸(其充当引物)的延伸的连续模板。第七个寡核苷酸(pegs7，具有74个碱基的长度)含有原核端粒酶teln靶序列的第二部分)。每种寡核苷酸模板含有在它的3’末端处与延伸中的固定化的寡核苷酸的延伸中的3’末端的15碱基对重叠。在溶液中的第一个延伸步骤使用寡核苷酸pegs2作为模板的寡核苷酸pegs1的第一个延伸步骤在溶液中进行。在0.2mlpcr试管中组合以下试剂：33.5μl不含核酸酶的水、5μl10xtlg缓冲液ph7.4、2.5μl100mmdntp(500μm的终浓度)、2.5μl100μm寡核苷酸1(5μm的终浓度)、5μl100μl寡核苷酸2(10μm的终浓度)和15单位phi29，以提供50μl的总反应物。将反应物混合，并在innova40培养箱中在没有摇动下在30℃温育30分钟(newbrunswickscientific)。寡核苷酸固定化和延伸将抗生蛋白链菌素包被的磁珠的等分试样(30μl/延伸反应)放在1.5ml微量离心管中并用400μl1xtlg缓冲液(ph7.4)洗涤3次。根据生产商的说明书，使用磁性微量离心机支架使缓冲液从珠子分离并去除。然后将珠子再悬浮于60μl1xtlg缓冲液中并与上述的50μl第一延伸反应物混合。将珠子在轻轻摇动(50rpm)下在室温温育1小时。固定化以后，将第一延伸反应物去除，并将珠子在400μl10mmnaoh中洗涤。这导致链变性并允许从连接至珠子的新延伸的第一寡核苷酸去除第二寡核苷酸模板。进行三次10mmnaoh洗涤以确保以前的寡核苷酸的完全变性和充分去除。然后将珠子在400μl1xtlg缓冲液ph7.4中洗涤。去除缓冲液洗液以后，将以下试剂加给珠子以进行50μl延伸反应：31μl水、5μl100mmnaoh、5μl寡核苷酸模板3(10μm的终浓度)、5μl10xtlg缓冲液ph7.4、2.5μl100mmdntp(500μm)和15单位的phi29dna聚合酶，以提供50μl的总反应体积。将反应物混合，并在没有摇动下在30℃温育10分钟。然后将反应物去除，并将珠子用400μl10mmnaoh洗涤3次和用400μl1xtlg缓冲液ph7.4洗涤1次。然后如上所述为寡核苷酸模板pegs4、pegs5、pegs6和pegs7重复延伸反应。当最终的寡核苷酸模板(pegs7)已经加入且第一链延伸结束时，将所述珠子用10mmnaoh洗涤以使它变性和去除，并允许引入的teln序列折叠和形成发夹。使用发夹的3’末端启始与现在完整的模板延伸的第一链互补的链的合成。对于50μl的最终反应体积，加入下述组分以完成反应：41.5μl不含核酸酶的水、5μl10xtgl缓冲液ph7.4、2.5μl100mmdntp(对于500μm的终浓度)和15单位的phi29。将反应物混合并在没有摇动下在30℃温育10分钟。原核端粒酶teln消化在最终反应以完成双链延伸产物的合成以后，将珠子用400μl1xtlg缓冲液ph7.4洗涤2次。然后将珠子再悬浮于98μl1xtlg缓冲液中，并加入2μl原核端粒酶teln(400nm)以从珠子表面切割延伸产物。将反应物在30℃温育15分钟。在加入teln之前和之后获得高灵敏度qubit读出，从表面切割的产物的量是1.15μg/ml。滚环扩增(rca)将使用phi29dna聚合酶的滚环扩增(rca)用于增加从珠子表面切割的产物的量。如下建立rca反应：将teln序列特异性的寡核苷酸s1(30μm)加入teln消化物中。将反应物加热至95℃保持5分钟，并然后冷却至4℃。然后将dntp加入以产生1mm的终浓度，随后加入20单位的phi29dna聚合酶。将反应物在30℃温育过夜。teln和外切核酸酶iii消化将过夜rca多联体dna产物(15.1μg/ml)用500nm原核端粒酶teln在30℃消化15分钟。从teln消化反应物取25μl等分试样，并加入20u外切核酸酶iii和在37℃温育30分钟。将teln消化产物和teln/exoiii产物(各25μl样品)在75℃热处理1分钟，并然后在2％琼脂糖凝胶上在50v与safewhitedna染料一起跑胶。图12泳道1显示了参照dna梯度。泳道2显示了由共价闭合线性dna产物的扩增(通过rca)产生的带，以产生多联体，然后将其用原核端粒酶teln消化。清楚地，在200bp区域中存在与预期产物的大小对应的带。用外切核酸酶iii(泳道3)进一步处理会去除污染(开放末端的)片段，但是剩下产物带。这证实，模板延伸的产物具有预期的大小，且具有共价闭合末端(耐受外切核酸酶作用)。实施例2-共价闭合线性dna(dbdna)的酶促合成试剂高保真度dna聚合酶(newenglandbiolabs),内部生产的原核端粒酶teln(储备液浓度20.5μm),内部生产的原核端粒酶vp58.5(储备液浓度21.5μm),t5外切核酸酶(newenglandbiolabs),dntp混合物(含有锂盐)(bioline),不含核酸酶的水(sigmaaldrich),gelredss/dsdna染料(biotium),10％tbe预浇铸page凝胶(thermofisher),低范围(lr)和1kbdna梯度(newenglandbiolabs)1×的等温扩增缓冲液(“iab”,newenglandbiolabs)包含:20mmtris-hcl；10mm(nh4)2so4；50mmkcl；2mmmgso4和0.1％吐温20，1×的缓冲液4(newenglandbiolabs)包含：50mm乙酸钾；20mmtris-乙酸盐；10mm醋酸镁和1mmdtt,来自20×储存液(thermofisher)的tbe缓冲液。表1:寡核苷酸(integrateddnatechnologies)寡核苷酸设计设计寡核苷酸模板以生产包含171碱基对序列的共价闭合线性dna构建体，其在一个末端处以包含原核端粒酶teln靶序列的部分的发夹环终止且在另一个末端处以包含原核端粒酶vp58.5靶序列的部分的发夹环终止。寡核苷酸1.120(具有79个核苷酸的长度)编码原核端粒酶teln靶序列且在5’末端处被alexa488荧光团修饰。寡核苷酸1.112、1.113和1.114(分别具有60、54和60个核苷酸的长度)共同地编码cmv启动子序列的部分，且充当用于延伸第一寡核苷酸1.120(其充当引物)的连续模板。第五寡核苷酸(1.107v，具有80个核苷酸的长度)编码原核端粒酶vp58.5靶序列的部分。每种寡核苷酸模板含有在它的3’末端处与延伸中的寡核苷酸引物的3’末端的重叠；这些重叠段在表中用斜体字标记且标有下划线。反应条件使用温度循环程序执行在该实验中的延伸反应。反应体积在所有情况下为50μl，包含等温扩增缓冲液(1x浓度)、dntp混合物(800μm)、200μm每种寡核苷酸(1.120、1.112、1.113、1.114和1.107v)和1单位的高保真度dna聚合酶(newenglandbiolabs)。在下述条件下在bioradc1000热循环仪中进行温度循环反应：在95℃2分钟；50个包含以下内容的循环：在95℃1分钟、在50℃1分钟、在72℃1分钟；在72℃10分钟；4℃结束。所述反应产生末端开放的双链dna，其包含来自5个寡核苷酸的序列。所述分子的一个末端包含整个teln原核端粒酶靶序列，而另一个末端包含整个vp58.5靶序列(完整大小的线性产物)。每个链的5’末端用alexa488荧光团标记，使它在490nm波长的蓝光下可见。当用原核端粒酶处理时，延伸反应的产物产生共价闭合线性dna。在与延伸反应相同的缓冲液中进行原核端粒酶反应-也就是说，将原核端粒酶直接加入结束以后的循环反应中。将各种原核端粒酶加入至1μm的终浓度，但是在加入teln和vp58.5原核端粒酶的情况下，将各自的浓度降低至0.5μm。将反应物在37℃温育15-30分钟，并在75℃灭活另外10分钟。凝胶电泳在该实施例中的凝胶都是天然10％tbepage凝胶，在1×tbe缓冲液中在180伏特跑胶。在490nm(对于荧光地标记的分子)或在300nm(用3倍浓缩的gelredtmdna染料染色1小时以后)波长激发下进行成像，以使所有存在的dna/寡核苷酸成像。结果显示为图14和15。图14的泳道1显示了与模板延伸反应以后形成的完整大小线性产物对应的亮带。较低的亮带对应于未引入的荧光标记的寡核苷酸，即1.107v和1.120。图15中的对应泳道证实了完整大小线性产物的存在。泳道2和3(图15)显示了与完整大小线性产物对应的带，所述完整大小线性产物在一个末端处分别用teln或vp58.5原核端粒酶切割和连接。非常短的发夹原核端粒酶序列从该反应的释放在图14泳道2和3中也显而易见，并证实了原核端粒酶活性。用原核端粒酶teln和vp58.5对完整大小线性产物进行的处理会产生共价闭合线性dna产物dbdna(图15,泳道4)。在图15泳道5中指示了其证实，所述泳道5显示了仅单个带，其对应于希望的dbdna产物的正确大小。所有其它末端开放的线性产物已经被外切核酸酶t5完全水解，所述外切核酸酶t5以0.2单位/μl的浓度在1×neb缓冲液4中加入反应物中。t5外切核酸酶从5’和3’末端攻击具有钝或悬突末端的单链和双链dna。dbdna可耐受外切核酸酶t5，因为它是环形，没有游离末端(5’或3’)可被攻击。这在图14的泳道5中进一步证实，其中如预期的，没有可见的荧光dna/寡核苷酸，且所有荧光位于在凝胶的最底部处的带中，在此处预期会发现dntp。在完整大小线性产物的每个末端处的荧光标签已经被原核端粒酶切掉，剩下非荧光的且因此不可见的dbdna(当使用该成像时)，而使用gelred可以看到它，如在图15上所示。释放的荧光发夹已经被t5外切核酸酶水解成dntp。数据证实了闭合线性dna产物的成功合成。实施例3-共价闭合线性dna(dbdna)在固体表面上的酶促合成试剂使用与在实施例2中所指示相同的试剂，加上5nm金纳米颗粒(cytodiagnostics)。表2:寡核苷酸(integrateddnatechnologies)编码侧接cmv启动子和聚-a尾的egfp基因序列，都在原核端粒酶teln靶位内。寡核苷酸设计设计寡核苷酸模板来生产包含525碱基对序列的共价闭合线性dna(dbdna)构建体，其在每个末端处以包含原核端粒酶teln靶序列的部分的发夹环终止。将寡核苷酸3.1(具有81个核苷酸的长度)用连接至末端5’磷酸酯的两个巯基修饰以允许共价连接至制备的固体表面。寡核苷酸3.2(具有200个核苷酸的长度)编码原核端粒酶teln靶序列和cmv启动子序列的部分，且寡核苷酸3.3和3.4(各自200个核苷酸的长度)共同地编码cmv启动子序列的另一部分。这三种寡核苷酸一起充当第一寡核苷酸3.1(其充当引物)的延伸的连续模板。第五寡核苷酸(3.5，具有64个核苷酸的长度)编码原核端粒酶teln靶序列的部分。该寡核苷酸不含有完整原核端粒酶位点，而是编码刚好超过一半-这将允许延伸链在它自身上‘向后成环’以实现延伸从而形成双链寡核苷酸。如此形成的环具有与通过它的靶位的成功原核端粒酶teln切割产生的发夹环相同的序列。每种寡核苷酸模板含有在它的3’末端处与延伸中的寡核苷酸引物的3’末端的重叠(标有下划线且用斜体字显示的序列标记了这些重叠段)。在寡核苷酸3.2-3.5的3’末端处的最后3个核苷酸不与延伸中的链互补以阻止dna聚合酶对它们的不希望的延伸。寡核苷酸3.1在‘金纳米颗粒’上的固定化按照生产商关于5nmoligoreadygoldnanoparticleconjugation试剂盒的说明书的指导，执行硫醇盐化的寡核苷酸的脱保护和该寡核苷酸与金纳米颗粒的连接。使用来自gehealthcare的g-25柱从dtt分离去保护的寡核苷酸，并通过在30kda旋转浓缩柱(millipore)中在4,500g离心在ddh2o中重复(10x)洗涤，纯化连接的寡核苷酸。反应条件通过使用上述的寡核苷酸模板，如在实施例2中所述进行通过热循环实现的延伸反应。但是，在该实验中，将起始寡核苷酸引物共价地连接至金纳米颗粒，使得延伸反应在表面上进行。所述反应产生固定化的dsdna分子，其包含来自5种寡核苷酸的序列。在金纳米颗粒近侧的分子的末端包含完整的teln原核端粒酶靶序列，而远侧端部包含与它的靶位的teln切割所产生的序列相同的发夹序列。因此，当用teln原核端粒酶处理时，延伸反应的产物是从金纳米颗粒切割的共价闭合线性dna(dbdna)。在与延伸反应相同的缓冲液中进行原核端粒酶teln反应，即，将原核端粒酶直接加入结束以后的循环反应中。将原核端粒酶加入至0.5μm的终浓度。将反应物在37℃温育15-30分钟，并在75℃灭活另外10分钟。将外切核酸酶t5以0.2单位/μl的浓度在1×neb缓冲液4(50mm乙酸钾；20mmtris-乙酸盐；10mm醋酸镁和1mmdtt)中加入反应物中。凝胶电泳在图16中显示的凝胶是天然10％tbepage凝胶，在1×tbe缓冲液中在180伏特跑胶。用3倍浓缩的gelredtmdna染料染色1小时以后用在300nm的波长激发进行成像，以使所有存在的dna/寡核苷酸成像。如在图16中所示，通过在实施例2中描述的方法，但是用固定化在5nm直径表面上的起始寡核苷酸3.1，可以生产dbdna。反应物中的大量dna通过它与金纳米颗粒的融合受到阻碍不能进入琼脂糖(泳道3)。但是，dbdna当通过teln切割而释放并通过t5处理而纯化时，作为单个外切核酸酶抗性带泳动至通过它的大小预见到的位置(泳道7)。实施例4–通过原核端粒酶的作用共价闭合的环形单链dna的合成本实施例描述了含有原核端粒酶靶序列的单链环形dna(被称作lbdna)的合成。该结构可以以与双链共价闭合线性dna相同的方式利用，但是具有单链环永久地打开以转录成rna的潜在优点。另外，可以设计单链环段以编码具有特异性分子结合性能的适体序列用于诊断和医学应用。已经从159个核苷酸长的寡核苷酸合成了环形单链dna，所述寡核苷酸编码据报道会抑制蜡状芽孢杆菌(bacilluscereus)中的金属-β-内酰胺酶酶活性的适体序列(kim.s-k等人,2009,chemicalbiology&drugdesign,74(4),343-348)。所述寡核苷酸的序列和转化成环形单链构建体的方法描述在表3和图17a至c中。表3:lbdna前体寡核苷酸的序列。反向互补序列标有下划线，适体序列以斜体字显示，间隔序列以粗体显示。由integrateddnatechnologies提供。可以将单个寡核苷酸延伸并加工成lbdna设计了159nt寡核苷酸，其由原核端粒酶位点和随后的侧接两个反向互补序列的适体序列组成。制备了两种变体dna-t和dna-v，其中引入的原核端粒酶靶位分别是teln和vp58.5(表3)。在寡核苷酸内的自互补序列可以在适当条件下彼此结合以形成短双链序列，其3’末端可以被dna聚合酶延伸。3’末端的延伸导致可以被切割和连接(通过适当的原核端粒酶)的完整原核端粒酶位点的形成，以形成希望的环形共价闭合单链构建体(lbdna)和短废物发夹序列。通过如前所述的t5外切核酸酶处理和通过凝胶电泳对残存带的鉴别(参见图18a和18b)，做出成功反应的确认。反应条件已经对由idt供应的159nt寡核苷酸进行标准的脱盐纯化，并在双蒸馏水中稀释至200μm的储备液浓度。然后将每种寡核苷酸在50μl反应体积中稀释至3种浓度-0.1、0.5和1μm，所述反应体积也含有：1×浓度的iab缓冲液，100μm的dntp混合物，1单位的hfdna聚合酶如下循环这些反应物：在95℃2分钟；35个包含以下内容的循环：在95℃30秒，然后以2℃/秒下降至在55℃30秒，在72℃30秒；在72℃10分钟；4℃结束将这些反应物分成10μl等分试样，加入neb缓冲液4至(1×)终浓度，且在指示时，加入原核端粒酶至2.5μm的终浓度，以确保它过量。然后将所有等分试样在37℃温育15分钟。然后在有和没有原核端粒酶存在下将5单位的t5外切核酸酶加入指示的等分试样中，并在37℃温育30分钟。然后使温度升高至75℃保持15分钟以将酶热灭活。表4描绘了加入每个等分试样中的酶：等分试样1-lh图18a等分试样2-rh图18a等分试样3-lh图18b等分试样4-rh图18b没有原核端粒酶没有原核端粒酶原核端粒酶原核端粒酶没有外切核酸酶外切核酸酶没有外切核酸酶外切核酸酶将5μl这些反应物加载到10％tbepage凝胶上并跑胶，如在图18a和18b中所示。图18a(lh)表明，在没有任何酶存在下，所述寡核苷酸泳动至它们的预期大小，但是在有t5外切核酸酶存在下，它们被完全水解(图18arh)。当暴露于原核端粒酶时，废‘帽’或副产物带以及对应的产物带出现(图18blh)。这证实了向后成环延伸和原核端粒酶靶位的成功形成(图18blh)。随后向外切核酸酶的暴露(图18brh)揭示了代表共价闭合环形dna(lbdna)的残存带。这不同于直接暴露于外切核酸酶的线性寡核苷酸，后者被完全水解(图18arh)。序列表<110>塔驰莱特遗传有限公司<120>dna合成的方法<130>p6087wo1<150>gb1502645.3<151>2015-02-17<160>43<170>patentin3.3版<210>1<211>1563<212>dna<213>海水盐单胞菌噬菌体phihap-1<220><221>misc_feature<223>原核端粒酶<400>1atgagcggtgagtcacgtagaaaggtcgatttagcggaattgatagagtggttgctcagc60gagatcaaagagatcgacgccgatgatgagatgccacgtaaagagaaaaccaagcgcatg120gcgcggctggcacgtagcttcaaaacgcgcctgcatgatgacaagcgccgcaaggattct180gagcggatcgcggtcacgacctttcgccgctacatgacagaagcgcgcaaggcggtgact240gcgcagaactggcgccatcacagcttcgaccagcagatcgagcggctggccagccgctac300ccggcttatgccagcaagctggaagcgctcggcaagctgaccgatatcagcgccattcgt360atggcccaccgcgagctgctcgaccagatccgcaacgatgacgacgcttatgaggacatc420cgggcgatgaagctggaccatgaaatcatgcgccacctgacgttgagctctgcacagaaa480agcacgctggctgaagaggccagcgagacgctggaagagcgcgcggtgaacacggtcgag540atcaactaccactggttgatggagacggtttacgagctgctgagtaaccgggagagaatg600gtcgatggggagtatcgcggctttttcagttacctagcgcttgggctggcgctggccacc660gggcgtcgctcgatcgaggtgctgaagaccggacggatcacgaaggtgggcgagtatgag720ctggagttcagcggccaggcgaaaaagcgcggcggcgtcgactatagcgaggcttaccac780atttataccctggtgaaagctgacctggtgatcgaagcgtgggatgagcttcgctcgctg840ccggaagctgctgagctgcagggcatggacaacagcgatgtgaaccgccgcacggcgaag900acgctcaacacgctcactaagcggatctttaacaacgatgagcgcgttttcaaggacagc960cgggcgatctgggcgcggctggtgtttgagctgcacttctcgcgcgacaagcgctggaag1020aaagtcaccgaggacgtgttctggcgtgagatgctggggcatgaggacatggatacacag1080cgcagctaccgcgcctttaaaatcgactacgacgagccggatcaagccgaccaggaagat1140tacgaacacgctagccgcctcgccgcgctgcaggcgctggacggccatgagcagcttgag1200agcagcgacgcccaggcgcgtgtgcatgcctgggtgaaagcgcagatcgagcaggagcct1260gacgcgaaaattacgcagtctctgatcagccgggagctgggcgtttatcgccctgccata1320aaagcgtacctggagctggcgcgagaggcgctcgacgcgccgaacgtcgatctggacaag1380gtcgcggcggcagtgccgaaggaagtagccgaggcgaagccccggctgaacgcccaccca1440caaggggatggcaggtgggtcggggtggcttcaatcaacggggtggaagttgcacgggtg1500ggcaaccaggcaggccggatcgaagcgatgaaagcggcctataaagcggcgggtgggcgc1560tga1563<210>2<211>520<212>prt<213>海水盐单胞菌噬菌体phihap-1<220><221>misc_feature<223>原核端粒酶<400>2metserglygluserargarglysvalaspleualagluleuileglu151015trpleuleusergluilelysgluileaspalaaspaspglumetpro202530arglysglulysthrlysargmetalaargleualaargserphelys354045thrargleuhisaspasplysargarglysaspsergluargileala505560valthrthrpheargargtyrmetthrglualaarglysalavalthr65707580alaglnasntrparghishisserpheaspglnglnilegluargleu859095alaserargtyrproalatyralaserlysleuglualaleuglylys100105110leuthraspileseralaileargmetalahisarggluleuleuasp115120125glnileargasnaspaspaspalatyrgluaspileargalametlys130135140leuasphisgluilemetarghisleuthrleuserseralaglnlys145150155160serthrleualagluglualasergluthrleuglugluargalaval165170175asnthrvalgluileasntyrhistrpleumetgluthrvaltyrglu180185190leuleuserasnarggluargmetvalaspglyglutyrargglyphe195200205phesertyrleualaleuglyleualaleualathrglyargargse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aaaacggc1320ctgcagcttgaccaaataaccacaagctatctgagaaaaatgtgcatcatcaacaacaaa1380agcctcaatgcaaacaccatcgccaagtacctggaaacattgaacctagataaggttcca1440gcagagcaagaggaaagccatcaggaagaactggagcaggaagaagatcagaaagtgtca1500tggccaaaagctaaagacattaaggtccagtctaaaaaagaaggtgatatgtggcatgtc1560tggactgaggttaacggaatgcggtgggaaaattggtctaaaggtagaaaaacagaagct1620gtgaaggcattgcgacaacaatatgagagggaatcagcggaaatgtaa1668<210>14<211>555<212>prt<213>副溶血弧菌噬菌体vp58.5gp40<220><221>misc_feature<223>原核端粒酶<400>14metlysleuthraspglymetaspargthrlystyrilevallysala151015alalyshisileglnglugluglyglnglulysglyprolystyrile202530thraspargcysglyargvalalalysaspgluhislysargleugly354045trpvalvalaspglnvalserglygluleualaserasnproglnile505560serhisasnhistyrileasnleumetasnasntyrargargalaile65707580lysalaleuglytyrlyshishisglnileglulysthrleuvalthr859095pheileasnlystyrglnglutyrargprogluilealaglumetleu100105110aspproserleuproileaspthrleuarggluasnvalileleuleu115120125lysserglnalaargserlysserglupheargseraspleuleugly130135140leuargilegluphehisleutyrtyrleuphegluprolysglyile145150155160alathrasplysarglysgluglnvallysglualaleuasnglulys165170175hisgluasnvalilelysileasnglyasphisilelysgluleuala180185190thrlysileleuserglulysaspprosertyrthraspleualaval195200205glyleualaleualathrglyargargalaasngluilemetlysthr210215220alaserphelyslysserglygluargserleumetphegluglygln225230235240leulysthrhisasnargtyrleupheglugluileglyalatyrglu245250255ileprocysilevalaspseraspleuvalilelysglyleulysleu260265270leuarglyslysthrglyalagluileleuglutyrthraspvalthr275280285glyargthrvallyslysalavalalaaspglyaspthrlysaspleu290295300arghisasnaspalavalasnleuargphethralaserleuasngln305310315320argvallysalaileleuglyhisglyglupheserpheargthrcys325330335argalailetyrvalgluilealaphehisgluphearghisasngly340345350gluserlysalaalapheargserargvalleuglyhisserglygly355360365asplysserthrglnasnhistyrgluglyphegluleuaspserlys370375380valgluthrileglyvalvalaspmetglyglnasnglualaasplys385390395400sertyrasnlysglnleuleulyshisleugluglntyraspalathr405410415ilealaalatyrleuargalaproasntrplyshisilehisasptrp420425430leulysaspglnvallysasnglyleuglnleuaspglnilethrthr435440445sertyrleuarglysmetcysileileasnasnlysserleuasnala450455460asnthrilealalystyrleugluthrleuasnleuasplysvalpro465470475480alagluglnglugluserhisglnglugluleugluglnglugluasp485490495glnlysvalsertrpprolysalalysaspilelysvalglnserlys500505510lysgluglyaspmettrphisvaltrpthrgluvalasnglymetarg515520525trpgluasntrpserlysglyarglysthrglualavallysalaleu530535540argglnglntyrgluarggluseralaglumet545550555<210>15<211>56<212>dna<213>大肠杆菌噬菌体n15<220><221>misc_feature<223>原核端粒酶靶序列<400>15tatcagcacacaattgcccattatacgcgcgtataatggactattgtgtgctgata56<210>16<211>50<212>dna<213>克雷伯氏菌属噬菌体phik02<220><221>misc_feature<223>原核端粒酶靶序列<400>16cagcacacaacagcccattatacgcgcgtataatgggctattatgtgctg50<210>17<211>52<212>dna<213>小肠结肠炎耶尔森氏菌噬菌体py54<220><221>misc_feature<223>原核端粒酶靶序列<400>17tagtcacctatttcagcatactacgcgcgtagtatgctgaaataggttactg52<210>18<211>90<212>dna<213>弧菌属噬菌体vp882<220><221>misc_feature<223>原核端粒酶靶序列<400>18gggatcccgttccatacatacatgtatccatgtggcatactatacgtatagtatgccgat60gttacatatggtatcattcgggatcccgtt90<210>19<211>38<212>dna<213>布氏疏螺旋体<220><221>misc_feature<223>原核端粒酶靶序列<400>19tactaaataaatattatatatataattttttattagta38<210>20<211>50<212>dna<213>根癌土壤杆菌菌株c58<220><221>misc_feature<223>原核端粒酶靶序列<400>20gcgatcgatcataataacaatatcatgatattgttattgtaatcgatcgc50<210>21<211>56<212>dna<213>副溶血弧菌噬菌体vp58.5gp40<220><221>misc_feature<223>原核端粒酶靶序列<400>21aacctgcacaggtgtacatatagtctaattagactatatgtacacctgtgcaggtt56<210>22<211>26<212>dna<213>根癌土壤杆菌菌株c58<220><221>misc_feature<223>原核端粒酶靶序列<400>22aataacaatatcatgatattgttatt26<210>23<211>11<212>dna<213>人工序列<220><223>寡核苷酸s1；实施例1<400>23gcgtataatgg11<210>24<211>71<212>dna<213>人工序列<220><223>pegs-1；实施例1<400>24tatcagcacacaattgcccattatacgcgcgtataatgggcaattgtgtgctgatatgta60cacttaagtag71<210>25<211>45<212>dna<213>人工序列<220><223>pegs2；实施例1<400>25gctatgaactaatgaccccgtaattgattactacttaagtgtaca45<210>26<211>45<212>dna<213>人工序列<220><223>pegs3；实施例1<400>26aagttatgtaacgcggaactccatatatgggctatgaactaatga45<210>27<211>35<212>dna<213>人工序列<220><223>pegs4；实施例1<400>27ccaggcgggccatttaccgtaagttatgtaacgcg35<210>28<211>40<212>dna<213>人工序列<220><223>pegs5；实施例1<400>28tgggcgggggtcgttgggcggtcagccaggcgggccattt40<210>29<211>30<212>dna<213>人工序列<220><223>pegs6；实施例1<400>29agtagatctgctagctgggcgggggtcgtt30<210>30<211>74<212>dna<213>人工序列<220><223>pegs7；实施例1<400>30atagtcgtgtgttaacgggtaatatgcgcgcatattacccgttaacacacgactatacta60gtagatctgctagc74<210>31<211>79<212>dna<213>人工序列<220><223>寡核苷酸1.120；实施例2<400>31tatcagcacacaattgcccattatacgcgcgtataatggactattgtgtgctgatatgta60cacttaagtagtaatcaat79<210>32<211>60<212>dna<213>人工序列<220><223>寡核苷酸1.112；实施例2<400>32tgggctatgaactaatgaccccgtaattgattactacttaagtgtacatatcagcacaca60<210>33<211>54<212>dna<213>人工序列<220><223>寡核苷酸1.113；实施例2<400>33ccgtaagttatgtaacgcggaactccatatatgggctatgaactaatgaccccg54<210>34<211>60<212>dna<213>人工序列<220><223>寡核苷酸1.114；实施例2<400>34ctagtagatctgctagccgccaggcgggccatttaccgtaagttatgtaacgcggaactc60<210>35<211>80<212>dna<213>人工序列<220><223>寡核苷酸1.107v；实施例2<400>35aacctgcacaggtgtacatatagtctaattagactatatgtacacctgtgcaggttacta60gtagatctgctagccgccag80<210>36<211>81<212>dna<213>人工序列<220><223>寡核苷酸3.1<400>36tatggaaaaacgccagcaacgcggcctttttacggttcctggccttttgctggccttttg60ctcacatgtagatcttgtaca81<210>37<211>200<212>dna<213>人工序列<220><223>寡核苷酸3.2<400>37gggcgggggtcgttgggcggtcagccaggcgggccatttaccgtaagttatgtaacgcgg60aactccatatatgggctatgaactaatgaccccgtaattgattactacttaagtgtacat120atcagcacacaatagtccattatacgcgcgtataatgggcaattgtgtgctgatatgtac180aagatctacatgtgagcttt200<210>38<211>200<212>dna<213>人工序列<220><223>寡核苷酸3.3<400>38ataatgccaggcgggccatttaccgtcattgacgtcaatagggggcgtacttggcatatg60atacacttgatgtactgccaagtgggcagtttaccgtaaatactccacccattgacgtca120atggaaagtccctattggcgttactatgggaacatacgtcattattgacgtcaatgggcg180ggggtcgttgggcggtctcg200<210>39<211>200<212>dna<213>人工序列<220><223>寡核苷酸3.4<400>39gccaaaacaaactcccattgacgtcaatggggtggagacttggaaatccccgtgagtcaa60accgctatccacgcccattgatgtactgccaaaaccgcatcaccatggtaatagcgatga120ctaatacgtagatgtactgccaagtaggaaagtcccataaggtcatgtactgggcataat180gccaggcgggccatttaggc200<210>40<211>64<212>dna<213>人工序列<220><223>寡核苷酸3.5<400>40ccattatacgcgcgtataatgggcaattgtgtgctgatagccaaaacaaactcccattga60ccag64<210>41<211>159<212>dna<213>人工序列<220><223>寡核苷酸dna-t<400>41tactagtcatctatcagcacacaattgcccattatacgcgcgtataatggactattgtgt60gctgatatactaggcaccacctgcaggaatctactaggccgccgcaaccaaacttggatc120ggtgcacatgtcgaatactaggattcctgcaggtggtgc159<210>42<211>159<212>dna<213>人工序列<220><223>寡核苷酸dna-v<400>42tactagtcatcaacctgcacaggtgtacatatagtctaattagactatatgtacacctgt60gcaggtttactaggcaccacctgcaggaatctactaggccgccgcaaccaaacttggatc120ggtgcacatgtcgaatactaggattcctgcaggtggtgc159<210>43<211>10<212>dna<213>人工序列<220><223>寡核苷酸:示例序列图4a<400>43tcgacgtcga1045权利要求书(按照条约第19条的修改)1.一种生产包含所需脱氧核糖核酸(dna)序列的dna的体外无细胞方法，所述方法包括：(a)使固定化在固体支持物上的寡核苷酸在有至少一种dna聚合酶存在下、在促进所述固定化的寡核苷酸的模板依赖性延伸的条件下与一系列在序列上重叠的模板寡核苷酸接触以产生第一dna链，该链包含所需dna序列且进一步包含在固体支持物近侧的原核端粒酶靶序列的第一部分；(b)在(a)中产生的所述第一dna链的远侧部分中或在第二链上引入包含(a)的原核端粒酶靶序列的第二部分的dna序列，使得所述原核端粒酶靶序列的第一部分和第二部分由此建立在所述固体支持物近侧的(a)的原核端粒酶的完整靶序列；和(c)使在所述固体支持物近侧的所述完整原核端粒酶靶序列在促进所述靶序列的切割和重连的条件下与原核端粒酶接触，由此释放产生的固定化的dna。2.根据权利要求1所述的方法，其中(a)的固定化的寡核苷酸包含原核端粒酶靶序列的第一部分。3.根据权利要求1所述的方法，其中将原核端粒酶靶序列的第一部分通过模板依赖性延伸引入第一dna链中。4.根据权利要求1至3任一项所述的方法，所述方法用于生产包含一个或多个发夹的单链环形dna，至少一个发夹包含原核端粒酶的靶序列的一部分。5.根据权利要求4所述的方法，其中步骤b)包括使用一种或更多种模板寡核苷酸的模板依赖性延伸，以在第一dna链的远侧端部引入特定序列，所述特定序列与位于固体支持物近侧的第一dna链的序列互补，并且所述互补序列的退火形成单链dna环。6.根据权利要求5所述的方法，所述方法包括模板依赖性延伸，以在第一dna链的远侧端部引入与(a)的原核端粒酶的所述靶序列的第一部分的3’侧接区域中的序列互补的序列。7.根据权利要求5或6所述的方法，所述方法包括模板依赖性延伸，以在第一dna链的远侧端部引入(a)的原核端粒酶的靶序列的第二互补部分和任选的与(a)的原核端粒酶的靶序列的第一部分的5’侧接区域中的序列互补的序列。8.根据权利要求5或权利要求6所述的方法，所述方法还包括所述dna环的3’末端的模板依赖性延伸，以建立在所述固体支持物近侧的所述完整原核端粒酶靶序列。9.根据权利要求1至4任一项所述的方法，其中步骤(a)包括使用一种或多种模板寡核苷酸的模板依赖性延伸，以在第一dna链的远侧端部引入两个互补序列，所述互补序列能够退火在一起以形成发夹。10.根据权利要求1至4任一项所述的方法，所述方法包含模板依赖性延伸，以在第一dna链的远侧端部引入完整原核端粒酶靶序列。11.根据权利要求9或10所述的方法，所述方法用于生产包含至少两个发夹的单链环形dna，所述发夹中的至少一个包含原核端粒酶的靶序列的一部分，所述方法包括用一系列模板寡核苷酸对在第一链的远侧端部处的发夹进行的模板依赖性延伸以建立第一dna链的第二段，其中所述系列包含在序列上重叠以形成与所述第一链的至少一部分不互补的序列的模板寡核苷酸和包含(a)的原核端粒酶的靶序列的第二部分的模板寡核苷酸，以由此建立在所述固体支持物近侧的完整原核端粒酶靶序列。12.根据权利要求9或权利要求11所述的方法，其中通过使用一种或更多种引入自互补序列的模板寡核苷酸的延伸而在第一链中包括两个互补序列。13.根据权利要求1至3任一项所述的方法，所述方法用于生产线性共价闭合双链dna，所述方法包括使用一种或多种模板寡核苷酸的模板依赖性延伸，以将原核端粒酶靶序列的第一部分引入第一dna链的远侧端部中，且使用如此延伸的第一dna链作为反向引物延伸的模板以产生互补第二链，所述互补第二链包含在所述固体支持物远侧和近侧的完整原核端粒酶靶序列。14.根据权利要求10、11或13任一项所述的方法，其中在所述固体支持物近侧和远侧的原核端粒酶靶序列针对相同或不同的原核端粒酶。15.根据前述权利要求任一项所述的方法，所述方法包括使用至少一种选自以下的原核端粒酶：seqidno:10的细菌噬菌体n15teln或其变体、seqidno:12的根癌土壤杆菌tela或其变体和seqidno:14的副溶血弧菌质粒vp58.5或其变体。16.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中所述dna聚合酶是链置换型dna聚合酶。17.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中所述寡核苷酸通过它的5’末端的连接或通过它的5’末端与附着于固体支持物的间隔物的连接而固定化至所述固体支持物。18.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中在(a)中产生的第一dna链包含一个或更多个内切核酸酶位点。19.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中所述所需dna序列包含一个或更多个适体，任选地，其中所述适体侧接内切核酸酶位点。20.一种包含固定化的寡核苷酸的固体支持物，所述寡核苷酸包含原核端粒酶的靶序列的第一部分。21.一种试剂盒，其包含含有原核端粒酶的靶序列的第一部分的寡核苷酸、一系列模板寡核苷酸和任选的关于用在根据权利要求1至19任一项所述的方法中的说明书。22.一种单链环形dna，其包含一个或多个发夹，所述发夹中的至少一个包含原核端粒酶的靶序列的一部分。23.根据权利要求22所述的单链环形dna，所述单链环形dna包含第二发夹，所述第二发夹包含：(i)原核端粒酶的靶序列的一部分，或(ii)邻近的互补序列。24.根据权利要求22或权利要求23所述的单链环形dna，所述单链环形dna包含一个或多个适体，任选地，其中适体被包含在发夹环中。25.根据权利要求22至24任一项所述的单链环形dna，所述单链环形dna还包含至少一个内切核酸酶位点。26.一种线性共价闭合双链dna，其包含第一发夹和第二发夹，所述第一发夹包含第一原核端粒酶的靶序列的一部分，所述第二发夹包含：(i)第二原核端粒酶的靶序列的一部分，其中所述第一和第二原核端粒酶是不同的，或者(ii)邻近互补序列。27.根据权利要求26所述的线性共价闭合双链dna，其中所述第一和第二原核端粒酶选自以下中的两种：seqidno:10的细菌噬菌体n15teln或其变体、seqidno:12的根癌土壤杆菌tela或其变体和seqidno:14的副溶血弧菌质粒vp58.5或其变体。28.一种扩增dna的体外无细胞方法，所述方法包括使用单链环形dna作为dna模板，所述单链环形dna在有一种或多种引物存在下、在促进扩增的条件下与至少一种dna聚合酶接触，所述单链环形dna模板包含含有原核端粒酶的靶序列的一部分的发夹。29.根据权利要求28所述的方法，所述方法产生扩增的dna，所述dna包含含有扩增的dna序列的重复单元的多联体。30.一种多联体dna，其包含在序列上与dna模板互补的单链dna的多个重复，其中所述dna模板是具有至少一个发夹的单链环形dna，所述发夹包含原核端粒酶的靶序列的一部分。31.一种制备药物组合物的方法，所述方法包括进行根据权利要求1至19任一项所述的方法和任选地扩增所述dna，并用药学上可接受的载体或稀释剂配制得到的dna。当前第1页12