把外部生物分子作为标准物质使用的生物分子的分析方法及其试剂盒与流程

本发明涉及一种基于核酸分析的生物分子的分析方法及其试剂盒。
背景技术：
：生物分子是构成生物样本的众多蛋白质、核酸、脂质及碳化物之类的物质，分析该生物分子的技术以及把生物样本中生物分子的量化状态的综合信息，亦即，生产生物分子的多重检查的技术得益于物理学、生物化学及生物信息学的发达而被广泛地开发，但是因为现有方法或器材的使用、维护费、轻易性、正确度、灵敏度、检查时间及过程的自动化等问题而非常需要开发出高效的新方法及器材。生物分子分析及多重检查技术本身并不是终极目标而只是实现目标的一个手段，但由于能够有效地应用于微生物、细胞、组织等处而广泛应用于医学、兽医学、环境工程学、食品工程学、农业等。目前已可利用物理及化学性质通过各种方法制备含有构成生物样本组织、细胞块、细胞及微生物等的蛋白质及有机物质等的生物分子分析及表达谱(profile)利用生物样本所含生物分子分析及分析结果分析生物学意义的临床决策支援系统(clinicaldecisionsupportsystem)是一种在医生对患者进行诊疗时帮助医生对诊断治疗进行决策(decisionmaking)的过程的系统。临床决策支援系统主要包括基于案例的机器学习推理系统(casebasedmachinelearninginferencesystem)与专家系统(expertsystem)。基于案例的机器学习推理系统收集已经判定了疾病的患者们的临床信息(clinicalinformation)及生物学信息(亦即，生物分子分析结果数据)后以“机器学习”方式根据已知临床信息与生物学信息等信息对疾病进行推理或判别。专家系统则利用医学专家事先赋予的规则(rule)诊断疾病。近来还利用生物分子多重检查的典型技术(亦即，针对蛋白体的并联高速分析(highthroughputscreening)技艺)开发了蛋白质芯片(proteinchip)或适体芯片(aptamerchip)(smithetal.,molcellprotomics,11-18.2003及mccauleyetal.,analbiochem,319(2)、244-250.2003)后正在使用中。该并联高速分析上使用的支持体有玻片(glassslide)、生物传感器的侦测表面、有空小珠(bead)、纳米粒子等。而且，对多重检查进行分析后确定有用的生物分子并且将其予以分离，然后利用maldi-tof(matrixassistedlaserdesorption/ionization-timeofflight)等确认其组成成分。近来则利用seldi-tofms(surface-enhancedlaserdesorption/ionizationtimeofflightmassspectrometry)对蛋白质表达谱(proteinprofile)进行了很多研究(adametal.,cancerresearch,62,3609-3614.2002；lietal.,clinicalchemistry,48,1296-1304.2002；andpetricoinetal.,thelancet,359,572-577.2002)。还开发了另一种解决方法，亦即，利用dna与核酸聚合酶(polymerase)把信号加以扩增的技术immuno-pcr(ipcr)方法(sanoetal.,science258,120-122.1992)。如前所述，生物分子分析方法在提高检测灵敏度及提升多重分析能方面有了巨大进步，但是依然在用于质量控制及测定的标准物质、分析成本的降低、分析时间的缩短、灵敏度的提高及重现性的增强之类的技术课题需要解决。技术实现要素：解决的技术课题本发明旨在解决上述现有的生物分子分析技术的问题，本发明人为了开发出以经过改善的效率及灵敏度对生物分子进行实时分析的技术而努力研究的结果，成功开发了把外部生物分子作为标准物质使用并且通过核酸分析单凭一次检查就能把一个以上的生物分子予以定量分析的方法，凭此，可实现本发明的目的。解决课题的技术方案为了达到上述目的，本发明的一实施形态揭示了基于核酸分析的生物分子的分析方法。本发明的基于核酸分析的生物分子的分析方法包括下列步骤：(a)备妥存在一个以上靶标生物分子的生物样本或其加工样本；(b)添加特异性结合于上述靶标生物分子的配体与设计核酸的连接结构物，形成生物分子与其特异性连接结构物的复合体；(c)把上述复合体予以分离；(d)把上述复合体的设计核酸予以扩增；(e)针对该扩增产物进行分析而获得对于靶标生物分子的定性或定量信息；上述设计核酸是一种具备下列领域的设计核酸，下列领域为，正向引物结合的领域、逆向引物结合的领域、以及在该领域之间把配体特异性结合的分子表达而得以识别该分子的领域。由于上述设计核酸包含了能够把所连接的配体特异性结合的分子予以表达(represent)的领域，因此确定该设计核酸扩增子的存在与否及/或存在量(亦即，扩增量)(准确地说，确定表达配体特异性结合的分子的领域的扩增子的存在与否及/或存在量(亦即，扩增量))就能对连接到该设计核酸的配体所特异性结合的分子进行定性分析(亦即，确定存在与否)或定量分析(亦即，能相对或绝对地确定存在量)。在此，表达配体特异性结合的分子的领域指的是下列领域，亦即，当配体特异性结合的分子不同时，与其相应地进行不同设计的领域。该设计只要是能够检测该不同就不限制到底如何设计，但通常以改变碱基序列或其长度地实现。即使拟分析的生物分子为两个以上时，本发明的方法也能据此添加能够和该各个生物分子进行特异性结合的配体与设计核酸的连接结构物，然后使用一个由正向引物和逆向引物组成的组以多重聚合酶链式反应(realtimemultiplexpcr)等予以扩增的话，就能单凭一次扩增过程(亦即，单凭一次检查或着在一个管里)同时对上述两个以上的靶标生物分子予以定性及/或定量分析。在此，设计核酸即使所结合的配体不同并且连带地使其配体认知相异的生物分子后结合，其正向引物结合的领域和其逆向引物结合的领域被设计成在一切配体与设计核酸的连接结构物之间具备共同序列，因此一切连接结构物的设计核酸可以由一个由正向引物和逆向引物组成的组扩增。在本发明的方法中，配体与设计核酸的连接结构物可以把配体与设计核酸共价或非共价结合后获得。该结合可以使用本
技术领域：
所公知的任何方法。例如，如本发明的实施例所示，在设计核酸的5'末端引进胺基后共价结合到配体(作为蛋白质的抗体)，或者以蛋白生物素(biotin)与抗生物素蛋白(avidin)为媒介(配体结合蛋白生物素而设计核酸结合抗生物素蛋白)非共价地进行结合。在本发明的方法中上述生物样本的加工样本指的是，生物样本为血液时将其加工后得到的血浆或血清，或者靶标生物分子为蛋白质时利用总蛋白质提取试剂等物从生物样本得到的总蛋白质样本。在本发明的方法中，可以使用用于相对及/或绝对定量分析的标准物质，该标准物质可以使用拟分析的样本中不存在的外部生物分子(外部标准物质)。只要是拟分析的样本中不存在的物质，该外部标准物质就能使用任意物质，例如，拟分析的样本为人来源生物样本而靶标生物分子为蛋白质时下列实施例所使用的大肠菌来源蛋白质enoyl-acpreductase等。把外部生物分子作为标准物质使用时，把特异性结合于该标准物质的配体与设计核酸的连接结构物和特异性结合于靶标生物分子的配体与设计核酸的连接结构物一起添加后形成复合体，把该形成的一切复合体(包括所有的和一个以上的生物分子之间的复合体及和标准物质之间的复合体)予以分离出来后，以一个由正向引物和逆向引物组成的组扩增该复合体的设计核酸，把对于外部生物分子的扩增子和对于靶标生物分子的扩增子予以定量并比较而得以实现生物分子的相对或绝对定量。在此，把外部生物分子作为标准物质使用时，需要把该外部生物分子予以定量后预先(在形成复合体之前)添加到拟分析的生物样本或其加工样本。把如此定量的外部生物分子作为标准物质使用的话，对于该标准物质，不必通过生物分子分析以外的额外分析制作校准曲线，也能把靶标生物分子予以绝对定量。把外部生物分子作为标准物质使用时，如果上述靶标生物分子和其连接结构物的结合亲和性与上述外部生物分子和其连接结构物的结合亲和性之间发生差异的话，上述定量结果可能无法准确反映出靶标生物分子在样本中的量(或浓度)。因此，优选地，把外部生物分子作为标准物质使用时，反映上述靶标生物分子和其连接结构物的结合亲和性与上述外部生物分子和其连接结构物的结合亲和性之间的差异后补正上述定量结果。可以通过下列步骤反映该差异：(i)把上述靶标生物分子和上述外部生物分子予以定量后备妥以同一浓度将其包含的对照样本；(ii)添加特异性结合于上述对照样本的靶标生物分子或外部生物分子并且和本发明的分析方法所用连接结构物相同的连接结构物，形成上述靶标生物分子和其特异性连接结构物的复合体与上述外部生物分子和其特异性连接结构物的复合体；(iii)把上述复合体予以分离；(iv)把上述复合体的设计核酸予以扩增；(v)求取对于上述靶标生物分子的扩增子和对于上述外部生物分子的扩增子的量的差异；(vi)把上述差异反应到上述靶标生物分子的定量结果。上述靶标生物分子是蛋白质、肽、多糖类、脂质、及其中的两个以上结合后形成的分子(糖蛋白、糖脂质、脂质蛋白质、脂质多糖)等,只要能制备出认知它并且结合的配体，本发明将不予特别限制。而且，上述设计核酸可以是双链核酸(dna-dna、dna-rna或rna-rna)或单链核酸(dna或rna)，如下列实施例所示，可以是为了和作为配体的抗体轻易结合之类的目的而以胺基被引进其5'末端等方式进行了化学修饰的核酸。在本发明的方法中，关于扩增产物的分析方面，扩增由实时聚合酶链式反应(realtimepcr)、实时逆转录聚合酶链式反应(realtimert-pcr)、实时多重聚合酶链式反应(realtimemultiplexpcr)、实时多重逆转录聚合酶链式反应(realtimemultiplexrt-pcr)等实现时可以在扩增时使用taqman探针等用于滴定检测的物质后实现。而且，也能使用固定着可捕获上述设计核酸的扩增子(具体地说，表达领域的扩增子)的探针(通常是具有对上述扩增子的互补碱基序列的单链寡核苷酸)的微阵列实现，也能如下列实施例一样地进行毛细管电泳地实现。该扩增产物的分析将针对靶标生物分子提供定性及/或定量信息。在本发明的另一各实施样态中，揭示了把外部生物分子作为标准物质使用的生物分子分析试剂盒。该分析试剂盒可包含特异性结合于靶标生物分子的配体与设计核酸的一个以上连接结构物地构成。优选地，上述分析试剂盒包含和1种以上靶标生物分子各自特异性结合的配体与设计核酸的1种以上连接结构物，而且，包含和作为标准物质而在含有上述靶标生物分子的生物样本中不存在的1种以上外部生物分子各自特异性结合的配体与设计核酸的1种以上连接结构物。在此，如前所述，上述设计核酸是一种具有正向引物结合的领域、逆向引物结合的领域以及在这些领域之间把配体特异性结合的分子表达而得以识别该分子的领域的设计核酸，上述设计核酸的正向引物结合的领域和逆向引物结合的领域在一切设计核酸具备共同碱基序列以便以一个由正向引物和逆向引物组成的组扩增一切设计核酸。优选地，上述分析试剂盒为了确定上述靶标生物分子和其上述连接结构物的结合亲和性与作为标准物质的上述外部生物分子和其连接结构物的结合亲和性之间的差异，可进一步包括用于对照样本的上述1种以上靶标生物分子和上述1种以上外部生物分子。优选地，上述试剂盒还包括该试剂盒的使用说明书，该使用说明书教导了生物分子的分析方法以前述的本发明的分析方法作为协议(protocol)。优选地，上述试剂盒所含说明书还教导了把上述靶标生物分子和其连接结构物的结合亲和性与上述外部生物分子和其连接结构物的结合亲和性之间的差异反映到靶标生物分子的定量信息。优选地，上述试剂盒所含说明书对于反映上述结合亲和性差异的方法还教导了前述的方法。下面详细说明本发明。生物分子可以是蛋白质、肽、核酸、碳水化合物、脂质(lipid)、多糖类、糖蛋白、激素、受体、抗原、抗体、病毒、病原菌、毒性物质、基质、代谢产物、过渡态类似物(transitionstateanalog)、辅因子(cofactor)、抑制剂、药、染料、养分、生长因子、细胞、组织等，其并不存在什么限制，几乎是一切化学或生物学受动器(effector)，表示不管任何大小的分子也均能予以使用的靶标分子等。在生物样本对上述生物分子进行分析就能得知身体内的变化，并且能够确定生物学意义，该生物学意义则能客观测定生命体的正常或病理状态、对药物的反应程度等。配体是一种和生物分子结合的物质，其代表性的物质有抗体、适体及肽等，抗体则是一种和生物分子进行特异性结合的物质，也是一种和抗原的抗原表位(epitope)进行特异性结合而引起抗原-抗体反应的蛋白质。适体(aptamer)指的是具备下列特性的小的(20～60核苷酸)单链核酸(dna或rna)块，该特性则是能和从低分子化合物到蛋白质的各种受体进行高亲和性与特异性结合。标准物质是一种用于质量控制及测定的物质，可以使用下列物质，在拟分析的样本中一直按照一定量存在的内部物质，或者结合在下列配体的外部生物分子，该配体和构成上述样本的生物分子没有基于生物分析方法的反应性。优选地，关于生物分子的分析，通常在进行各种试验或检查时为了比较而以拟分析的生物样本所含生物分子进行内部质量控制。上述质量控制用物质为一种一直以一定量存在于拟分析的样本的物质时较为理想，无法达到上述目标时则可以使用没有包含在样本的外来物质，优选地，拟分析的样本为生物样本时可以由上述生物样本不包含的外来生物分子构成。质量控制指的是，不使用诸如管理用样本之类的外部标准并且对于每次测定所能得到的一群检查结果进行分析后针对测定值的精密度进行管理的内部质量控制。优选地，本发明在利用用于质量控制及测定的标准物质分析人来源生物样本时，可以把植物特异生物分子作为没有包含在人来源生物样本的生物分子使用。目前已完成了人、大肠菌及作为植物的拟南芥(arabidopsisthaliana)等的基因组计划而报告了多个种特异性蛋白质。本发明为了分析人来源生物样本而能够在标准物质使用大肠菌或植物之类的特异蛋白质。测定生物分子浓度后评估的方法需要在精密度、正确度、重现性方面得到信赖。分析生物分子时正确度被重视的理由在于，样本由包含蛋白质在内的多种物质等非常复杂的组分构成，其中作为分析对象的生物分子仅以少量存在，因此为了分析微量成分而非常需要用于质量控制及测定的标准物质。因为样本中存在的妨碍分析的物质的影响与微量分析，分析值可能会在实验室之间发生偏差。为了减小实验室间的偏差，拟分析的样本需要一种均匀地包含着同一浓度的生物分子的用于质量控制及测定的标准物质，使用该标准物质对多个实验室所分析的分析值进行比较并且检讨分析仪器条件等后导出正确的分析条件。而且，需要一种让上述标准物质均匀分布在拟分析的样本而得以尽量减少各样本的偏差并且提高分析的可靠性的生物分子分析方法。因此，本发明拟提供一种配体-核酸分析方法(暂称)以便改善生物分子分析的检查界限、精密度、正确度、重现性，该方法则是利用图1所示概念以核酸分析技术一起分析靶标生物分子及用于质量控制及测定的标准物质的技术。在本发明中，为了分析一个或一个以上的生物分子，用于质量控制及测定的标准物质是拟分析的样本中一直按照一定量存在的内部物质，或着结合在下列配体(ligand)的外部生物分子，该配体和构成上述样本的生物分子没有基于上述配体-核酸分析方法的结合反应性。本发明揭示了配体-核酸分析方法、试剂盒及装置，其利用表达上述标准物质及靶标核酸分子的设计核酸的碱基序列及核酸长度进行分析。设计核酸为了进行分析而利用由核苷酸(nucleotide)构成的核酸以碱基序列或碱基序列的长度表达上述标准物质及拟分析的特定生物分子(暂称靶标生物分子)，和结合于上述标准物质及靶标生物分子的配体结合后利用核酸扩增方法把关于标准物质及生物分子存在的信号予以扩增以便分析扩增产物。关于表达上述标准物质及靶标生物分子的设计核酸，应该在表达上述标准物质与靶标生物分子的设计核酸之间没有作为一种生物分析方法的杂交反应性或者其长度相异而可以通过核酸分析技术进行分析。优选地，应该允许以和设计核酸分析方法相同的方法进行分析，可以使用设计核酸扩增时所使用的pcr引物双。把上述设计核酸和相应于特定生物分子的配体连接的结构物称为分析用配体，把设计核酸和和相应于标准物质的配体连接的结构物称为标准分析用配体。为了分析上述设计核酸而把设计核酸存在信号加以扩增的方法“扩增反应(polymerasechainreaction)”或“pcr”意味着把靶核酸分子予以扩增的反应。很多种扩增反应已在本
技术领域：
公开，可以如下举例但不限定于此：聚合酶链式反应(pcr)(美国专利第4,683,195,4,683,202,及4,800,159号)、逆转录聚合酶链式反应(rt-pcr)(sambrook等，molecularcloning.alaboratorymanual,3rded.coldspringharborpress(2001))的方法，多重pcr(mcphersonandmoller,2000)、连接酶链式反应(ligasechainreaction；lcr)(stemmer,w.p.,etal.,1995,gene,164,49-53；carlson,b.,2008,genetengbiotechnn,28,12-12)、gap-lcr(wo90/01069)、修复链式反应(repairchainreaction；ep439,182)、转录介导扩增(transcription-mediatedamplification；tma)(santalucia,j.,1998,procnatlacadsciusa,95,1460-1465.)，自主碱基序列复制(selfsustainedsequencereplication)、靶多核苷酸序列的选择性扩增(selectiveamplificationoftargetpolynucleotidesequences)(美国专利第6,410,276号)、共有序列引物聚合酶链式反应(consensussequenceprimedpolymerasechainreaction；cppcr)(美国专利第4,437,975号)、任意引物聚合酶链式反应(arbitrarilyprimedpolymerasechainreaction；ap-pcr)(美国专利第5,413,909号及第5,861,245号)、基于核酸碱基序列的扩增(nucleicacidsequencebasedamplification；nasba)(美国专利第5,130,238号，第5,409,818号，第5,554,517号及第6,063,603号)及链置换扩增(stranddisplacementamplification)。本发明使用了提高靶标生物分子的检查界限地设计的设计核酸，存在信号先用核酸扩增技术予以扩增后再以荧光物质扩增，基于pcr的核酸扩增可以提高分辨率。优选地，为了实现把上述设计核酸存在信号加以扩增的pcr方法，分析用配体及标准分析用配体结构物中连接到特定配体的设计核酸的组成可以由下列一般式(i)表示。5'-p1-nv-p3-3'(i)在上述一般式(i)中，p1领域和p3领域分别是和正向引物(forwardprimer)与逆向引物结合的领域，nv领域是利用特定碱基序列或其长度表达结合到特定生物分子的配体的部分(亦即，表达特定生物分子的领域)，其允许对特定生物分子进行定性及定量分析。优选地，该nv领域具有10～200核苷酸的长度。优选地，可以为了能够轻易地结合到配体而在5'末端具有作为反应性组的胺基，在正向引物结合的领域上游(upstream)能具有以大约10个核苷酸构成的间隔序列(spacer)。优选地，上述正向引物和逆向引物可以使用通用引物双。上述pcr引物双中正向引物可以由和设计核酸的碱基序列完整地互补结合的碱基序列组成，逆向引物可以和设计核酸的碱基序列相同，优选地，上述pcr引物可以是通用型pcr引物双。通用型pcr引物通常是作为多用于确定碱基序列或pcr等处的碱基序列的寡核苷酸，在商业克隆载体(cloningvector)等处较常使用。上述通用型pcr引物表示14mer到40mer之间的寡核苷酸，在互补于模板的引物延长产物的合成诱导条件，亦即，在核苷酸与dna聚合酶之类的聚合酶(polymerase)的存在、适合的温度与ph的条件下可以作为合成的起始点。“扩增产物”指的是多聚核苷酸扩增反应的产物。亦即，它通常是双链，是从一个以上的起始序列复制的多聚核苷酸集团。一个以上的起始序列可以是同一序列的一个以上的复制物，也可以是相异序列的混合物。扩增产物可以通过很多种扩增反应生成，上述扩增反应的产物是一个以上的靶标核酸的多个复制物。本发明能以核酸分析技术分析上述设计核酸的扩增产物而从样本分析靶标生物分子。本发明揭示了一种表达上述设计核酸的至少一个靶标生物分子的方法，该方法包括把设计核酸的p1部分上的反应性组n与配体的反应性组nj结合的步骤，上述结合则表达上述设计核酸的至少一个靶标生物分子。上述设计核酸与配体的连接可以利用很多种方法实现，优选地，设计核酸及配体各自结合反应性组而利用化学反应制备分析用配体。本发明提供分析用配体。本发明的分析用配体让一个以上的设计核酸结合到位于配体的反应性组n。优选地，上述设计核酸可具有表达靶标生物分子并凭借核酸分析技术进行分析的能力或者扩增存在信号地结合。优选地，上述反应性组n包括选自氨基、羧基、硫醇基、烷基、烯基、炔基、碘烷基、碘烯基、碘炔基、氨基烷基、氨基烯基(aminoalkeny)、氨基炔基(aminoalkynyl)、磺基烷基、磺基烯基、磺基炔基组、磷烷基、磷烯基及磷炔基的一个以上的基。本发明揭示了用于分析包含具备上述靶标生物分子的细胞、组织或流体的个体内的疾病或状态的设计核酸，其有效表达特异性结合于靶标生物分子的配体。收获生物分子与配体复合体的方法主要分成下列两种。一种方法把拟分析的样本的生物分子非特异结合于固体支持体，优选地，上述固体支持体是elisa(enzyme-linkedimmunosorbentassay)方法中使用的板(plate)或硝酸纤维素膜(nitrocellulosemembrane)，另一种方法则把上述标准物质及靶标生物分子的配体结合到固体支持体，优选地，上述固体支持体是磁珠。本发明把能够收获上述靶标生物分子与配体复合体的结构物称为收获配体，能够收获上述标准物质与配体复合体的结构物称为标准收获配体。如图2所示，为了在含有已知浓度的标准物质的拟分析的样本分析一个或一个以上的靶标生物分子，把对于对上述标准物质及靶标生物分子的设计核酸的扩增子的碱基序列或核酸长度以核酸分析技术分析而得以分析上述靶标生物分子。优选地，上述靶标生物分子的分析结果是靶标生物分子的存在量或存在量的比例或者是标准物质与各靶标生物分子的比例。可以使用方法分析相应的靶标生物分子，该方法根据上述靶标生物分子及标准物质确定上述设计核酸的碱基序列地予以表达而确定上述设计核酸的碱基序列，优选地，可以利用相应于上述靶标生物分子及标准物质的设计核酸扩增产物的碱基序列同时进行一个或一个以上的上述靶标生物分子的定性及定量分析。优选地，使用基于杂交的fret探针和realtimepcr的方法或者使用捕获(capture)探针和杂交法的有空小珠阵列或微阵列确定上述扩增产物的碱基序列后，能够分析上述靶标生物分子的存在与否及存在量。扩增了一种或一种以上的设计核酸后进行的扩增子(amplicon)检测可能比较困难并且需时较多。有在pcr过程中对扩增进行实时监控的诸多方法。为了分析一种特定核酸而使用的理想方法通常是在新合成的dna进行退火(annealing)的荧光标记探针。为了在一个管里对具备已知浓度的靶标物质的样本同时分析上述标准物质和一个或一个以上的靶标生物分子，制作出和其相应的碱基序列互不相同的设计核酸并且将其结合到和靶标生物分子结合的配体地备妥了分析用配体后，把其和拟分析的样本进行反应而得到的分析用配体-生物分子-收获配体复合体及标准分析用配体-标准物质-标准收获配体复合体的设计核酸作为模板并且以通用型pcr引物双进行pcr就能合成扩增产物。为了对包含上述标准物质的一个或一个以上的靶标生物分子的配体及设计核酸进行分析，可以制作一种包含下列探针的fret探针，该探针能和设计核酸的碱基序列进行互补结合。上述fret探针通常以下列方式设计，亦即，供体发光(donoremission)由于两个发色团之间的fret(fluorescenceresonanceenergytransfer)而靶标不存在时淬灭。供体发色团与受体发色团成双地相邻配置时，处于激发状态的供体发色团(donorchromophore)能把能量传递给受体发色团。该能量的传递一直维持非辐射性(non-radiative)并且能通过偶极子-偶极子耦合(dipole-dipolecoupling)发生。充分增加了上述发色团之间的距离时，fret效率将下降而且能以辐射方式检测供体发色团的发光。供体发色团可举例fam(6-carboxyfluorescein)、tamra、vic、joe、cy3、cy5及texasred。和供体发色团的发光光谱重叠地选择受体发色团的激发光谱。前述的双可举例fam-tamra。而且，存在着把广范围的供体予以淬灭(quenching)的非荧光受体(nonfluorescentacceptor)，供体-受体fret双的其它例已被本
技术领域：
的技术人员广泛认知。可用来进行pcr的实时检测的fret探针的一般例包括分子信标(molecularbeacon)(例如，美国专利第5,925,517号)、taqman探针(例如，美国专利第5,210,015号及第5,487,972号)及catacleave探针probes(例如，美国专利第5,763,181号)。上述分子信标是如下设计的单链寡核苷酸，亦即，在未结合的状态下探针形成供体发色团和受体发色团相邻地存在而供体发光减少的二次结构。在适当的反应温度下，上述信标解折叠(unfold)并且特异性结合于扩增子。一旦解折叠，就能让供体发色团与受体发色团之间的距离增加而逆转fret并且利用特化的装置监控供体发光。taqman及catacleave技术由于所利用的fret探针被切断而使得供体发色团与受体发色团充分地分离而能让fret逆转，此点与分子信标不同。taqman技术使用了在5'末端以供体发色团标记及在3'末端以受体发色团标记的单链寡核苷酸探针。用于扩增的dna聚合酶应该具有5'3'核酸外切酶活性。taqman探针在引物结合的同时结合在扩增子的一个链上。dna聚合酶延长引物而使得上述聚合酶最终和结合的taqman探针相遇。此时，上述聚合酶的核酸外切酶活性将在5'末端开始并且依次分解taqman探针。上述探针被消化而使得包含上述探针的单核苷酸被排放到反应缓冲液内。供体自受体较远地扩散而fret被逆转。为了确认探针切断与否而监控来自供体的发光。由于受到taqman作用方式的影响，在pcr的每一个循环只能检测一次特定扩增子。通过taqman靶标部位的引物的延长将生成双链产物，该双链产物能够阻止taqman探针进一步结合，一直到扩增子在下一个pcr循环变性为止。随着其内容被参照而被包含在本说明书的美国专利第5,763,181号记载了另一个实时检测方法(以“catacleave”指称)。catacleave技术以不具备聚合酶活性的第二酶实现探针的切断，此点不同于taqman。catacleave探针具有作为核酸内切酶(endonuclease)(例如，限制酶或rnase)的靶标的分子内的序列。在本发明的一个例示中，catacleave探针具备奇美拉(chimera)结构，该奇美拉结构在上述探针的5'及3'末端由dna构成而切断部位则包含rna。在本发明的再一个实施例中，上述taqman探针具有下列序列，在5`末端标记荧光发色剂(fluorescentreporterdye)，在3`末端则让淬灭剂(quencher)可互补结合于上述设计核酸。结合在taqman探针的上述报告基团分子及淬灭基团分子包含荧光性物质及非荧光性物质。用于本发明的荧光性报告基团分子及淬灭基团分子可以使用已经公知于本
技术领域：
者，现举例如下(括号里的数字是以纳米单位表示的发光最大波长)：cy2tm(506)、yoprotm-1(509)、yoyotm-1(509)、calcein(517)、fitc(518)、fluorxtm(519)、alexatm(520)、rhodamine110(520)、5-fam(522)、oregongreentm500(522)、oregongreentm488(524)、ribogreentm(525)、rhodaminegreentm(527)、rhodamine123(529)、magnesiumgreentm(531)、calciumgreentm(533)、to-protm-1(533)、toto1(533)、joe(548)、bodipy530/550(550)、dil(565)、bodipytmr(568)、bodipy558/568(568)、bodipy564/570(570)、cy3tm(570)、alexatm546(570)、tritc(572)、magnesiumorangetm(575)、phycoerythrinr&b(575)、rhodaminephalloidin(575)、calciumorangetm(576)、pyroniny(580)、rhodamineb(580)、tamra(582)、rhodamineredtm(590)、cy3.5tm(596)、rox(608)、calciumcrimsontm(615)、alexatm594(615)、texasred(615)、nilered(628)、yo-protm-3(631)、yoyotm-3(631)、r-phycocyanin(642)、cphycocyanin(648)、to-protm-3(660)、toto3(660)、diddilc(5)(665)、cy5tm(670)、thiadicarbocyanine(671)、cy5.5(694)、hex(556)、tet(536)、vic(546)、bhq-1(534)、bhq-2(579)、bhq-3(672)、biosearchblue(447)、calfluorgold540(544)、calfluororange560(559)、calfluorred590(591)、calfluorred610(610)、calfluorred635(637)、fam(520)、fluorescein(520)、fluorescein-c3(520)、pulsar650(566)、quasar570(667)、quasar670(705)及quasar705(610)。括号里的数字是以纳米单位表示的发光最大波长。根据本发明的某些实施样态，报告基团分子及淬灭基团分子包含cy5,rox,hex,fam,bhq-1,bhq-2或cy5.5等。很多文献已经揭示了适合的报告-淬灭基团双(pairs)：pesceetal.,editors,fluorescencespectroscopy(marceldekker,newyork,1971)；whiteetal.,fluorescenceanalysis:apracticalapproach(marceldekker,newyork,1970)；berlman,handbookoffluorescencespectraofaromaticmolecules,2ndedition(academicpress,newyork,1971)；griffiths,colourandconstitutionoforganicmolecules(academicpress,newyork,1976)；bishop,editor,indicators(pergamonpress,oxford,1972)；haugland,handbookoffluorescentprobesandresearchchemicals(molecularprobes,eugene,1992)；pringsheim,fluorescenceandphosphorescence(intersciencepublishers,newyork,1949)；haugland,r.p.,handbookoffluorescentprobesandresearchchemicals,sixthedition,molecularprobes,eugene,oreg.,1996；u.s.pat.nos.3,996,345and4,351,760。根据本发明的某一实施样态，本发明的探针的5'-末端以选自cy5,rox,hex,fam及cy5.5所组成的群的1种荧光物质(fluorophore)标记，3'-末端则以选自bhq-1及bhq-2所组成的群的1种淬灭基团(quencher)变形，但本发明并不限定于此。本发明揭示了一种配体-核酸分析方法、试剂盒及装置，其利用上述fret探针对包含上述标准物质在内的5种以上靶标生物分子进行分析。toce(taggingoligonucleotidecleavageandextension)是一种能够检测多个(5个以上的)目标遗传物质和确认遗传变异的技术(lee,d.h.toce:innovativetechnologyforhighmultiplexreal-timepcr.seegenebulletin1,510(2012))。本发明揭示了一种为了在含有已知浓度的分析用样本分析上述一个或一个以上的生物分子，提供了能够在上述设计核酸实现dpoprimer技术与pitcher&catcher技术地制作的方法。在设计核酸结构[一般式i]中，上述p1领域由和dpo正向引物进行互补结合的一部分或全部构成，上述p3领域由和dpo逆向引物相同的碱基序列的一部分或全部构成，上述nv领域由和具有taggingportion的pitcher引物进行互补结合的部位的一部分或全部构成。优选地，本发明提供catcher低聚物，该catcher低聚物则由上述taggingportion互补结合的部分和构成能生成信号的fret探针的template部分的一部分或全部构成。本发明揭示了一种配体-核酸分析方法、试剂盒及装置，其在以上述dpo正向引物和上述dpo逆向引物扩增上述设计核酸的过程中上述pitcher引物的taggingportion被放出而和上述catcher低聚物互补结合并伸长而生成信号。toce技术能够在一个通道(channel)同时确认多个核酸。荧光signal能够被实时确认，并且可以分析catcher的熔解温度(catcher-tm)后确认target的存在与否。catcher作为附有荧光分子的artificialtemplate，能够生成相当于各target的荧光signal。变更catcher的长度或碱基序列就能调节catcher-tm值。为了toce反应的适应性，catcher-tm值可以不受target的碱基序列影响地轻易改变。目前使用的probe方式的tm分析方法直接结合到目标核酸dna，与此相反地，toce方式利用catcher生成荧光signal而得以调节catcher的长度或碱基序列变化地自由调节tm值。而且，现有方式在发生核酸碱基序列变化时tm值会出现差异，但是toce方式不受靶碱基序列变化的影响地维持一定的tm值。得益于该独特的pitcher&catcher方式，能够在单一通道(channel)内准确地实行多个核酸检查(multiplexing)。可以在real-timepcr过程中设定cyclic-cmtapoint后同时确认核酸的存在与否及定量分析结果。cyclic-cmtapoint可以在real-timepcr过程中设定在30、40、50cycle，分析结果时可以根据基于所存在的核酸量的meltingpeak的样态进行定量分析。在real-timepcr测定扩增产物的量的方法有绝对定量(absolutequantification)与相对定量(relativequantification)。绝对定量是一种使用已知浓度的标准物质制作标准曲线并且利用它算出拟测定的目的基因的浓度的方法，其在目的基因与标准物质的pcr效率相同的假设下进行，为了更准确地定量而把目的基因和已知浓度的内部对照物质同时扩增后进行定量。另一方面，为了确认特定目的基因表达的变化而在mrna定量上使用相对定量，使用基准基因(referencegene)与目的基因制作各自的标准曲线(standardcurve)并且利用它以浓度算出它们的扩增程度，然后为了校准pcr之间的变异而计算相对于基准基因的目的基因的比例(目的基因的浓度/基准基因的浓度)。虽然相对定量方法被视为相比于绝对定量方法较容易、具备经济性并且具备可靠性，但是依然在标准曲线的配制和保管方面存在着发生错误的危险。本发明对于在一个管里让一个或一个以上的靶标生物分子和用于质量控制及测定的标准物质同时进行反应后收获的复合体中所含设计核酸利用multiplexrealtimepcr予以分析后获得ct值并且利用该ct值进行绝对定量及相对定量。在pcr中，dna在每一个cycle以指数级扩增后到达plateau。实时(realtime)监控了该扩增样貌的图形就是扩增曲线。pcr扩增产物量达到了可用荧光检测的量的话，扩增曲线开始出现而使得signal以指数级别上升后到达plateau。初始dna量越多扩增产物量达到可检测定的cycle数越少，因此扩增曲线较快出现。因此，使用逐步稀释的标准样本进行realtimepcr反应的话，就会得到按照初始dna量较多的顺序以相同间距排列的扩增曲线。在此，于适当地点设定threshold就能算出threshold与扩增曲线交叉点ct值(thresholdcycle)。ct值与初始模板量之间可以制作具备线性关系的校准曲线。对于未知样本，也和标准样本一样地算出ct值后和该校准曲线对照就能求得初始模板(template)量。在本发明中，作为设计核酸的扩增子(amplicon)的结构如上述一般式(i)所示地以同一结构和同一pcr引物双扩增而使得表达一个或一个以上的靶标生物分子与用于质量控制及测定的标准物质的设计核酸的扩增效率都相同(未提示资料)。本发明对于在在一个管里让一个或一个以上的靶标生物分子与用于质量控制及测定的标准物质同时进行反应后收获的复合体中所含设计核酸利用multiplexrealtimepcr予以分析后获得ct值，利用该ct值进行了绝对定量及相对定量。在本发明中，作为设计核酸的amplicon的结构如上述[一般式(i)]所示地以同一结构和同一pcr引物双扩增而使得表达上述靶标生物分子与用于质量控制及测定的标准物质的设计核酸的扩增效率都会相同。在本发明的下列实施例中，对于凭借人为地添加了用于质量控制及测定的标准物质的拟分析样本所含靶标生物分子所形成的复合体设计核酸的存在量，利用上述实施例中得到的ct(cyclethreshold)值以2-ct法(comparativectmethod)进行了分析(livakkj.comparativectmethod.abiprism7700sequencedetectionsystem.userbulletinno.2.relativequantitationofgeneexpression.peappliedbiosystems,1997.)。在本ct法中，不必制作校准曲线也能实行定量。但是，其前提是对于所测定的一一切生物分子的pcr扩增效率几乎维持一定。把添加了标准物质的拟分析的样本所分析出来的靶标生物分子的复合体设计核酸的ct值以标准物质复合体的设计核酸ct值予以normalization(ct靶标生物分子-ct外部标准物质)并且将其定义为△ct-n的话，能如下算出添加了标准物质的拟分析的样本中靶标生物分子的浓度：外部标准物质的浓度如果外部标准物质与其特异性配体的结合力和靶标生物分子与其特异性配体的结合力之间存在着异，上述所确定的靶标生物分子的浓度可能无法准确地反映其在样本中的浓度。因此，优选地，以其结合力的差异予以校准。为了进行该校准，先把靶标生物分子和靶标外部标准物质予以定量并备妥1个以上以同一浓度包含它们的对照样本，利用该对照样本(们)求得算自对靶标生物分子的复合体的设计核酸的扩增子的ct值(或对照样本为2以上时，其诸值的平均)和算自外部标准物质复合体的设计核酸的扩增子的ct值(或对照样本为2以上时，其诸值的平均)，进而求得作为其差异值(ct对照样本的靶标生物分子-ct对照样本的外部标准物质)的△ct-c。接着，求得以该值把上述△ct-n予以calibration的△ct-cal(△ct-n-△ct-c)，利用△ct-cal如下式所示地从外部标准物质的浓度算出靶标生物分子的浓度就能得到反映了上述结合力差异的结果。外部标准物质的浓度因此，可以说拟分析的样本中的靶标生物分子以外部标准物质浓度的倍的浓度存在。而且，可以使用根据上述靶标生物分子确定上述设计核酸的长度后以设计核酸的长度表达上述靶标生物分子而确定上述设计核酸长度的方法分析相应的靶标生物分子，优选地，可以利用上述设计核酸扩增产物的长度同时进行一个或一个以上的上述靶标生物分子的定性及定量分析。为了在含有已知浓度的标准物质的拟分析的样本分析标准物质及一个或一个以上的靶标生物分子，制作与其相应的长度互不相同的设计核酸并且让它们和结合到标准物质及靶标生物分子的配体进行结合地备妥分析用配体，然后让拟分析的样本和分析用配体进行反应并且以所收获的标准物质及靶标生物分子复合体的设计核酸作为模板由通用型pcr引物双进行pcr就能合成扩增产物。可以利用标准物质的设计核酸的分析结果从上述扩增产物的长度分析结果确定相应于扩增产物长度的一个或一个以上靶标生物分子的存在与否及存在量。优选地，复合体的设计核酸的pcr所使用的引物双是通用引物双，在其中任一引物标记了作为标记物质的荧光物质地标记扩增产物。在本发明中，上述标记物质可以使用选自生物素(biotin)、cy2,gfp,yo-pro-1,yoyo-1,calcein,fitc,flourx,alexa488,rhodamine110,abi5-fam,oregongreen500,oregongreen488,ribogreen,rhodaminegreen,rhodamine123,magnesiumgreen,calciumgreen,to-pro-1,toto-1,abijoe,bodipy530/550,dil,bodipytmr,bodipy558/568,bodipy564/570,alexa546,tritc,magnesiumorange,phycoerythrinr&b,rhodaminephalloidin,calciumorange,pyroniny,rhodamineb,abitamra,rhodaminered,cy3.5,abirox,calciumcrimson,alexa594,texasred,nilered,yo-pro-3,yoyo-3,r-phycocyanin,c-phycocyanin,to-pro-3,toto-3,diddilc(5)、thiadicarbocyainie,cy5.5,cy5或cy3的荧光色素。优选地，用凝胶电泳或毛细管电泳(capillaryelectrophoresis)方法确定了上述扩增产物的大小后，可以分析上述靶标生物分子的存在与否及存在量。本发明提供一种配体-核酸分析方法、试剂盒及装置，其为了使用设计核酸及标准物质在拟分析的样本分析一个或一个以上靶标生物分子而考量了上述标准物质的种类及上述生物分子-配体复合体的收获方法后构成。优选地，本发明为了在上述靶标生物分子全部由生物分子构成的样本使用用于质量控制及测定的标准物质以核酸分析技术进行分析而提供配体-核酸分析方法、试剂盒及装置，其包括下列步骤：制备从上述样本分析上述靶标生物分子的分析用样本；制备上述标准物质或靶标生物分子的配体及设计核酸；在一个管里把上述配体及设计核酸与上述分析用样本反应后形成上述标准物质或靶标生物分子复合体并将其收获；把上述所收获的标准物质或靶标生物分子复合体的设计核酸予以扩增后分析扩增产物的碱基序列或长度；及从上述扩增产物的分析结果分析上述靶标生物分子。为了让本发明的生物分子分析方法更有效率地测定，本发明的利用配体pcr的生物分子分析装置包括：制备拟分析的样本的样本处理装置；制备让上述样本与上述分析用配体、上述收获配体及上述标准物质反应后形成的分析用配体-生物分子-收获配体复合体及标准物质并且把复合体所含设计核酸及标准物质予以扩增的模块；分析上述扩增产物的模块等；本发明的装置及系统可以包括由混合室、溶解室及反应室构成的样本处理装置及扩增装置并且把它们统合后运行。利用配体-核酸分析方法的生物分子分析装置及系统通过利用核酸扩增及分析技术的设计核酸分析方法实行，本发明的配体-核酸分析装置及系统包括：在包含上述靶标生物分子的样本准备生物分子的样本处理装置；制备让上述样本与上述分析用配体、上述收获配体、上述标准分析用配体及上述标准收获配体进行反应形成分析用配体-生物分子-收获配体复合体及标准分析用配体-标准物质-标准收获配体复合体并将其洗涤后，把这些复合体的设计核酸予以扩增的模块；分析上述扩增产物的模块。针对所需目标的生物分子进行分析的样本分析伴随着一系列的样本准备步骤，在由混合室与溶解室构成的样本处理装置进行。在这些步骤可以包括过滤、细胞溶解、核酸以及和样本的混合。根据本发明的优选实施例，优选地，在由细胞构成的生物样本让细胞增溶制备生物分子，其余步骤则利用已公知的方法进行。优选地，利用elisa用板制备的分析用配体-生物分子复合体及标准分析用配体-标准物质的分离方法为，首先，在上述样本把靶标生物分子及标准物质结合到支持体后让分析用配体反应制备生物分子-分析用配体复合体，然后进行洗涤步骤消除未结合的分析用配体而得以备妥经过提炼的复合体。让上述分析用样本、分析用配体、收获配体、标准分析用配体及标准收获配体进行反应制备分析用配体-生物分子-收获配体复合体及标准分析用配体-标准物质-标准收获配体复合体，利用收获配体及标准收获配体的磁性以磁铁收获通过多种方法制备的复合体后进行洗涤步骤消除未结合的分析用配体及标准分析用配体而得以备妥经过提炼的复合体。对于上述分离出来的标准分析用配体-标准物质-标准收获配体复合体及分析用配体-生物分子-收获配体复合体的设计核酸，可以利用一般核酸分析方法进行核酸的定量分析。而且，也可以利用所分析的结果在含有靶标生物分子的生物样本确定靶标生物分子的生物学意义。作为一例，样本可以是培养出来的细胞、蛋白质、核酸或包含它的生物学医药剂，或者细胞、孢子、微生物及病毒所组成的群或得自睾丸(testis)的组织(tissue)、血液(blood)、血浆(plasma)、血清(serum)、尿液(urine)、唾液(saliva)、汗(sweat)、精液(semen)或粘液(mucus)之类的体液(bodyfluid)，本发明并不限定于此，视为包含所选择的靶标生物分子，该靶标样本包括至少两个或两个以上的靶标生物分子。上述方法包括下列步骤，亦即，把样本导入设有混合室的装置，该混合室让样本与样本配制对照组混合。样本配制对照组从蛋白质、细胞、孢子、微生物及病毒所组成的群选择，该样本配制对照组包括质量控制物质。上述装置还设有溶解室与反应室。样本在混合室和样本配制对照组进行混合。扩增装置的反应容器的反应室内的反应混合物暴露于设计核酸扩增条件。基于反应的rna或dna模板的扩增已被公知[美国专利第4,683,195号；美国专利第4,683,202号；pcrprotocols:aguidetomethodsandapplications(inniset.al.,,1990)]。dna的核酸扩增伴随着下述循环的重复，该循环为，让dna热变性，在和拟扩增dna片段侧接的序列把2个寡核苷酸引物予以退火，凭借dna聚合酶让退火后的引物延长。引物除了和靶标序列的对向的链(strand)进行交链以外，还能让聚合酶所致dna合成能够横跨引物之间的领域地进行定向而得以有效地把dna片段的量予以倍增。而且，扩展生成物也是互补并且能够结合引物，因此各个连续循环能把先前循环中合成的dna的量实际予以倍增。其结果，每个循环都以2n(在此，n是循环数)的比率让特定靶标片段实现指数级积蓄。扩增反应及连接酶链式反应(ligasechainreaction；lcr)之类的方法可直接用来把靶标dna序列的核酸序列予以直接扩增。等温扩增反应也是已经公知的内容，其可以根据本发明的方法予以使用。优选地，使用热处理设备进行设计核酸扩增反应，该设备能把反应容器内的反应混合物加热及/或冷却到扩增反应所需温度。该热处理设备还可包括一个以上的检测器具，该器具则检测样本配制对照组的标准物质核酸序列及样本需测试的一个以上的标准物质核酸序列。可以使用内置了用于扩增及检测反应容器内的核酸序列的光学检测仪的优选热处理设备(美国专利第6,369,893号；美国专利第6,391,541号)。而且，适合本发明的众多其它公知方法可用于控制反应混合物的温度并且在该反应混合物检测核酸序列。作为用于检测扩增生成物的其它优选方法，荧光探针由所有的报告染料(fluorescentreporterdye)予以标记化了的寡核苷酸构成。捕获探针的分裂则导致报告染料的荧光强度增加。流体控制装置可以根据所需协议利用电脑进行控制。使用单一阀时，可能会因为仅仅一个失败因素而得以生成较高的生产良率。流体控制及处理用配置件的统合可实现袖珍装置(例如，小型匣盒(cartridge)形态)，还能轻易实现成型及组装的自动化。如前所述，该系统可以具备稀释及混合能力、中间洗涤能力及确实可靠的加压能力。系统内的流体路径通常处于封闭状态以便尽量减少系统内的流体污染并且容易收容及控制该流体。反应容器可拆卸及更换，在若干实施例中还可以废弃。利用生物样本血液诊察包括癌在内的慢性疾病，尤其是在癌诊察时的检查方面，检查5～6个患者监控用生物分子并且仅仅参考其结果的cut-off数值，因此在诊断上存在着一定界限。慢性疾病是由于各种基因变异而产生的疾病，癌则属于其典型疾病，利用一个标记物诊察癌是有其限制的，实际上，现有的血液检查只能筛选出癌患者的30～40％左右。体外诊断多元指标检查(invitrodiagnosticmultivariateindexassays；ivdmia)是一种把多个靶标生物分子予以定量检查并且以其结果为基础针对正常集团与癌患者集团之间的函数关系进行定量分析地诊断的方法，该方法以诊断、治疗、缓和、处置、预防为目的使用解析函数并且利用患者的特异性结果把作为生物学意义的疾病或其它状态算出分类、评分及指数等，其把多个结果加以结合。本发明中利用以上述配体-核酸分析方法生产的生物分子分析信息的用于确定生物学意义的临床决策支援系统例示了诊断及选定疾病高危险群，但本发明并不限定于此。为了实现本发明拟解决的技术课题，本发明揭示一种利用“确定生物学意义的配体-核酸分析”的确定生物学意义的临床决策支援系统，使用基于配体-核酸分析方法的上述标准物质与上述靶标生物分子分析结果在样本或采集了样本的患者确定靶标生物分子的生物学意义的方法包括下列步骤：(a)在上述样本以上述配体-核酸方法进行基于上述标准物质的质量控制并且以测定用标准物质生产上述靶标生物分子分析结果；(b)利用基于决策树的集成方法的partialdependencyplot乃至partialdependency函数关系把上述生物分子分析结果予以变换并且生成变换后的生物分子分析结果；及(c)把上述变换后的生物分子分析结果输入既定的生物学意义确定模型后生成上述各样本的生物学意义信息。优选地，上述生物学意义确定模型是逻辑回归模型。优选地，上述逻辑回归模型使用脊罚分函数(ridgepenalty)。优选地，上述集成方法是boosting及randomforest中的某一个方法。优选地，上述生物学意义确定模型进一步生成各靶标生物分子的生物学意义确定贡献度的信息，上述各靶标生物分子的生物学意义确定贡献度提供下列信息，亦即，对于上述生物学意义确定模型所含有的至少一个以上的个别靶标生物分子，利用通过逻辑模型求得的既定的判别函数提供对于生物学意义的影响程度。优选地，上述各靶标生物分子的疾病生物学意义确定贡献度以coefficientplot的形态提出。优选地，在包含上述靶标生物分子抗体的生物学意义分析试剂盒由生产上述各靶标生物分子的分析信息的第三系统实行，或者由以有线/无线网络连接到上述第三系统并且从上述第三系统接收上述各靶标生物分子的分析信息的生物学意义确定用系统实行。为了实现本发明拟解决的技术课题，本发明提供一种使用经过变换的各靶标生物分子的分析信息并且运用上述靶标生物分子的生物学意义确定模型生成方法，该方法运用上述靶标生物分子生成上述生物学意义确定模型，包括下列步骤：(a)针对由多名患者与多名正常人所构成的对象，从分离自对象的血液、血浆、血清或其它对象身体的采集物质中生成多个各靶标生物分子的分析信息，对上述所生成的分析信息进行既定的变换；(b)把选自上述对象的一部分对象作为模型生成对象组，利用决策树以上述经过变换的各靶标生物分子的分析信息生成多个分类器(classifier)，把上述所生成的多个分类器加以接合生成由至少一个以上的靶标生物分子参与的多个生物学意义确定模型候补；(c)把上述对象中没有被包含在模型生成对象组的对象作为模型验证对象组，以模型验证对象的进行了变换的上述各靶标生物分子的分析信息输入到上述生物学意义确定模型候补，生成上述各模型验证对象的生物学意义确定信息；及(d)针对上述生物学意义确定信息进行既定的评估，筛选出符合既定的评估指标的生物学意义确定模型。优选地，上述分析信息还包括至少一双靶标生物分子的分析结果比率信息。优选地，进行上述既定的变换时，利用基于决策树的集成方法的partialdependencyplot乃至partialdependency函数关系变换上述分析信息。优选地，上述生物学意义确定模型是逻辑回归模型。优选地，上述既定的评估指标是正确度、特异度、灵敏度、roc曲线的面积中的某一个以上。优选地，上述集成方法是boosting及randomforest中的某一个方法。优选地，上述生物学意义确定模型进一步生成各靶标生物分子的生物学意义确定贡献度信息，上述各靶标生物分子的生物学意义确定贡献度提供下列信息，亦即，对于上述生物学意义确定模型所含有的至少一个以上的个别靶标生物分子，利用通过逻辑模型求得的既定的判别函数提供对于癌的影响程度。为了实现本发明拟解决的技术课题，本发明提供一种进行“生物学意义确定预测”的用来确定生物学意义的临床决策支援系统，该生物学意义确定预测系统直接从分析试剂盒或者凭借上述分析试剂盒或者利用分析信息进行“生物学意义确定预测”，其包括下列模块：(a)信息获取模块，获取从对象的血液、血浆、血清或者从对象的身体分离出来并采集的其它样本测定出来的构成上述靶标生物分子组合的各靶标生物分子的分析信息或分析结果比率信息；(b)生物学意义确定预测模块，对于上述分析信息或分析结果比率信息，以既定的至少一个以上的变换模块予以处理，或者以既定的生物学意义确定预测模型处理上述所获取的上述分析信息或分析结果比率信息；及(c)生物学意义确定预测信息生成模块，从上述生物学意义确定预测模块生成至少一个以上的生物学意义确定预测信息；上述变换模块优先生成对于上述分析信息的分析结果变换信息或对于上述分析结果比率信息的分析结果比率变换信息，上述生物学意义确定预测模型把上述所生成的分析结果变换信息或上述分析结果比率变换信息作为输入值接受。优选地，上述信息获取模块按照上述各靶标生物分子获取分析信息或分析结果比率信息的方法以下列方法中的某一个以上方法实行：(a)上述生物学意义预测系统直接从上述生物学意义分析试剂盒获取的方法；(b)由通过有线/无线网络连接到上述生物学意义确定预测系统并且能够生产上述分析试剂盒的上述各靶标生物分子的分析信息的第三系统传输的方式获取的方法；及(c)由通过有线/无线网络连接到上述生物学意义确定预测系统并且获取上述各靶标生物分子的分析信息的人的电脑传输的方式获取的方法。优选地，上述变换模块利用基于tree的集成方法的partialdependenceplot或partialdependency函数关系生成分析结果变换信息或分析结果比率变换信息。优选地，上述生物学意义确定预测模型是逻辑模型，上述逻辑模型则是既定的函数式，该既定的函数式接收所输入的上述分析结果变换信息或上述分析结果比率变换信息后推定出被分类成癌的概率值。优选地，上述生物学意义确定预测信息生成模块还生成关于各靶标生物分子的疾病分析贡献度的信息，关于上述各靶标生物分子的疾病分析贡献度，使用由逻辑模型求得的既定的判别函数对上述靶标生物分子组合所含靶标生物分子以coefficientplot的形态示出对于癌的影响程度。为了实现本发明拟解决的技术课题，本发明揭示了一种各靶标生物分子的变量值处理方法，该各靶标生物分子的变量值处理方法和生物学信息确定统计模型相关，该生物学信息确定统计模型则对包含用于确定生物学意义的至少2以上的靶标生物分子的上述靶标生物分子信息进行处理，该方法包括下列步骤：(a)对于至少2以上的样本获取各样本的上述各靶标生物分子的原始变量值；(b)以上述各靶标生物分子的原始输入变量值按照既定的处理方式处理后构成上述各靶标生物分子的partialdependenceplot或partialdependence函数关系；(c)利用上述各靶标生物分子的partialdependenceplot或partialdependence函数关系针对上述各靶标生物分子的原始变量值生成上述各靶标生物分子的变换变量值；及(d)把上述各靶标生物分子的变换变量值应用于既定的生物学意义确定统计模型的生成或生物学意义确定统计模型的实行；上述partialdependenceplot或partialdependence函数关系运用了集成方法，上述集成方法则是boosting算法技术与randomforest算法技术中的某一个以上的技术。优选地，在构成各上述靶标生物分子的partialdependenceplot或partialdependence函数关系时，对于构成上述靶标生物分子的靶标生物分子们中除了上述靶标生物分子以外的其它靶标生物分子的原始变量值取其平均地构成。优选地，上述原始变量值是上述各靶标生物分子的分析信息或2以上的靶标生物分子的分析结果比率程度中的某一个以上。为了实现本发明拟解决的技术课题，本发明提供一种对于上述靶标生物分子的影响力信息处理方法，该方法是和生物学意义确定统计模型相关的各靶标生物分子的影响力信息处理方法，该生物学意义确定统计模型把含有用于确定生物学意义的至少2以上的靶标生物分子的上述靶标生物分子信息加以处理，该方法包括下列步骤：(a)按照构成上述靶标生物分子的个别靶标生物分子生成影响力信息；及(b)对于构成上述靶标生物分子的个别靶标生物分子，生成按照个别靶标生物分子把影响力信息予以视觉化的信息；上述个别靶标生物分子的影响力由通过逻辑模型得到的判别函数确定，上述判别函数由下述[一般式2]表现，上述逻辑模型具有0和1之间的值，上述逻辑模型所含回归系数的推定则使用ridge函数。[一般式2]优选地，上述g(x)利用partialdependenceplot或partialdependency函数关系并使用对于上述各靶标生物分子的原始变量值的上述各靶标生物分子的变换变量值。优选地，上述视觉化是以2维平面的图形(chart)或曲线图(graph)显示的。而且，本发明揭示了一种确定生物学意义的方法及临床决策支援系统，该用于分析生物意义的系统利用通过配体-核酸分析方法生产出来的上述生物分子分析信息，该系统包括：(a)以对照组的临床信息为标准通过输入方式接收上述生物分子分析结果并且构建数据库的模块；(b)利用上述所输入的生物分子分析结果在分析系统进行前处理的模块；利用上述经过前处理的结果生成患者的模型的模块；(c)载入(loading)上述生成的模型并且适用于来院患者而进行作为盲测(blindtest)的诊断的模块；及(d)通过交叉检验评估系统性能的模块。由本发明生成的众多生物分子分析结果是具备高次元特性的庞大信息量并且生产出和细胞、组织或疾病相关的各式各样的信息。利用上述所输入的数据在分析系统执行前处理的模块找出影响患者状态的特征，而用于提高分类性能的多变量分析方法是为了正确地治疗与诊断而找出重要变量后降低次元或者通过特性的变形找出主要特质的特征提取(featureselection)步骤。具体上，特质的提取会根据分类信息是否用于学习而分为无监督学习(unsupervisedlearning)或监督学习方式(supervisedlearning)方式。无监督学习方式主要使用的pca(principalcomponentanalysis)或ica(independentcomponentanalysis)可以考量变量们的特性后提取特质。监督方式是利用分类信息与变量之间的统计显著性或变量之间的相关关系选择变量的方式。该方式在给定的特质集合以前向(forward)或后向(backward)依次添加或消除特质地通过适用于分类器的性能算出主要特质。利用上述进行前处理后的结果学习后生成患者模型的模块通过妥当的分类器(classifier)按照各类型(class)把选定的特质加以分类。本发明使用了人工神经网(artificialneuralnetwork)，其根据输入和输出决定行动，由于该特性而应用于样式(pattern)识别、函数近似、分类技术之类的很多领域。人工神经网的结构由多个层(layers)、节点(nodes)、神经网间连接加权值构成。本发明所使用的神经网层间连接方式是前馈(feed-forward)方式。根据输入样式利用各节点的神经网连接加权值和活性化函数算出了输出值。如果通过所生成的结合信息处理了某件事情时推定值和实际结果值相异的话，反复进行一边比较计算值和实际结果值一边减少误差的过程地查找。本发明提供一种生物分子分析方法及装置，其中，生成上述患者的模型的方法从线性模型(linearmodels)、支持向量机(supportvectormachines)、神经网(neuralnetworks)、分类及回归树(classificationandregressiontrees)、集成学习法(ensemblelearningmethods)、判别分析(discriminantanalysis)、最近邻法(nearestneighbormethod)、贝叶斯网络(bayesiannetworks)、独立成分分析(independentcomponentsanalysis)所组成的群选择。对于还没有发现正确的综合机制(mechanism)的大多数疾病来说，以案例为基础进行诊断的重要性是非常高的。但是，仅仅利用特定机器学习方法开发出来的现有的基于案例的机器学习推理系统由于正确度较低而一直被要求开发出经过改善的系统。而且，现有的系统被开发成利用所学习的一切临床检查项目的疾病判别机，并没有提供可运用各疾病的临床检查项目的重要度或优先顺位的方法。本发明涉及一种利用帮助支援医生正确诊断疾病的“基于案例的机器学习推理”的疾病诊断及检查项目选择系统，该系统通过疾病判别机分析新患者的检查信息并判别疾病，该疾病判别机则是以患者们的案例数据库(database)进行了培训的人工神经网(neuralnetwork)构成的机器学习机，然后凭借预诊断选择用于最终判别各疾病的最少的重要检查项目。基于机器学习推理的疾病诊断法是将机器学习法个别适用后构成的。生成上述患者的模型的方法有线性模型(linearmodels)、支持向量机(supportvectormachines)、神经网(neuralnetworks)、分类及回归树(classificationandregressiontrees)、集成学习法(ensemblelearningmethods)、判别分析(discriminantanalysis)、最近邻法(nearestneighbormethod)、贝叶斯网络(bayesiannetworks)、独立成分分析(independentcomponentsanalysis)等。本系统的组成及实务上的应用可以分成2种类地组成，仅仅用于诊断的独立(standalone)形态的诊断系统和连接到现有医院信息系统(即ocs、pacs、lis等)的统合系统。为了和统合系统进行联动，需要按照hl7及dicom规约组成系统。本系统以初始模型联动pms(patientmonitoringsystem)而提高了诊断的正确度。而且，除了pms以外，还能开发成与ocs、emr、pacs等多种医疗信息系统联动的系统而成为包含众多疾病因子的正确的诊断系统。本发明提供一种利用寡核苷酸的生物分子的分析方法及装置，其中，上述生物样本在细菌、真菌类、病毒、细胞株、组织所组成的群中至少选择一个以上。有益效果本发明利用配体pcr分析两个或两个以上的生物分子而得以在样本确认生物分子的生物学意义，能够凭借pcr方法的扩增及荧光学上的高灵敏度检测生物分子存在信号。更进一步，本发明所揭示的方法单凭一次检查就能分析各种生物分子并且对其分析结果利用软件高效率地确定样本中生物分子的变化、疾病的诊断、对于疾病的敏感性及对于治疗药剂的反应差异等个人之间的差异。附图说明图1是配体-核酸分析方法的概念图。图2是配体-核酸分析方法的设计核酸扩增及分析的概念图。图3是利用realtimepcr以配体-核酸分析法分析上述serialdilution的标准物质的结果，是以taqman探针分析了复合体的设计核酸扩增产物的结果。图4是利用毛细管电泳方法针对表达上述标准物质及靶标生物分子的设计核酸的扩增产物长度进行分析后的结果。图5是生物学意义确定用系统的逻辑架构。图6是生物学意义确定用系统的结构。图7是生物学意义确定用软件结构。图8是生物学意义确定用软件中统合管理工具acs的作用。图9是生物学意义确定的数据分析模块。图10是以通过配体-核酸分析方法生产出来的上述靶标生物分子的分析结果确定急性心肌梗塞患者或败血症患者的生物学意义的流程图。图11是利用临床决策支援系统诊断疾病的流程图，该临床决策支援系统则通过利用按照各疾病群建成的数据库及人工神经网的程序以所生产的分析结果对特定人的血液样本生成生物分子分析结果。图12是利用确定生物学意义的临床决策支援系统对上述配体-核酸分析所生产的靶标生物分子的结果进行分析而诊断患者的实施例。具体实施方式下面结合附图和实施例详细说明本发明的用于质量控制及测定的标准物质及设计核酸的制备方法以及在包含它们的一个或一个以上生物分子所构成的样本里的生物分子配体pcr分析方法。下面的具体例仅仅是为了举例说明本发明，不能因此限制本发明的范围。实施例1.靶标生物分子及质量控制及测定用外部标准物质为了准确地快速诊断患者的急性心肌梗塞而需要发掘出特异性和灵敏度高的诊断用生体指标，亦即，需要发掘出急性心肌梗塞特异标记物。目前为止，为了从患者血液诊断出急性心肌梗塞(ami)诊断而使用的著名am诊断标记物有肌红蛋白(myoglobin)、ck-mb、肌钙蛋白i(troponini)、肌钙蛋白t(troponint)等。心肌埂塞，尤其是，急性心肌梗塞在发生胸痛后6小时内不进行处置的话会死亡，因此快速诊断非常重要。败血症可以发展成伴随各脏器衰弱的严重败血症，严重时会变成呈现顽固性低血压的败血症休克而导致致命结果。因此，败血症的诊断、严重程度判断及实时观察需要快速、敏锐、特异的标记物。感染或组织损伤等所引起的炎症反应在随着时间发生的一系列过程中，从局部开始分泌包括interleukin(il)-6在内的细胞活素(cytokine)并且在肝脏生成急性期反应物质。在炎症或感染的诊断方面，不仅需要临床症状或症候，客观标记物的作用也很重要，目前为止已知标记物可以举例白血球数(包括中性白细胞或未成熟片段)、反应性c-蛋白(c-reactiveprotein,crp)、降钙素原(procalcitonin,pct)及il-6、il-10或tnf-α等。本发明所使用的靶标生物分子是作为急性心肌梗塞指标的肌红蛋白(myoglobin；,lifetechnologies公司，美国)、ck-mb(lifetechnologies公司，美国)、肌钙蛋白i(troponini；lifetechnologies公司，美国)、肌钙蛋白t(troponint；lifetechnologies公司，美国)及作为败血症指标的反应性c-蛋白(c-reactiveprotein,crp；lifetechnologies公司，美国)、降钙素原(procalcitonin,pct；lifetechnologies公司，美国)、il-6(lifetechnologies公司，美国)及il-10(lifetechnologies公司，美国)之类的蛋白质。而且，用于质量控制及测定的标准物质是大肠菌蛋白质e.colienoyl-acpreductase(sinobiologicalinc.中国)和植物蛋白质phototropin2(cosmobioco.ltd.日本)。实施例2.设计核酸及taqmanprobe的制备为了在具有用于质量控制及测定的标准物质的样本对一个或一个以上的靶标生物分子以利用与其相应的配体及设计核酸的配体-核酸分析方法进行分析，本发明所揭示的设计核酸的基本组成以下述一般式(i)表示：5'-n-p1α-nv-p3β-3'(i)在上述一般式(i)中，p1领域是和正向引物完全互补结合的部分，5'末端的反应性组n具有胺基而设有连接到配体的部分，该配体则是和靶标生物分子结合的物质。优选地，设计核酸可以在正向引物结合的碱基序列部分的上游(upstream)具备由大约10个核苷酸构成的间隔序列(spacer)。该间隔序列凭借结合在一般式(1)结构物的配体的立体效果防止正向引物被妨碍结合到p1领域，间隔序列的碱基序列是5'-tgattgaatt-3'。nv领域是利用特定碱基序列或其长度表达结合配体的特定生物分子(或内部标准物质、外部标准物质)的碱基序列，其允许检测·分析结合到配体的特定生物分子。优选地，其长度是10～200核苷酸。p3领域是逆向引物结合的部分。α及β表示核苷酸的个数而且α及β是8～30的整数。优选地，上述正向引物和逆向引物可以使用一切设计核酸中具备共同碱基序列的通用引物双。[表1]列示了本实施例拟使用的引物双。如[一般式(i)]所示，考虑反应性组、间隔序列及通用引物双地设计的设计核酸如[碱基序列(i)]所示。5'-nh2-tgattgaatt-cggaagcgtgctgggccnvcataacccagaggtcga-3'[(碱基序列(i)]在此，cggaagcgtgctgggcc特定为序号1而cataacccagaggtcga则特定为序号2。[表1]通用引物双的碱基序列引物碱基序列(5'→3')长度(nt)序号正向引物5'-cggaagcgtgctgggcc-3'173逆向引物5'-tcgacctctgggttatg-3'174[表2]列示了以特定碱基序列表达靶标生物分子、外部标准物质(e.colienoyl-acpreductase)的设计核酸的nv领域的碱基序列。[表2]表达靶标生物分子及外部标准物质的设计核酸的nv领域的碱基序列[表3]列示了为了分析上述外部标准物质及靶标生物分子，认知上述设计核酸nv领域并且生成信号的taqman探针的结构及碱基序列。[表3]对表达外部标准物质及靶标生物分子的设计核酸的碱基序列进行分析的taqmanprobe[表4]列示了以核酸长度表达靶标生物分子、外部标准物质(e.colienoyl-acpreductase)的设计核酸的nv领域的碱基序列与长度。[表4]以设计核酸的长度表达靶标生物分子及用于质量控制及测定的标准物质的设计核酸的nv领域的碱基序列及长度实施例3.分析用配体、收获配体、标准分析用配体及标准收获配体的制备把对靶标生物分子的各自相异的epitope的2种单克隆抗体或结合在靶标生物分子的多克隆抗体分成两个组，一组结合设计核酸而另一组则结合磁性物质，前者命名为分析用配体，后者则命名为收获配体。而且，如果是标准物质的抗体则把结合了设计核酸的抗体命名为标准分析用配体，结合了磁性物质的抗体则命名为标准收获配体。对于本发明所用靶标生物分子的抗体是作为急性心肌梗塞指标的抗肌红蛋白多克隆抗体(lifetechnologies公司，美国)、抗ck-mb多克隆抗体(lifetechnologies公司，美国)、抗肌钙蛋白i多克隆抗体(lifetechnologies公司，美国)、抗肌钙蛋白t多克隆抗体(lifetechnologies公司，美国)、以及作为败血症指标的抗反应性c-蛋白质多克隆抗体(liifetechnologies公司，美国)、抗降钙素原多克隆抗体(lifetechnologies公司，美国)、抗il-6多克隆抗体(lifetechnologies公司，美国)及抗il-10多克隆抗体(lifetechnologies公司，美国)等。对于本发明所用质量控制及测定用的外部标准物质的抗体是多克隆e.colienoyl-acpreductase抗体(sinobiologicalinc.中国)及多克隆phototropin1抗体(cosmobioco.ltd.日本)。设计核酸按照实施例2的[一般式(1)]及[碱基序列(i)]所提示的碱基序列订购地制备了低聚物(bioneer公司,韩国)。为了使用taqman探针分析设计核酸的扩增产物，以实施例2所提示的设计核酸订购制作了附有胺基的9种低聚物，一个表达质量控制及测定用的外部标准物质，8种低聚物各自表达8种靶标生物分子，其内容如[表2]所示。为了利用设计核酸的长度分析设计核酸的扩增产物，以实施例2所提示的设计核酸订购制作了附有胺基的9种低聚物，一个表达质量控制及测定用的外部标准物质，8种低聚物各自表达8种靶标生物分子，其内容如[表4]所示。使用thunder-linkoligoconjugationsystem(innovabiosciencesltd.,英国)并且按照其协议把各设计核酸结合到各靶标生物分子的特异性配体(抗体)或质量控制及测定用外部标准物质的特异性配体(抗体)。把100μl的制成60～100m的低聚物添加到oligoactivationreagent管，而且把100μl的1mg/ml抗体添加到antibodyactivationreagent管后在室温反应1小时地予以活性化。利用备妥的柱(column)让上述活性化后的反应溶液脱氯后，以适当比例混合上述脱氯的设计核酸与抗体并且在室温反应12～24小时。把conjugatecleanupreagent添加到上述设计核酸-抗体反应溶液后反应10分钟，在15,000g离心分离5分钟后收获设计核酸-抗体结构物并且把conjugatecleanupreagent添加到该设计核酸-抗体结构物后重新进行离心分离后得到了经过提炼的上述设计核酸-抗体结构物。如前所述地制备的18种所收获的设计核酸-抗体结构物在抗体为靶标生物分子的抗体时称为分析用配体，如果是用于质量控制及测定的标准物质的抗体则称为标准分析用配体。为了使用taqman探针分析设计核酸的扩增产物，使用dynabeadsantibodycouplingkit(lifetechnologies,美国)按照协议进行了磁性物质与8种靶标生物分子抗体及1种用于质量控制及测定的标准物质抗体的结合。在37℃让上述抗体与磁珠dynabeadsm-270epoxy反应12～24小时后，利用磁铁收获。以添加试剂盒所含洗涤溶液并且再悬浮后重新利用磁铁收获的方法进行洗涤消除未结合的抗体，收获了通过该过程提炼的dynabead-抗体结构物。所收获的dynabead-抗体结构物中抗体是靶标生物分子的抗体时为收获配体，如果是质量控制及测定用的外部标准物质的抗体则为标准收获配体。实施例4.分析用生物样本的准备把用于质量控制及测定的标准物质e.colienoyl-acpreductase及靶标生物分子在tbs[tris-bufferedsaline；150mmnaci,20mmtris-ci(ph7.5)及0.02％nan3]以最终浓度10ng/ml备妥于pcr管。分析用样本则以serialdilution方式制成很多种量(从1ng/ml到1ag/ml为止)地把标准物质与靶标生物分子备妥于pcr管。实施例5.复合体的形成及利用磁铁收获复合体把45ul的前述备妥的分析用样本溶液放进微量滴定板(microtiterplate)(falcon3911；bectondickinson)的well。在上述分析用样本溶液添加了50μl的含有0.45％nonfatdriedmilk与denaturedsalmonspermdna(0.1mg/ml)的tetbs(含有0.1mmedta及0.1％tween20的tbs)。把实施例3所制8种分析用配体、8种收获配体、1种标准分析用配体、1种标准收获配体以等量混合的10μl的tetbs添加到上述备妥的分析用样本后在室温反应30分钟。把添加250μl的tetbs后利用磁铁形成的生物分子复合体与标准物质复合体洗涤多次后进行最终收获。在实施例7进行了所收获的复合体设计核酸的核酸分析。实施例6.复合体的形成及利用elisa方法收获复合体把前面备妥的分析用样本45ul倒入微量滴定板(falcon3911；bectondickinson)的well。在4℃下把具有分析用样本的板(plate)处理15小时左右后把生物分子固定到板的well表面。利用250ul的tbs对板的well进行洗涤3次。把200μl的含有4.5％nonfatdriedmilk及denaturedsalmonspermdna(1mg/ml)的etbs(含有0.1mmedta的tbs)添加到各well后在37℃反应了80分钟。在各well添加150μl的tetbs后反应5分钟的过程反复进行了7次。在上述备妥的well里添加包含8种分析用配体、标准分析用配体、0.45％nonfatdriedmilk及denaturedsalmonspermdna(0.1mg/ml)的50μl的tetbs后在室温反应45分钟。把各well里加入250μl的tetbs后反应10分钟的过程进行15次地消除了未结合的的配体。利用没有nan3的tbs把各well洗涤3次后得到了经过提炼的复合体。在实施例8进行了所得到的复合体设计核酸的核酸分析。实施例7.利用设计核酸的碱基序列的生物分子的分析利用设计核酸的碱基序列在添加了用于质量控制及测定的标准物质的样本中进行的一个或一个以上靶标生物分子的分析以下列方式实行，利用相应于设计核酸的碱基序列的taqman探针的多重实时聚合酶链式反应法(multiplexreal-timepcr)。多重实时聚合酶链式反应使用了real-timelightcyclertm(roche，瑞士)pcr及faststartdnamasterhybridizationprobepcrmix(roche，瑞士)。关于pcr反应液，在2.4μl的25mmmgcl2,2μl的由5pmole/l的正向引物、5pmole/l的逆向引物及2.5pmole/l的探针组成的引物-探针混合物(primer-probesmix)、2μl的lightcyclerdnafaststarthybridizationmix添加灭菌蒸馏水制成18μl并且均匀混合后移到玻璃capillary，分株了所收获的复合体(标准曲线)2μl。进行聚合酶链式反应的反应物的总体积为25μl，因此检测靶标生物分子及用于质量控制及测定的标准物质的引物及探针的浓度各为0.4um(12.5pmoles/25μl)及0.2um(62.5pmole/25μl)。[表5]进行realtimepcr的反应物的组分及浓度在前文实行了复合体提炼及收获步骤后，在下列条件下实行了pcr：(a)预变性(pre-denaturing)步骤，在95℃进行5分钟及(b)40℃循环，由95℃进行15秒(变性步骤)及56℃进行15秒(退火及延长步骤)所构成的一个循环。此时，进行多重实时聚合酶链式反应的反应物的组分列示于上述表5。上述多重实时聚合酶链式反应方法是一种根据dna聚合酶与荧光共振能量转移(fluorescenceresonanceenergytransfer,fret)原理在实时聚合酶链式反应的每个周期实时进行的荧光检测定量方法。如下进行了设定，实时显示器上famtm发色时在绿色通道(channel)(510±5nm)显示，hextm发色时在黄色通道(555±5nm)显示、cy5tm发色时在红色通道(660±10nm)显示、roxtm发色时在朱黄色通道(610±5nm)显示及cy5.5tm发色时在深红色通道(712logpass)显示。在绿色通道、黄色通道、红色通道、朱黄色通道及深红色通道观察了荧光。在各管中深红色通道的阈(threshold)值指定为0.04而其余通道的阈值则指定为0.03，然后确认ct(thresholdcycle)值。在ct值<36时观察到峰值(peak)的话判读为阳性。按照10倍率把10ng/ml的用于质量控制及测定的标准物质e.colienoyl-acpreductase予以逐步稀释。针对如此制备的标准物质样本适用本发明的引物及探针并且实行real-timepcr确认了检测界限。图3示出了其结果。为了和上述real-timepcr结果进行比较，按照10倍率逐步稀释了同一标准物质后适用本发明的引物及探针并且通过conventionalpcr确认了检测界限。在conventionalpcr中检测界限虽然达到稀释倍数105，但是在multiplexreal-timepcr中检测界限到达了稀释倍数107。因此可知multiplexreal-timepcr呈现出相当于102的优异检测界限。图3示出了multiplexreal-timepcr结果。在一个管里，把在包含用于质量控制及测定的标准物质的样本分析8种靶标生物分子的过程中形成的它们的复合体以磁铁收获的情形或以elisa方法收获的情形共同适用地，从把所形成的标准物质复合体的设计核酸予以realtimepcr后得到的曲线加以分析的结果得知，在拟以本发明的配体pcr分析的样本能够正常进行了标准物质及靶标生物分子的分析。而且，在前文形成并且以磁铁收获的情形或以elisa方法收获的情形共同适用地，可以把所收获的靶标生物分子复合体的设计核酸予以realtimepcr后得到的曲线和相应于用于质量控制及测定的标准物质的曲线加以比较分析而把靶标生物分子予以定量或者算出标准物质/靶标生物分子的量化比例。在一个管里，把对于急性心肌梗塞的8种靶标生物分子复合体及用于质量控制及测定的标准物质复合体以磁铁收获的情形及以elisa方法收获的情形共同适用地，对多重生物分子进行分析的realtimepcr在该荧光通道特异地确认了靶标生物分子，该多重生物分子则包含对于它们的引物双及探针。为了评估标准曲线的精密度而把提炼的pcr产物以10倍数连续稀释(10-4-10-9)后对批内(within-run)变异系数(coefficientofvariation,cv)和批间(between-run)变异系数进行了测定。关于批内变异系数，在一次real-timepcr期间把各浓度的连续稀释的靶标生物分子myoglobin和标准物质act1pcr产物各自分成3个后反复进行测定；关于批间变异系数，则通过针对标准物质、myoglobin、creatinekinaseisoformmb、cardiactroponini、cardiactroponint、il10、il6、crp及pct的real-timepcr测定进行了分析。标准曲线以显示light-cycler(rochediagnosticcorp.,indianapolis,in,usa)本身连续稀释的初始模板浓度的log值(y轴)对cp值(x轴)地画出，此时，赋予倾斜度(slope)与error值并且利用倾斜度计算了pcr的效率(efficiency,e＝10-1/slope)。对利用标准曲线的ct值的急性心肌梗塞监控用myoglobin与标准物质复合体的设计核酸的检查过程中批内变异系数分别是0.12～0.84％与0.20～1.05％，平均标准偏差(sd)是0.09周期(表6)。[表6]基于lightcyclerreal-timepcr的标准物质及靶标生物分子的标准曲线的批内变异系数对于上述急性心肌梗塞监控用4种靶标生物分子myoglobin、creatinekinaseisoformmb、cardiactroponini、cardiactroponint及标准物质复合体的设计核酸的批间变异系数分别是0.07-0.92％、0.12-0.55％、0.25-0.81％、0.12-0.44％、0.26-0.49％、0.05-0.29％，平均标准偏差是0.97周期。对于各靶标生物分子及设计核酸复合体的设计核酸的pcr效率呈现出1.90(range，1.60-2.14)、1.78(range，1.65-1.88)、1.78(range，1.65-1.88)、1.82(range，1.67-2.00)、1.80(range，1.50-2.03)，因此所分析的复合体的设计核酸之间没有显著性差异(表7)。[表7]基于lightcyclerreal-timepcr的靶标生物分子的标准曲线的批间变异系数及扩增效率对于上述败血症监控用4种靶标生物分子il10、il6、crp、pct及标准物质复合体的设计核酸的批间变异系数分别是0.25～0.48％、0.32-0.52％、0.29-0.46％、0.22-0.45％、0.05-0.29％，平均标准偏差则是0.97周期。对于各靶标生物分子及标准物质复合体的设计核酸的pcr效率是1.72(range，1.54-2.07)、1.83(range，1.62-2.27)、1.82(range，1.59-2.05)、1.79(range，1.52-2.27)、1.80(range，1.60-2.15)，因此所分析的复合体的设计核酸之间没有呈现显著性差异(表8)。[表8]基于lightcyclerreal-timepcr的靶标生物分子的标准曲线中的批间变异系数本发明利用multiplexrealtimepcr对于在一个管里让一个或一个以上的靶标生物分子与用于质量控制及测定的标准物质同时进行反应后收获的复合体中所含设计核酸进行分析后获得ct值，利用该ct值进行了绝对定量及相对定量。在本发明中，作为设计核酸的amplicon的结构如上述[一般式(i)]所示地以同一结构和同一pcr引物双扩增而使得表达上述靶标生物分子与用于质量控制及测定的标准物质的设计核酸的扩增效率都会相同。在本发明中，对于凭借人为地添加了用于质量控制及测定的标准物质的拟分析样本所含靶标生物分子所形成的复合体设计核酸的存在量，利用上述实施例中得到的ct(cyclethreshold)值以2-ct法(comparativectmethod)进行了分析(livakkj.comparativectmethod.abiprism7700sequencedetectionsystem.userbulletinno.2.relativequantitationofgeneexpression.peappliedbiosystems,1997.)。在本ct法中，不必制作校准曲线也能实行定量。但是，其前提是对于所测定的一切生物分子的pcr扩增效率几乎维持一定。把添加了标准物质的拟分析的样本所分析出来的靶标生物分子的复合体设计核酸的ct值以标准物质复合体的设计核酸ct值予以normalization(ct靶标生物分子-ct外部标准物质)并且将其定义为△ct-n的话，能如下算出添加了标准物质的拟分析的样本中靶标生物分子的浓度：外部标准物质的浓度如果外部标准物质与其特异性配体的结合力和靶标生物分子与其特异性配体的结合力之间存在着异，上述所确定的靶标生物分子的浓度可能无法准确地反映其在样本中的浓度。因此，优选地，以其结合力的差异予以校准。为了进行该校准，先把靶标生物分子和靶标外部标准物质予以定量并备妥1个以上以同一浓度包含它们的对照样本，利用该对照样本(们)求得算自对靶标生物分子的复合体的设计核酸的扩增子的ct值(或对照样本为2以上时，其诸值的平均)和算自外部标准物质复合体的设计核酸的扩增子的ct值(或对照样本为2以上时，其诸值的平均)，进而求得作为其差异值(ct对照样本的靶标生物分子-ct对照样本的外部标准物质)的△ct-c。接着，求得以该值把上述△ct-n予以calibration的△ct-cal(△ct-n-△ct-c)，利用△ct-cal如下式所示地从外部标准物质的浓度算出靶标生物分子的浓度就能得到反映了上述结合力差异的结果。外部标准物质的浓度因此，可以说拟分析的样本中的靶标生物分子以外部标准物质浓度的倍的浓度存在。实施例8.利用设计核酸的长度的生物分子分析利用设计核酸的长度在添加了用于质量控制及测定的标准物质的样本中进行的一个或一个以上靶标生物分子的分析是以能够分析设计核酸的长度的毛细管电泳进行的。上述实施例中，把在一个管里形成的用于质量控制及测定的标准物质复合体和8种靶标生物分子复合体以磁铁收获的情形或以elisa方法收获的情形下，都实行pcr后确保了扩增产物。对于上述所收获的复合体，添加20um的标记了cy5的通用型pcr正向引物(5'-cy5-cggaagcgtgctgggcc-3)、10um的通用型pcr逆向引物(5'-tcgacctctgggttatg-3')后使用三次蒸馏水把反应体积调节成20μl的混合液，使用pfu-pcr预混合剂(bioneer公司，韩国)对该混合液在95℃实行30秒、在60℃实行30秒、在72℃实行30秒地总共实行35次后扩增了完整的双链核酸。为了以核酸的长度实行复合体设计核酸的扩增产物分析，针对上述扩增产物进行了毛细管电泳。毛细管电泳则使用abi3130xlgeneticanalyzer(36-cmcapillaryarray及pop7polymer；appliedbiosystems公司，美国)并且按照所提供的协议实行。把1,0ul的上述pcr反应物和9l的hi-diformamide混合并且在80℃下反应2分钟后，放入冰里。把样本注入毛细管并且在1.6kv的电压适用15秒钟后，在10kv的电泳电压及60℃温度进行了毛细管电泳。图4示出了把根据本发明的一个实施例收获的8种生物分子及用于质量控制及测定的标准物质复合体利用磁铁收获时及利用elisa方法收获时，对这些复合体的设计核酸进行pcr后得到扩增产物并且利用毛细管电泳对该扩增产物进行分析的结果。在一个管里，把在包含用于质量控制及测定的标准物质的样本分析8种靶标生物分子的过程中形成的它们的复合体以磁铁收获的情形或以elisa方法收获的情形共同适用地，从把所形成的标准物质复合体的设计核酸予以pcr后得到的扩增产物利用毛细管电泳分析的结果得知，在拟以本发明的配体pcr分析的样本正常进行了用于质量控制及测定的标准物质及靶标生物分子的分析。而且，在前文形成并且以磁铁收获的情形或以elisa方法收获的情形共同适用地，把所收获的标准物质及靶标生物分子复合体的设计核酸予以pcr后得到的扩增产物以毛细管电泳确保所得结果后，把上述靶标生物分子的分析结果和上述标准物质的分析结果加以比较分析，最终把上述靶标生物分子予以定量或者算出标准物质/靶标生物分子或靶标生物分子之间的量化比例。在毛细管电泳的图4的结果(electropherogram)中各峰值表示基于长度的各扩增子而其面积则表示扩增子的量。因此，由于使用了具备一定浓度的外部标准物质，因此把靶标生物分子的峰值面积和外部标准物质的峰值面积进行比较及计算而能够求得样本中的靶标生物分子的浓度。而且，像ct法一样地利用以同一浓度包含靶标生物分子与外部标准物质的对照样本进行毛细管电泳后反映和各配体的结合力的差异。反映了该结合力的差异时能更正确地算出样本中的靶标生物分子的浓度。实施例9.生物学意义的分析利用生物样本血液诊察急性心肌梗塞或败血症之类的慢性疾病，尤其是，通常检查3～4个患者监控用生物分子并且仅仅参考其结果的cut-off数值地进行诊断。体外诊断多元指标检查(invitrodiagnosticmultivariateindexassays；ivdmia)是一种把多个靶标生物分子予以定量检查并且以其结果为基础针对正常集团与患者集团之间的函数关系进行定量分析地诊断的装置或技术，该方法以诊断、治疗、缓和、处置、预防为目的使用解析函数把靶标生物分子的多个结果加以结合后以患者的特异结果把作为生物学意义的疾病或其它状态加以分类并且算出评分及指数等。把下列内容输入本发明的确定生物学意义的临床决策支援系统(clinicaldecisionsupportsystem)，上述内容为，把通过扩增产物分析装置(可确认核酸碱基序列的装置realtimepcr或作为可确认核酸长度的装置的毛细管电泳装置等)生产的标准物质及靶标生物分子与配体复合体中所含设计核酸的扩增产物分析结果加以校准的数据、ocs(operationcontrolsystem)系统的患者信息。输出方面则包括下列画面，临床医生输入分析结果后确认的画面、能让诊断医生对患者说明危险性及其类型的画面、能以视觉方式对患者说明的画面。生物学意义分析系统需要具备扩增产物分析装置、ocs与interface，还需要能够把通过datamining得到的结果保存到db。可以为了处理hl7所定义的xml数据而配备xmlrepository。能针对进行datamining时需要的项目进行设定并且控制mining引擎。如图4所示，上述临床决策支援系统的学习引擎模块是一种利用表达上述靶标生物分子的设计核酸的扩增产物分析结果判断疾病时需要配备的人工智能学习引擎模块。生物学意义分析系统支持hl7。意味着以下列方式设计数据结构，亦即，在生物学意义分析系统内部处理数据时包含hl7所定义的schema。为了保存并使用xml文件的schema信息而具备xmlrepositorymodule与xmlrepositoryclient。为了和能够对表达靶标生物分子的设计核酸的扩增产物进行分析的扩增产物分析装置联动而配备扩增产物分析结果interfacemodule。扩增产物分析结果提供sdk(softwaredevelopmentkit)时，原则上需要开发gateway。ocsinterfacemodule在ocs读取患者信息后为datamining提供所需信息。而且，把datamining所分析的疾病信息保存到ocs(lis)。如图5所示，上述临床决策支援系统的生物学意义分析主要包括四个子系统，这是一种作为生物学意义确定引擎的数据分析/预测模型生成模块和诊断客户端模块、作为和生成适体芯片数据的扩增产物分析装置联动的模块的扩增产物分析装置界面(interface)、负责和其它模块之间的通信及数据保存的通信服务器有机结合的系统。系统的驱动主要包括系统构建步骤和系统适用步骤。系统构建步骤包括下列过程，构建可忠实反映疾病特性地构成的正常人/患者样本集合，针对靶标生物分子进行配体-核酸分析，该靶标生物分子则利用对于该样本集合的用于质量控制及测定的标准物质，通过扩增产物分析装置界面模块把靶标生物分子-配体复合体及标准物质配体复合体的设计核酸信息输入系统，在数据分析/预测模型生成模块予以基本的前处理后生成人工神经网算法的学习数据，以人工神经网算法利用学习数据生成生物学意义分析模型，把所生成的生物学意义分析模型保存到电脑。如图6所示，系统适用步骤包括：把db所保存的生物学意义分析模型安装到生物学意义分析客户端；驱动生物学意义分析客户端；利用生物学意义分析对象的配体-核酸分析及扩增产物分析装置生成分析结果信息；通过扩增产物分析装置界面输入数据；在生物学意义分析客户端进行生物学意义分析及结果视觉化；把生物学意义分析结果保存到db。如图7所示，系统的输入数据是患者的血液样本靶标生物分子信息及个人信息、其它诊疗结果之类的临床信息。配体-核酸分析方法是一种利用样本所含标准物质-配体复合体的设计核酸测定靶标生物分子-配体复合体所含设计核酸的分析结果的分析技术，通过该配体-核酸分析方法可以根据患者的血液样本掌握和疾病颇有关联的靶标生物分子的分布样态。正常(normal)样本与患者样本在一切实验中仅将得自同一靶标生物分子的信息用于学习与测试。靶标生物分子组分析结果信息首先从表达靶标生物分子的设计核酸的扩增产物分析后到，通过基于扩增产物分析装置的realtimepcr的扩增产物ct(cyclethreshold)分析步骤实现数值化。如图7所示，靶标生物分子分析结果数据的各ct值表示靶标生物分子样态程度。数值数据得自扩增产物的ct数据，各值意味着一个靶标生物分子的值，数字值则意味着对各靶标生物分子的样态的程度。除了靶标生物分子信息以外，系统还输入对于各患者的临床信息。各患者们的年龄、性别、血压、家族病历史、吸烟与否等各患者的临床信息也是通过输入方式得到。这些资料全部保存到数据库。为了构建系统而使用的临床数据基本上使用得自协作医疗机构者，靶标生物分子的样态数据则使用靶标生物分子-配体复合体的设计核酸分析实验数据。关于所输入的ct数据，以配体-核酸分析方法对一个或一个以上的靶标生物分子利用相应于靶标生物分子的ct值信息。如图8所示，配体-核酸分析实验结果通过扩增产物分析装置转换成数值数据。为了在疾病生物学意义确定用系统直接利用该数据，需要让能够读取表达靶标生物分子的设计核酸的扩增产物ct数据的扩增产物分析装置和把生物学意义确定用系统联动。因此，基本上使用提供sdk的扩增产物分析装置，开发出用于和确定生物学意义的临床决策支援系统联动的gateway。另一方面，用于确定生物学意义的临床数据则以输入方式接收ocs系统的患者信息。通过ocsinterfacemodule读取来自ocs的患者信息后把数据挖掘时所需信息提供给系统引擎。如图8所示，对于确定疾病生物学意义的指标预测是以数据库内的信息为基础实现的。利用所保存的信息适用多种机器学习(machinelearning)方法就能进行针对疾病的指标分析。人工神经网(artificialneuralnetwork)、决策树(decisiontree)、贝叶斯网络(bayesiannetwork)、支持向量机(supportvectormachine，svm)之类的典型机器学习方法被作为用于分析的核心算法使用。一般来说，这些方法在输入了向量形态的数值数据后对其进行学习后能够针对新数据进行预测。人工神经网与支持向量机在数据分类方面发挥出卓越性能，因此是机器学习领域的研究中最常使用的分类算法。而且，决策树与贝叶斯网络的优点则是能将结果视觉化成人们容易理解的方式。本生物学意义确定用系统通过人工神经网算法持续进行测试地把学习模型优化(optimize)，凭此，获得优异的疾病指标预测性能。以输入方式收到了利用用于质量控制及测定的标准物质对新患者的一个或一个以上靶标生物分子以配体-核酸分析方法生产出来的ct的分析结果信息和临床信息后，分析系统以各种多样化的形态显示出包括针对特定疾病的指标在内的分析结果。显示出有助于医疗小组对疾病进行决策的信息。client不仅显示对于疾病指标的单纯数值信息，还通过生物学网络等方式更视觉化地显示出疾病指标程度。对于特定疾病的分析结果不仅有助于医疗小组，还能帮助患者们更容易了解关于本身疾病的指标及其原因等。通信服务器则对确定生物学意义的临床决策支援系统的通信进行控制。其针对扩增产物分析装置界面、生物学意义确定引擎、生物学意义确定客户端、数据库服务器等收发数据的一切部分进行控制。亦即，把患者的实验信息输入db，生物学意义确定引擎导入患者的实验信息后诊断，把生物学意义确定结果保存到db，把生物学意义确定结果输出到生物学意义确定客户端画面，负责诸如此类的数据管理方面的全部领域。而且，数据库服务器把患者的检查信息、患者的实验信息、进行生物学意义确定时所需学习信息、生物学意义确定引擎模型信息、系统配置信息、系统日志(log)信息、生物学意义确定结果信息等各式各样的数据加以保存。通信服务器与数据库拥有相互紧密的关系，管理各模块的数据传输。如图9所示，对于添加了上述用于质量控制及测定的标准物质的血液样本，可以利用配体-核酸分析方法在血液样本以上述标准物质的分析结果为基准确认上述靶标生物分子的分析结果，而且，确认急性心肌梗塞患者或败血症患者的血清生物分子的分析结果相异而得以确定生物学意义。图10是一种针对所生成的分析结果以按照各疾病群建成的数据库及人工神经网构成的临床决策支援系统生产出特定人的血液样本的生物分子分析结果后诊断疾病的流程图。如图11所示，针对以众多生物样本生产出来的分析结果构建的数据库利用生物信息学技术进行分析后得到有用信息并且能够利用该有用信息确定生物学意义。前文详细记载了本发明的特定部分，本发明所属
技术领域：
中具备通常知识者当知，该具体记载仅仅是一个实现例而无法据此限制本发明的范畴。因此，本发明的实质范畴应由权利要求书及其等值范围定义。产业上的用途使用本发明的配体核酸分析方法时单凭一次检查就能分析样本所含靶标生物分子，因此能够从样本确认靶标生物分子的生物学意义，以pcr及荧光学扩增存在信号而得以利用较高灵敏度进行检测。因此，本发明提供了一边进行内部质量控制一边单凭一次检查就能分析靶标生物分子而从样本高效率地确定疾病筛查、疾病诊断、对于疾病的敏感性以及对于治疗药剂的反应差异等个人之间差异的方法，从而对人类疾病的克服做出了较大贡献，在经济方面也能对医疗产业发挥出非常有用的效果。当前第1页12