改善的洗涤组合物的制作方法
本申请要求于2015年8月28日提交的ep15183065.0的优先权权益，其内容全部并入本文。
本发明涉及包含某些脂肪酶，尤其是嗜冷脂肪酶(psychrophiliclipase)的组合物。
背景技术：
洗衣组合物通常含有酶以改善清洁性能。然而，许多酶仅在较高温度下才被激活，这意味着必须加热大量的水以在适当温度下提供洗液以激活酶内容物。
由于消费者和洗衣组合物供应商关注可持续性以及由于能源价格上涨，这表现出越来越不受欢迎。
然而，尽管低温和冷洗涤具有明显的吸引力，但消费者通常不愿意或不情愿牺牲清洁性能。
本领域需要在低温下具有改善的清洁性能的洗衣组合物。
技术实现要素：
本发明涉及某些脂肪酶和涉及包含所述脂肪酶的组合物。优选地，组合物还包含生物表面活性剂。这里描述了包括某些优选生物表面活性剂的生物表面活性剂，以及脂肪酶与生物表面活性剂的某些优选比率。优选的生物表面活性剂是甘露糖赤藓糖醇脂(mel)，优选富含mel-b的甘露糖赤藓糖醇脂。
合适地，脂肪酶是嗜冷脂肪酶，例如来自psychromonasingrahamii的冷适应脂肪酶。换句话说，合适地，脂肪酶是psychromonasingrahamii脂肪酶。本发明人已经识别了来自p.ingrahamii的推定的第3类脂肪酶(putativeclass3lipase)，称为pinlip。图1显示了氨基酸序列比对(与lipex比对)。其中显示的lipex序列可以被看作seq.id1，而其中显示的pinlip序列可以被看作seq.id2。
如本文所用，术语“嗜冷”酶是指在0℃至25℃温度下有效的酶。
因此，本发明进一步涉及脂肪酶，其具有图1所示的氨基酸序列(标记为pin-lip，称为seqid.2)，或与图1所示的氨基酸序列(标记为pin-lip，称为seqid.2)具有至少70％的序列同一性。或者，该同一性可以是70，71，72，73，74，75，76，77，78，79，80，81，82，83，84，85，86，87，88，89，90，91，92，93，94，95，96，97，98，99或100％的序列同一性中的任一个。
冷活性酶是期望的，因为可以使用较冷的洗液温度。这进而改善可持续性(因为洗衣用热水是二氧化碳的主要来源)并减少消费者的能源账单。这对于洗涤可能由于高温洗涤而例如通过收缩或褪色而受损的物品也是有用的。
然而，冷活性酶的主要问题是维持酶稳定性，特别是在液体制剂中、在储存过程中以及随后在洗涤循环中。此外，冷洗涤循环通常不适用于某些污渍类型，特别是脂肪污渍。
本发明试图解决这些问题中的至少一些。
在第一方面，本发明可以提供与seq.id.2具有至少70％的序列同一性的脂肪酶。
另一方面，本发明可以提供包含这样的脂肪酶的洗衣组合物。
另一方面，本发明可以提供包含来自pyschromonasingrahamii的脂肪酶的洗衣组合物。该脂肪酶可以被称为嗜冷脂肪酶和/或冷适应脂肪酶。
脂肪酶可以是推定的第3类脂肪酶。换句话说，脂肪酶可以是推定的甘油三酯脂肪酶。在这种情况下的推定意味着使用本领域已知的测试进行识别。
本发明人已经证明，与单独的嗜冷脂肪酶相比，包含生物表面活性剂改善了清洁。本发明人还已经证明，嗜冷脂肪酶和生物表面活性剂的组合在至少一些情况下优于基准嗜温脂肪酶lipex和相同生物表面活性剂的组合，特别是在较低温度下。因此，优选地，组合物还包含生物表面活性剂。
嗜冷脂肪酶是psychromonasingrahamii脂肪酶。脂肪酶可以是野生型或突变型。脂肪酶可以具有图1所示的氨基酸序列(标记为pin-lip)或与图1所示的氨基酸序列具有至少70％的序列同一性。或者，该同一性可以是70，71，72，73，74，75，76，77，78，79，80，81，82，83，84，85，86，87，88，89，90，91，92，93，94，95，96，97，98，99或100％的序列同一性中的任一个。例如，其可以是至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，或甚至至少95％。
优选地，组合物是液体。许多消费者优选液体组合物，并且由于包装减少和运输占地较小，浓缩液体产品改善可持续性。
合适地，组合物包含生物表面活性剂，其是糖脂(换句话说，生物表面活性剂包含碳水化合物)。合适的生物表面活性剂是如本文所述并且包括鼠李糖脂、槐糖脂、海藻糖脂(海藻糖脂质)和甘露糖赤藓糖醇脂(mel)及其组合。
应理解，这些术语中的每一个都是指已知类别的化合物。糖脂可以具有单一结构，例如mel-b，或者它可以是该类别内的结构的混合物。
在某些情况下，生物表面活性剂是鼠李糖脂。鼠李糖脂可以包含至少50重量％的单鼠李糖脂，任选地至少60重量％，70重量％，80重量％，90重量％，95重量％，98重量％，甚至至多100重量％。鼠李糖脂可以包含至少50重量％的二鼠李糖脂，任选地至少60重量％，70重量％，80重量％，90重量％，95重量％，98重量％，甚至至多100重量％。优选地，鼠李糖脂富含单鼠李糖脂。例如，鼠李糖脂可以包含至少50重量％的单鼠李糖脂，例如至少80重量％的单鼠李糖脂。生物表面活性剂可以唯一地是单鼠李糖脂。
在一些情况下，生物表面活性剂是甘露糖赤藓糖醇脂。优选地，甘露糖赤藓糖醇脂富含甘露糖赤藓糖醇脂b(mel-b)。mel可以包含至少50重量％的mel-b，任选地至少60重量％，70重量％，80重量％，90重量％，95重量％，98重量％，甚至至多100重量％。生物表面活性剂可以唯一地是mel-b。
本发明人已经观察到，与基准酶lipex和生物表面活性剂相比时，包含如本文所述的嗜冷脂肪酶和生物表面活性剂的组合物在更低的总表面活性下提供增强的清洁。因此，包含如本文所述的嗜冷脂肪酶的洗衣组合物提供了在低温下改善的污渍去除的潜力。
在一些情况下，组合物的总表面活性剂含量为30重量％或更少，例如25％或更少，20％或更少，18％或更少，15％或更少，12％或更少或甚至更低。
应理解，除生物表面活性剂之外的表面活性剂可以存在于组合物中。换句话说，组合物可以包含糖脂表面活性剂和/或其他表面活性剂。在一些情况下，总表面活性剂含量是糖脂表面活性剂含量。在其他情况下，存在糖脂表面活性剂和其他表面活性剂的混合物。在其他情况下，不存在生物表面活性剂。其他表面活性剂在本领域中是已知的并且包括直链烷基苯磺酸(las)、月桂醇聚醚硫酸酯钠(sles)和非离子表面活性剂。
在一些情况下，生物表面活性剂与非生物表面活性剂的比率可以是1:9至1:1，例如1:9至1:2，1:9至1:3，1:9至1:4。
换句话说，生物表面活性剂含量可以是组合物的总表面活性剂含量的1至100重量％。在一些情况下，生物表面活性剂含量是组合物的总表面活性剂含量的1重量％至50重量％，例如组合物的总表面活性剂含量的10重量％至50重量％。在一些情况下，其为10重量％，20重量％，30重量％，40重量％或50重量％。
非生物表面活性剂(其他表面活性剂)可以包括但不限于las(直链烷基苯磺酸盐)、sles(月桂醇聚醚硫酸酯钠)和ni(非离子表面活性剂)。例如，在某些情况下，las与sles与ni的比率为2:1:3。
合适地，脂肪酶与生物表面活性剂的比率为1:10至1:200，例如1:10至1:150，1:10至1:100，1:15至1:80，1:20至1:60，1:30至1:50。在某些情况下，其大约是1:40。
本发明的组合物允许在较低的温度下洗涤物品(例如衣服、窗帘、家用亚麻布和毛巾)。
本发明可以进一步提供包含脂肪酶和甘露糖赤藓糖醇脂的组合物。优选地，甘露糖赤藓糖醇脂富含甘露糖赤藓糖醇脂b(mel-b)。mel可以包含至少50重量％的mel-b，任选地至少60重量％，70重量％，80重量％，90重量％，95重量％，98重量％，甚至至多100重量％。生物表面活性剂可以唯一地是mel-b。除了另有明确规定的情况以外，关于第一方面描述的优选项也适用于此。
另一方面，本发明涉及洗涤物品的方法，所述方法包括在含有根据第一方面的组合物的水性洗液中洗涤物品。例如，水的温度是室温(也称为环境温度)。
有利地，由于本发明的组合促进的在低温下的期望去污和清洁，可以使用较冷的洗涤步骤。例如，即使是对于脂肪染污，洗涤步骤温度可以为40℃或更低，35℃或更低，30℃或更低，25℃或更低。在一些优选实施方式中，不使用加热(使用未加热的水)：洗液温度是进入机器或从水龙头进入碗或盆的冷填充的温度。自然地，这将随供应和地理变化而变化，但可以低至10℃，或甚至更低。例如，在美国北部的州，冬季供水可以低至7℃或甚至5℃。这可以被称为环境洗涤。
不加热水降低能源消耗、减少能源账单并使洗涤更环保。
因此，另一方面，本发明提供洗涤物品的方法，所述方法包括在含有根据本文所述的组合物的水性洗液中洗涤物品，其中洗液的温度为25℃或更低，20℃或更低，15℃或更低，10℃或更低，或甚至5℃或更低。
本发明人已经发现，对于至少一些嗜冷酶如pinlip，对于某些短/中等长度的酯的活性在这样的环境洗涤的较高温度范围内改善。因此，在某些情况下，洗液温度为15-25℃。
然而，本发明人已经观察到，在各种各样的温度范围内，脂肪酶对一定范围的酯链长度具有活性。
本发明人已经发现，可以使用低浓度的嗜冷脂肪酶。例如，洗液中嗜冷脂肪酶的浓度可以是2.5至20mg/l。
这进一步改善了可持续性和经济。
合适地，洗液中生物表面活性剂的浓度为0.001至1重量％，优选0.005至0.5重量％，0.01至0.5重量％，0.01至0.2重量％。
附图说明
图1显示来自p.ingrahamii的推定的第3类脂肪酶的序列比对。
图2显示纯化的pinlip的10％sds-page凝胶。
图3显示由脂肪酶进行的pnp-酯水解的示意性反应。
图4显示pnp校准曲线的线性化。
图5显示在5a：4℃；图5b：15℃；5c：25℃下，对不同pnp-酯的pinlip活性。
图6显示pinlip和lipex与制剂(blackbull)组合和单独制剂对照的比较。
图7显示对于pinlip(a)和lipex(b)两者，在各种酶浓度下的sri值。
图8显示对于pinlip与各种生物表面活性剂组合，在不同表面活性剂浓度下的sri值。
图9显示对于生物表面活性剂与表面活性剂的不同比率的sri值。
具体实施方式
缩略语
suc-ala-ala-phe-7-酰氨基-4-甲基香豆素——n-琥珀酰-l-丙氨酰-l-丙氨酰-l-苯丙氨酸-4-甲基-香豆基-7-酰胺
caps——n-环己基-3-氨基丙磺酸
tris——三(羟甲基)氨基甲烷
cie——国际照明委员会
sri——去污指数
定义
如本文所用，术语“有效的”是指酶具有实现去污或催化能力的能力(在给定的温度区域内)。
如本文所用，在酶织物处理组合物的上下文中，术语“处理”优选是指清洁并且更优选去污。
优选地，根据缓解(remission)单位或缓解指数测量去污。有效的去污优选由等于或大于2缓解单位的缓解表示。
酶
如本文所用，术语“酶”包括酶变体(例如通过重组技术产生)。这样的酶变体的实例例如在ep0251446(genencor)，wo91/00345(novonordisk)，ep0525610(solvay)和wo94/02618(gist-brocadesnv)中公开，其每一个通过引用全文并入本文。
酶可以来自细菌或真菌来源。包括化学修饰的或蛋白质工程化的突变体。
百分比序列同一性
百分比(％)序列同一性被定义为在比对序列并在必要时引入空位以获得最大序列同一性之后，并且不考虑作为序列同一性的部分的任何保守取代，与给定的列出的序列(由seqidno.指代)中的残基相同的候选序列中的氨基酸残基的百分比。序列同一性优选在各自序列的整个长度上计算。
在比对的序列具有不同长度的情况下，可以在较长给定序列的整个长度上确定较短比较序列的序列同一性，或者在比较序列长于给定序列的情况下，可以在较短给定序列的整个长度上确定比较序列的序列同一性。
例如，在给定序列包含100个氨基酸且候选序列包含10个氨基酸的情况下，候选序列仅可以与给定序列的全长具有10％的最大同一性。这在以下实例中进一步说明：
(a)
给定序列：xxxxxxxxxxxxxxx(15个氨基酸)
比较序列：xxxxxyyyyyyy(12个氨基酸)
给定序列可以例如是编码pinlip的序列，如图1所示。
序列同一性％＝比对后相同匹配的氨基酸残基的数量除以较长给定序列中氨基酸残基的总数，即(5除以15)×100＝33.3％
在比较序列长于给定序列的情况下，序列同一性可以在给定序列的整个长度上确定。例如：
(b)
给定序列：xxxxxxxxxx(10个氨基酸)
比较序列：xxxxxyyyyyyzzyzzzzzz(20个氨基酸)
再次地，给定序列可以例如是编码pinlip的序列，如图1所示。
序列同一性％＝比对后相同氨基酸的数量除以给定序列中氨基酸残基的总数，即(5除以10)×100＝50％。
为了确定百分比氨基酸序列同一性，比对可以以本领域技术人员已知的各种方式实现，例如使用公众可获得的计算机软件如clustalw1.82.t-coffee或megalign(dnastar)软件。当使用这样的软件时，优选使用默认参数，例如对于空位罚分和延伸罚分。clustalw1.82的默认参数是：蛋白质空位开放罚分＝10.0，蛋白质空位延伸罚分＝0.2，蛋白质矩阵＝gonnet，蛋白质/dnaendgap＝-1，蛋白质/dnagapdist＝4。
可以以相似的方式确定核酸序列的同一性，包括比对序列并在必要时引入空位，以获得最大序列同一性，并在各自序列的整个长度上计算序列同一性。在比对的序列具有不同长度的情况下，序列同一性可以如上所述确定，并在实例(a)和(b)中说明。
嗜冷酶
如本文所用，术语“嗜冷酶”是指在0℃-25℃的温度下有效的酶。
如本文所用，术语“有效的”是指酶具有实现去污或催化能力的能力(在给定的温度区域内)。优选地，根据缓解单位或缓解指数测量去污。有效的去污优选由等于或大于2缓解单位的缓解表示。
在一些情况下，嗜冷酶在0℃-20℃的温度下有效，例如在0℃-15℃的温度下。在一些情况下，嗜冷酶在0℃-10℃的温度下有效。
优选嗜冷酶包括例如脂肪酶和/或磷脂酶。
脂肪酶是非常有利的嗜冷酶，因为脂肪和油基污渍更难以在嗜冷温度下去除。出于十分相同的原因，磷脂酶是有利的嗜冷酶。
嗜冷脂肪酶包括来自以下的脂肪酶：不动杆菌(acinetobactersp.)菌株no.6(suzuki等(2001)j.biosci.bioeng.92：144-148)；不动杆菌菌株no.o16(brueuil和kushner(1975)can.j.microbiol.21：423-433)；解脂无色杆菌(achromobacterlipolyticum)(khan等(1967)biochem.biophys.acta.132：68-77，1967)，气单胞菌(aeromonassp.)菌株no.lpb4(lee等(2003)j.microbiol.41：22-27)，嗜水气单胞菌(pemberton等(1997)femsmicrobiol.lett.152：1-10)；球形芽孢杆菌mtcc7526(joseph，phdthesis(2006)allahabadagriculturalinstitute，allahabad，in)；叶球形微杆菌(microbacteriumphyllosphaerae)mtcc7530，莫拉克斯氏菌(moraxellasp.)(feller等(1990)femsmicrobiol.lett.66：239-244；莫拉克斯氏菌ta144(feller等(1991)gene.102：111-115)；解脂发光杆菌(photobacteriumlipolyticum)m37(ryu等(2006)appl.microbiol.biotechnol.70：321-326)，假交替单胞菌(pseudoalteromonassp.)wp27(zeng等(2004)j.microbiol.biotechnol.14：952-958)；假交替单胞菌(giudice等(2006)j.appliedmicrobiology101:1039-1048)，嗜冷杆菌(psychrobactersp.)和弧菌(vibriosp.)；嗜冷杆菌wp37(zeng等(2004)j.microbiol.biotechnol.14：952-958)；psychrobacterokhotskensissp.(yumoto等(2003)int.j.syst.evol.microbiol.53：1985-1989)；嗜冷杆菌ant300(kulakovaa等(2004)biochemica.biophysica.acta.1696：59-65)；静止嗜冷杆菌(psychrobacterimmobilis)菌株b10(arpigny等(1997)j.mol.catal.benzy.3：29-35.)，psychromonasingrahamii(gosink等(1993)femsmicrobiolecol102，85-90)；粘质沙雷氏菌(serratiamarcescens)(abdou(2003)j.dairysci.86：127-132)，金黄色葡萄球菌(alford和pierce(1961)j.foodsci.26：518-524)和表皮葡萄球菌(joseph等(2006)j.gen.appl.microbiol.52：315-320)。出于所有目的，每篇文献通过引用全文并入本文，但特别是嗜冷酶的身份、结构、反应性和获得所述酶的方法的公开内容。
优选地，嗜冷脂肪酶是来自psychromonasingrahamii的第3类脂肪酶(称为pinlip)。
嗜温脂肪酶
示例性嗜温脂肪酶包括来自腐质霉(同义词嗜热真菌)，例如来自h.lanuginosa(t.lanuginosus)或来自h.insolens的脂肪酶；假单胞菌脂肪酶，例如来自产碱假单胞菌或假产碱假单胞菌、洋葱假单胞菌、施氏假单胞菌、荧光假单胞菌、假单胞菌菌株sd705(wo95/06720和wo96/27002)、p.wisconsinensis；芽孢杆菌脂肪酶，例如来自枯草芽孢杆菌(dartois等(1993)，biochemicaetbiophysicaacta，1131，253-360)、嗜热脂肪芽孢杆菌(jp64/744992)或短小芽孢杆菌(wo91/16422)。出于所有目的，每篇文献通过引用全文并入本文，但特别是酶的身份、结构、反应性和获得所述酶的方法的公开内容。
可商购嗜温脂肪酶包括lipolasetm和lipolaseultratm、lipextm(novozymesa/s)。
示例性嗜温磷脂酶(ec3.1.1.4和/或ec3.1.1.32)包括水解磷脂的酶。包括水解一个脂肪酰基(分别在sn-1和sn-2位置)以形成溶血磷脂的磷脂酶a1和a2和可以水解溶血磷脂中的其余脂肪酰基的溶血磷脂酶(或磷脂酶b)，也包括分别释放二酰基甘油或磷脂酸的磷脂酶c和磷脂酶d(磷酸二酯酶)。
本文中使用的与本发明的酶相关的术语“磷脂酶a”旨在覆盖具有磷脂酶a1和/或磷脂酶a2活性的酶。磷脂酶活性可以由同样具有其它活性的酶提供，例如具有磷脂酶活性的脂肪酶。
嗜温磷脂酶可以具有任何来源，例如具有动物来源(例如哺乳动物)，例如来自胰腺(例如牛或猪胰腺)或蛇毒或蜂毒。优选地，磷脂酶可以具有微生物来源，例如来自丝状真菌、酵母或细菌，例如曲霉属或种，例如黑曲霉；盘基网柄菌，例如d.discoideum；毛霉，例如爪哇毛霉、高大毛霉、m.subtilissimus；脉孢菌，例如粗糙脉孢菌；根毛霉，例如微小根毛霉；根霉，例如少根根霉，日本根霉，匍枝根霉；核盘菌，例如白腐核盘菌(s.libertiana)；毛癣菌，例如红色毛癣菌；whetzelinia，例如w.sclerotiorum；芽孢杆菌，例如巨大芽胞杆菌，枯草芽孢杆菌；柠檬酸杆菌，例如弗氏柠檬酸杆菌；肠杆菌，例如产气肠杆菌，阴沟肠杆菌；爱德华菌，迟钝爱德华菌；欧文氏菌，例如草生欧文氏菌；埃希氏菌，例如大肠杆菌；克雷伯氏菌，例如肺炎克雷伯氏菌；变形杆菌，例如普通变形杆菌；普罗威登斯菌，例如斯氏普罗威登斯菌；沙门氏菌，例如鼠伤寒沙门氏菌；沙雷氏菌，例如s.liquefasciens，粘质沙雷氏菌；志贺氏菌，例如弗氏志贺氏菌；链霉菌，例如s.violeceoruber；耶尔森氏菌，例如小肠结肠炎耶尔森氏菌。因此，磷脂酶可以是真菌的，例如来自核菌亚纲，例如镰刀菌属，例如黄色镰刀菌、异孢镰刀菌、腐皮镰刀菌的菌株，或尖孢镰刀菌的菌株。磷脂酶也可以来自曲霉属中的丝状真菌菌株，例如泡盛曲霉，臭曲霉，日本曲霉，黑曲霉或米曲霉的菌株。
优选的嗜温磷脂酶源自腐质霉的菌株，特别是humicolalanuginosa或变体；和源自镰刀菌的菌株，特别是尖孢镰刀菌。磷脂酶可以源自尖孢镰刀菌dsm2672。
优选地，嗜温磷脂酶包括磷脂酶a1(ec.3.1.1.32)或磷脂酶a2(ec.3.1.1.4)。
商业嗜温磷脂酶的实例包括lecitasetm和lecitasetmultra、yielsmax或lipopanf(可得自novozymesa/s，denmark)。
其他酶
有利地、替代地或者另外地，嗜冷酶可以包括酯酶(酯水解酶)，例如羧酸酯水解酶。例如，酶可以包括糖基水解酶(糖基化酶)，例如纤维素酶、淀粉酶(包括α淀粉酶)、木聚糖酶等
嗜冷酯酶优选包括由jeon等，marbiotechnol(2009)11：307-316描述的酯酶estat1和estat11，其出于所有目的通过引用全文并入本文，但特别是酶的身份、结构、反应性和获得所述酶的方法的公开内容。
嗜冷糖基水解酶优选包括糖苷酶，例如淀粉酶，例如α淀粉酶，其来自pseudoalteromonashaloplanktis菌株tac125和来自alteromonashaloplanktisa23(feller等(1998)journalbiologicalchemistryvol273，no.20pp12109-12115)和来自拟诺卡氏菌7326；纤维素酶和木聚糖酶，其来自例如梭菌pxyl1(g.akila，t.s.chandra(2003)femsmicrobiol.letters219，63-67)。嗜冷木聚糖酶包括大肠杆菌噬菌粒(lee等，2006b)。出于所有目的，每篇文献通过引用全文并入本文，但特别是酶的身份、结构、反应性和获得所述酶的方法的公开内容。
示例性嗜冷蛋白酶包括源自flavobacteriumbalustinump104(分离自鲑鱼的内部器官，并已于1995年2月17日保藏在nationalinstituteofbioscienceandhuman-technology,agencyofindustrialscienceandtechnology，保藏号为fermbp-5006，并在wo/1996/025489中描述)和源自球形节杆菌s155(poitier等(1995)j.gen.microbiol.133：2797-2806)的那些。出于所有目的，每篇文献通过引用全文并入本文，但特别是酶的身份、结构、反应性和获得所述酶的方法的公开内容。
嗜冷裂解酶优选包括果胶酸裂合酶，例如来自pseudoalteromonashaloplanktis菌株ant/505(truong等(2001)extremophiles5：35-44)。
优选地，一种或多种嗜温酶包含蛋白酶和/或糖苷酶和/或果胶酸裂解酶。
嗜温蛋白酶包括丝氨酸蛋白酶或金属蛋白酶，优选碱性微生物蛋白酶或胰蛋白酶样蛋白酶。碱性蛋白酶包括枯草杆菌蛋白酶，特别是源自芽孢杆菌的那些，例如枯草杆菌蛋白酶novo，枯草杆菌蛋白酶carlsberg，枯草杆菌蛋白酶309，枯草杆菌蛋白酶147和枯草杆菌蛋白酶168。蛋白酶可以是胰蛋白酶样(即能够在赖氨酸或精氨酸的c-末端侧切割肽键)。这样的蛋白酶可以是猪或牛来源的。也包括镰刀菌来源的胰蛋白酶蛋白酶。
可商购蛋白酶包括alcalasetm、savinasetm、primasetm、duralasetm、dyrazymtm、esperasetm、everlasetm、polarzymetm和kannasetm(novozymesa/s)、maxatasetm、maxacaltm、maxapemtm、properasetm、purafecttm、purafectoxptm、fn2tm和fn3tm(genencorinternationalinc.)。
示例性嗜温角质酶(ec3.1.1.74)源自曲霉的菌株，特别是米曲霉；链格孢的菌株，特别是alternariabrassiciola；镰刀菌的菌株，特别是腐皮镰刀菌、豌豆腐皮镰刀菌(fusariumsolanipisi)、大刀粉红镰刀菌或fusariumroseumsambucium；长蠕孢的菌株，特别是helminthosporumsativum；腐质霉的菌株，特别是特异腐质霉；假单胞菌的菌株，特别是门多萨假单胞菌或恶臭假单胞菌；丝核菌的菌株，特别是立枯丝核菌；链霉菌的菌株，特别是疥疮病链霉菌；或细基格孢的菌株，特别是群生细基格孢(ulocladiumconsortiale)。最优选地，角质酶源自特异腐质霉的菌株，特别是特异腐质霉dsm1800菌株。
商业角质酶包括novozymtm51032(可得自novozymesa/s，denmark)。
包括示例性嗜温淀粉酶(α和/或β)，例如从芽孢杆菌，例如从地衣芽孢杆菌ncib8059、atcc6634、atcc6598、atcc11945、atcc8480、atcc9945a的菌株或芽孢杆菌菌株dsm12649(aa560α-淀粉酶)或芽孢杆菌dsm12648(aa349α-淀粉酶)获得的α淀粉酶。
可商购嗜温淀粉酶是duramyltm、termamyltm、termamylultratm、natalasetm、stainzymetm、fungamyltm和bantm(novozymesa/s)、rapidasetm和purastartm(来自genencorinternationalinc.)。
示例性嗜温纤维素酶包括来自芽孢杆菌属、假单胞菌属、腐质霉属、镰刀菌属、梭孢壳属、枝顶孢属的纤维素酶，例如由特异腐质霉、土生梭孢壳、嗜热毁丝霉和尖孢镰刀菌产生的真菌纤维素酶。
特别优选的嗜温纤维素酶是具有颜色护理益处的碱性或中性纤维素酶。可商购纤维素酶包括celluzymetm、carezymetm、endolasetm、renozymetm(novozymesa/s)、clazinasetm和puradaxhatm(genencorinternationalinc.)和kac-500(b)tm(kaocorporation)。
示例性嗜温果胶酸裂解酶包括源自/克隆自以下细菌属的果胶酸裂解酶：如欧文氏菌，假单胞菌，克雷伯氏菌和黄单胞菌，以及来自以下的果胶酸裂解酶：枯草芽孢杆菌(nasser等(1993)febsletts.335：319-326)和芽孢杆菌ya-14(kim等(1994)biosci.biotech.biochem.58：947-949)；短小芽孢杆菌(dave和vaughn(1971)j.bacteriol.108：166-174)，多粘芽孢杆菌(nagel和vaughn(1961)arch.biochem.biophys.93：344-352)，嗜热脂肪芽孢杆菌(karbassi和vaughn(1980)can.j.microbiol.26：377-384)，芽孢杆菌(hasegawa和nagel(1966)j.foodsci.31：838-845)和芽孢杆菌rk9(kelly和fogarty(1978)can.j.microbiol.24：1164-1172)。出于所有目的，每篇文献通过引用全文并入本文，但特别是酶的身份、结构、反应性和获得所述酶的方法的公开内容。可以使用二价阳离子非依赖性和/或热稳定性果胶酸裂合酶。
可商购碱性嗜温果胶酸裂解酶的实例包括来自丹麦novozymesa/s的biopreptm和scourzymetml。
示例性嗜温甘露聚糖酶(ec3.2.1.78)包括源自丝状真菌曲霉属的菌株，优选黑曲霉或棘孢曲霉或里氏木霉，或源自产生β-甘露聚糖酶和β-甘露糖苷酶的芽孢杆菌微生物fermp-8856，或源自嗜碱性芽孢杆菌am-001，或源自解淀粉芽孢杆菌。甘露聚糖酶可以包括源自bacillusagaradhaerens、地衣芽孢杆菌、耐盐芽孢杆菌(bacillushalodurans)、克劳氏芽孢杆菌、芽孢杆菌和特异腐质霉的碱性家族5和26甘露聚糖酶。
可商购甘露聚糖酶的实例包括可从丹麦novozymesa/s获得的mannawaytm。
示例性嗜温过氧化物酶/氧化酶包括来自鬼伞属，例如来自灰盖鬼伞及其变体的过氧化物酶。可商购过氧化物酶包括guardzymetm和novozymtm51004(novozymesa/s)。
嗜热酶
嗜热蛋白酶包括源自嗜热芽孢杆菌菌株hs08(africanjournalofbiotechnologyvol.5(24)，第2433-2438页，2006年12月18日)和嗜热脂肪芽孢杆菌1503；thermoscaldophilusgk24；t.aquaticust351；t.aquaticusyt1aq.i和aq.ii的蛋白酶。
嗜热脂肪酶包括源自bacillusthermocatenulatusbtl1和优选btl2的那些(schimdt-dannert等，biochim.biophys.acta(1994)1214，第43-5页，和biochim.biophys.acta(1996)1301，第105-114页)。嗜热糖基水解酶包括来自嗜热脂肪芽孢杆菌donk，菌株bs-1(journalbiochemistry，vol67，1：65-75)和来自芽孢杆菌ant-6(processbiochemistry(may2003)vol38，10：1397-1403)的α淀粉酶。嗜热裂解酶包括来自thermoanaerobacteritalicussp.nov.菌株ab9(kozianowski等(1997)extremophilesvol1，4：171-182)的果胶酸裂解酶。出于所有目的，每篇文献通过引用全文并入本文，但特别是酶的身份、结构、反应性和获得所述酶的方法的公开内容。
一旦根据本发明选择每种合适的酶，相对容易的是技术人员分离能够产生酶的合适的微生物并且在例如粉末或液体组合物中和/或在某些洗涤条件下等进行本领域已知用于制备具有所需稳定性/性能的酶的优化程序。
表面活性剂
组合物优选包含表面活性剂。
优选组合物包含去污表面活性剂。去污表面活性剂是指表面活性剂，或任何表面活性剂混合物的至少一种表面活性剂，作为洗衣过程的部分，对处理的纺织织物提供去污效果，即清洁效果。其他表面活性剂(其可以是或不是去污表面活性剂)可以用作组合物的部分。
表面活性剂可以是合成表面活性剂，或微生物地合成的生物表面活性剂，例如来自细菌、真菌或其他微生物。
生物表面活性剂优选包括微生物来源的生物表面活性剂。优选地，其包含糖脂生物表面活性剂，其可以是鼠李糖脂或槐糖脂或海藻糖脂或甘露糖赤藓糖醇脂(mel)。或者，生物表面活性剂可以有利地包括纤维二糖，肽基生物表面活性剂、脂蛋白和脂肽(例如表面活性肽)、脂肪酸(例如corynomucolic酸(优选地具有c12-c14烃链))、磷脂(例如由在正烷烃上生长的红串红球菌产生的磷脂酰乙醇胺，导致水和十六烷之间的界面张力降低至小于1mnm-1且cmc为30mgl-1(kretschner等，1982))和刺孢青霉酸(spiculisporicacid)；聚合物生物表面活性剂(包括emulsan、liposan、甘露糖蛋白和多糖-蛋白质复合物)。优选生物表面活性剂包含鼠李糖脂。
表面活性剂以3至85重量％，优选3至60重量％，更优选3至40重量％，最优选3至35重量％的水平按重量计存在于洗衣洗涤剂组合物中。另外的表面活性剂也可以掺入本发明的洗衣组合物中；这些可以是去污或非去污表面活性剂。
优选表面活性剂包含阴离子表面活性剂、非离子表面活性剂或两者的混合物。更优选表面活性剂混合物包含阴离子和非离子表面活性剂。阳离子表面活性剂可以任选地作为表面活性剂的部分存在。
如果存在的话，基于存在的表面活性剂的总重量，阴离子表面活性剂以0.1至95重量％，优选1至50重量％，更优选1.5至25重量％的水平存在。基于存在的表面活性剂的总重量，非离子表面活性剂如果存在的话以0.1至95重量％，优选1至50重量％，更优选1.5至25重量％的水平掺入。如果使用掺入阴离子和非离子表面活性剂两者的表面活性剂混合物，则优选阴离子表面活性剂与非离子表面活性剂的比率为10:1至1:10。
非离子表面活性剂
出于本公开的目的，除非另有说明，“非离子表面活性剂”被定义为分子量小于约10,000的两亲分子，其基本上不含在6-11的正常洗涤ph下表现出净电荷的任何官能团。
可以使用任何类型的非离子表面活性剂。非常优选的是具有c8-c35，优选c8-c30，更优选c10-c24，尤其是c10-c18碳原子的烷基链，并且具有优选3至25，更优选5至15个亚乙基氧基基团的脂肪酸烷氧基化物，尤其是乙氧基化物，例如来自shell(荷兰海牙)的neodols；可具有例如1,000至30,000分子量的环氧乙烷/环氧丙烷嵌段聚合物，来自basf(ludwigshafen，德国)的pluronic(商标)；和烷基酚乙氧基化物，例如可获自dowchemical(midland，mich.，usa)的tritonx-100。
在本发明范围内考虑的其它非离子表面活性剂包括烷醇胺与脂肪酸的缩合物，例如椰油酰胺dea，多元醇-脂肪酸酯，例如可获自uniqema(gouda，荷兰)的span系列，乙氧基化多元醇-脂肪酸酯，例如可获自uniqema(gouda，荷兰)的tween系列，烷基多葡糖苷，例如可获自cognis(düsseldorf，德国)的apg类，和正烷基吡咯烷酮，例如isp(wayne，n.j.，usa)销售的surfadone系列产品。
阴离子表面活性剂
“阴离子表面活性剂”在本文中被定义为包含当在6至11之间的正常洗涤ph下的水溶液中时表现出净阴离子电荷的一个或多个官能团的两亲分子。
优选的阴离子表面活性剂是在其分子结构中具有含有约6至24个碳原子的烷基基团和选自磺酸酯基团和硫酸酯基团的基团的有机硫反应产物的碱金属盐。
尽管可以使用下文所述的任何阴离子表面活性剂，例如烷基醚硫酸盐、皂、脂肪酸酯磺酸盐、烷基苯磺酸盐、磺基琥珀酸酯、伯烷基硫酸盐、烯烃磺酸盐、石蜡烃磺酸盐和有机磷酸盐；优选的阴离子表面活性剂是以下的碱金属盐和碱土金属盐：脂肪酸羧酸，脂肪醇硫酸，优选伯烷基硫酸，更优选它们是乙氧基化的，例如烷基醚硫酸；和烷基苯磺酸或其混合物。
阳离子、两性表面活性剂和/或两性离子表面活性剂
在根据本发明的组合物中也可以存在阳离子、两性表面活性剂和/或两性离子表面活性剂。
优选的阳离子表面活性剂是通式r1r2r3r4n+x-的季铵盐，例如其中r1是c12-c14烷基，r2和r3是甲基，r4是2-羟乙基，且x-是氯离子。这种材料可以以40重量％水溶液的形式，作为praepagen(商标)hy商购自clariantgmbh。
在优选实施方式中，根据本发明的组合物包含两性或两性离子表面活性剂。两性表面活性剂是含有酸性基团和碱性基团两者，并且将在6至11之间的正常洗涤ph下作为两性离子存在的分子。优选两性或两性离子表面活性剂以0.1至20重量％，更优选0.25至15重量％，甚至更优选0.5至10重量％的水平存在。
合适的两性离子表面活性剂被示例为可以被宽泛地描述为具有含有约8至约18个碳原子的一个长链基团和选自硫酸根、磺酸根、羧酸根、磷酸根或膦酸根的至少一个水溶性基团的脂族季铵、锍和鏻化合物的衍生物的那些。这些化合物的通式是：
r1(r2)xy+r3z-
其中r1含有具有8至18个碳原子的烷基、烯基或羟烷基，0至10个亚乙基氧基基团或0至2个甘油基单元；y是氮、硫或磷原子；r2是具有1至3个碳原子的烷基或羟烷基；当y是硫原子时x是1，和当y是氮或磷原子时x是2；r3是具有1至5个碳原子的烷基或羟烷基，和z是选自硫酸根、磺酸根、羧酸根、磷酸根或膦酸根的基团。
优选的两性表面活性剂是氧化胺，例如椰油二甲基氧化胺。优选的两性离子表面活性剂是甜菜碱，特别是酰氨基甜菜碱。优选的甜菜碱是c8至c18烷基酰氨基烷基甜菜碱，例如椰油酰氨基甜菜碱。这些可以作为助表面活性剂被包含，优选基于总组合物的重量以0至10重量％，更优选1至5重量％的量存在。
用于掺入根据本发明的组合物中的优选的两性或两性离子表面活性剂是甜菜碱表面活性剂。下面的列表中提到了这些的实例。
硫酸基甜菜碱，如3-(十二烷基二甲基铵)-1-丙烷硫酸盐；和2-(椰油二甲基铵)-1-乙烷硫酸盐。
磺基甜菜碱，如：3-(十二烷基二甲基铵)-2-羟基-1-丙烷磺酸盐；3-(十四烷基二甲基铵)-1-丙烷磺酸盐；3-(c12-c14烷基酰氨基丙基二甲基铵)-2-羟基-1-丙烷磺酸盐；和3-(椰油二甲基铵)-1-丙烷磺酸盐。
羧基甜菜碱，如(十二烷基二甲基铵)乙酸盐(也称为月桂基甜菜碱)；(十四烷基二甲基铵)乙酸盐(也称为肉豆蔻基甜菜碱)；(椰油二甲基铵)乙酸盐(也称为椰子甜菜碱)；(油基二甲基铵)乙酸盐(也称为油基甜菜碱)；(十二烷基氧基甲基二甲基铵)乙酸盐；和(椰油酰氨基丙基二甲基铵)乙酸盐(也称为椰油酰氨基丙基甜菜碱或capb)。
锍甜菜碱，如：(十二烷基二甲基锍)乙酸盐；和3-(椰油二甲基锍)-1-丙烷磺酸盐。
鏻甜菜碱，如4-(三甲基鏻)-1-十六烷磺酸盐；3-(十二烷基二甲基鏻)-1-丙烷磺酸盐；和2-(十二烷基二甲基鏻)-1-乙烷硫酸盐。
根据本发明的组合物优选包含作为两性或两性离子表面活性剂的羧基甜菜碱或磺基甜菜碱，或其混合物。特别优选的是月桂基甜菜碱。
处理组合物可以包含洗涤剂液体中常见的其它成分。特别是聚酯直接(substantive)污垢释放聚合物、助水溶物、遮光剂、着色剂、香料、其他酶、其他表面活性剂，成分例如香料或护理添加剂的微囊、软化剂、用于抗污垢再沉积的聚合物、漂白剂、漂白活化剂和漂白催化剂、抗氧化剂、ph控制剂和缓冲剂、增稠剂、用于流变学改性的外部结构化剂、其中嵌入或不嵌入功能成分的视觉提示物，以及本领域技术人员已知的其它成分。
组合物
组合物是洗衣组合物。因此，合适地，其包含一种或多种表面活性剂和/或任选的其它成分。
本发明的这样的组合物可以是干燥固体形式，例如，粉末状、颗粒状或片状粉末，或者液体或凝胶形式。它也可以是固体洗涤剂条的形式。组合物可以是在使用前在溶剂(包括水)中稀释、再水合和/或溶解的浓缩物。组合物也可以是即用型(使用中)组合物。
在一些情况下，组合物是液体制剂。
本发明适用于工业或家用织物洗涤组合物、织物调理组合物和用于洗涤和调理织物两者的组合物(所谓的洗涤调理剂组合物)。本发明也可以应用于工业或家用非洗涤剂基织物护理组合物，例如直接应用，例如，滚涂或喷涂组合物，其可用作例如在“主”洗之前的织物的局部部分的预处理。
酶可以以组合物的0-5重量％，优选2-4重量％，并且最优选2.5-3.5重量％存在(其中重量％是指组合物的总重量的百分比)。
洗液中的总蛋白质浓度(根据本发明的酶的总范围的总蛋白质浓度)可以为0.01至10.0mg/l，例如2至5mg/l。
生物表面活性剂
优选地，组合物包含生物表面活性剂。生物表面活性剂优选地包含微生物来源的生物表面活性剂。优选地，其包含糖脂生物表面活性剂部分，所述糖脂生物表面活性剂部分可以是鼠李糖脂或槐糖脂或海藻糖脂或甘露糖赤藓糖醇脂(mel)或其组合。
替代性地或另外地，生物表面活性剂可以包括任何剪切稀化生物表面活性剂，并且在这方面可以延伸至包括任何剪切稀化的上述糖脂生物表面活性剂，或者任何剪切稀化的纤维二糖、肽基生物表面活性剂、脂蛋白、脂肽(例如表面活性肽)、脂肪酸(例如corynomucolic酸(优选地具有烃链c12-c14))、磷脂(例如由在正烷烃上生长的红串红球菌产生的磷脂酰乙醇胺，导致水和十六烷之间的界面张力降低至小于1mnm-1且cmc为30mgl-1(kretschner等,1982))、刺孢青霉酸、聚合物生物表面活性剂(包括emulsan、liposan、甘露糖蛋白或多糖-蛋白质复合物)或其组合。
生物表面活性剂部分可以包含一个或多个糖部分，例如糖环。
在一些情况下，生物表面活性剂是甘露糖赤藓糖醇脂(mel)：
mel-a：r1＝r2＝ac；mel-b：r1＝ac，r2＝h；mel-c：r1＝h；r2＝ac：n＝6-10。
在一些情况下，生物表面活性剂是mel-b。
在一些情况下，生物表面活性剂部分包含鼠李糖脂。
在鼠李糖脂的情况下，鼠李糖脂可以包含一个或两个糖环：单鼠李糖脂具有单一鼠李糖糖环，而二鼠李糖脂具有两个鼠李糖糖环。
在鼠李糖脂的情况下，在整个本专利说明书中，前缀单-和二-分别用于表示单鼠李糖脂(具有单一鼠李糖糖环)和二鼠李糖脂(具有两个鼠李糖糖环)。如果使用缩写，r1是单鼠李糖脂并且r2是二鼠李糖脂。
酶与生物表面活性剂表面活性剂的比率可以例如为1:0.5至1:20，优选1:0.5至1:10，例如1:0.5至1:5。
生物表面活性剂可用于替代组合物中总表面活性剂的至少50重量％。在一些情况下，所述的生物表面活性剂是唯一存在的生物表面活性剂。
优选地生物表面活性剂以总表面活性剂的20-90重量％的水平存在，更优选地生物表面活性剂以总表面活性剂的50-80重量％，且更优选地总表面活性剂的50-75重量％存在。
其他成分
酶可以是唯一的织物处理剂，或可以掺入其他去污剂。
可以包含其它洗涤剂成分，包括表面活性剂、助洗剂、螯合剂、助水溶物、防腐剂、络合剂、聚合物、稳定剂、香料、光学增白剂或其它成分，例如，织物调理剂，包括粘土、泡沫促进剂、抑泡剂(消泡剂)、防腐蚀剂、污垢悬浮剂、抗污垢再沉积剂、抗微生物剂、污点抑制剂或其一种或多种的组合，条件是这些成分与酶相容。
织物洗涤组合物可以包含选自生物表面活性剂、非皂阴离子表面活性剂、非离子表面活性剂、皂、两性表面活性剂、两性离子表面活性剂及其混合物的织物洗涤洗涤剂材料。
应理解，组合物可以包含生物表面活性剂和非生物表面活性剂两者(换句话说，出于方便而称为非生物表面活性剂的织物洗涤洗涤剂材料，和生物表面活性剂)。组合物可以包含生物表面活性剂，但不是非生物表面活性剂。组合物可以包含非生物表面活性剂，但不是生物表面活性剂。
存在于组合物中的任何酶可以使用常规稳定剂例如多元醇如丙二醇或甘油，糖或糖醇，乳酸，硼酸，或硼酸衍生物例如芳族硼酸酯，或苯基硼酸衍生物如4-甲酰基苯基硼酸而稳定化。
以下实施例是作为说明而非作为限制提供。
试验
(i)psychromonasingrahamii脂肪酶
克隆和表达，包括序列信息
使用blastp识别来自p.ingrahamii基因的推定的第3类脂肪酶(pinlip)。在pdb中针对结构特征化的蛋白质检索pinlip蛋白质序列，并显示其与来自米黑根毛霉(rhizomucormiehei)(mucormieheipdb：5tgl)的lipex和lipex(1tib)具有最高的同源性，与这两者的序列同一性为14％。pinlip与lipex的蛋白质序列比对允许在催化三联体(triad)中识别ser和asp(图1-丝氨酸和天冬氨酸在序列比对中是保守的，并被识别，通过下划线显示)，但三联体中的第三残基不可以被识别，因为在脂肪酶的c端区域具有非常低的序列同一性。序列比对也允许识别pinlip脂肪酶盖子区，也已被识别(图1)。
pinlip被基因编码到plate31载体中并在大肠杆菌bl21细胞中成功表达。已经测试不同表达条件。示例性方案如下：接种补充有100μg/ml氨苄青霉素的1llb培养基并在37℃下伴随180rpm振荡温育4小时。当od达到0.6时，通过加入1.0mmiptg，诱导蛋白质产生。将培养物在22℃下伴随180rpm振荡进一步温育24小时。此后，通过在4℃以5000g离心30分钟收获细胞。将细胞沉淀重悬于含有1mmcacl2的50mmtris-hclph9.5中，并通过在4℃以5000g离心30分钟收获细胞。将细胞沉淀物储存在-20℃直至使用。
发酵(收获)和纯化
使用5ml/g细胞将收获的细胞重悬于含有1mmcacl2和1mnacl的50mmtris-hclph9.5(缓冲液a)中。[选择9.5的ph是基于pinlip(pi＝7.21)的理论等电点(pi)低于该ph值，因此在该ph值下蛋白质具有净负电荷。]溶菌酶以0.1mg/ml的终浓度添加到细胞悬浮液中，并将悬浮液在4℃下搅拌1小时。然后使用十次爆发对悬浮液进行超声处理，每次20秒，在爆发之间在冰上搁置一分钟。然后将裂解物在4℃下以24000rpm离心1小时并收集上清液。
通过疏水相互作用(hic)纯化
将上清液加载到丁基ff柱(1ml大小)上。该柱预先用5体积的缓冲液a平衡，并用在缓冲液a和含有1mmcacl2的50mmtris-hclph9.5(缓冲液b)之间的线性梯度洗脱蛋白质。所有洗脱的级分在sds-page凝胶上跑动。合并并浓缩显示最高pinlip含量的级分。将蛋白质加载到预先用5体积的缓冲液b平衡的deaeff柱(1ml大小)上，并用在缓冲液b和缓冲液a之间的线性梯度洗脱蛋白质。合并含有纯pinlip的级分并测定脂肪酶活性。
作为hic和随后的deae的两步纯化程序的替代方法，基于双柱串联亲和设置(针对his标记的pinlip的麦芽糖结合蛋白加上固定化金属离子亲和层析)的一步程序已被成功应用。与双柱纯化产品相比，最终pinlip样品的纯度可以更高(数据未显示)。
生物分析
使用bio-radprotean装置进行sds-page。在用laemli加载缓冲液稀释后，将蛋白质样品最初在100℃煮沸10分钟以使蛋白质变性。然后将样品冷却并加载到10％丙烯酰胺凝胶上。在跑动条件下：120v，400ma，在室温下在跑动缓冲液中进行90分钟分离。通过在按照制造商的方案制备的“考马斯蓝”中染色，显示sds-page凝胶上的蛋白质条带，在室温下进行30分钟脱色以除去过量染料。结果如图2所示。估计的纯化产量为5mg/l。
脂肪酶测定
为了评估活性，进行基于pnp释放的测定(图3)。使用对硝基苯基月桂酸酯(sigma-aldrich)作为底物，在96孔微量滴定板中以一式四份测定脂肪酶。将20μl的pinlip(在孔中的终浓度为25ng/ml)与100μl的含有1mmcacl2的50mmtris-hclph8.5和0.01％的aos加上60μl的水和20μl的1mmpnp月桂酸酯混合。在不同温度下温育15分钟后，相对于无酶对照，测量od410。获得的值已经被用图4所示标准曲线计算为释放的pnp的μm。
结果
图5显示了脂肪酶测定的结果。图5显示pinlip对覆盖不同链长的宽范围的pnp-酯具有活性，而且温度的升高导致对短/中等长度的酯的改善的活性。
终点去污测定
将以下染垢布料样品打孔成圆盘并转移到300μl的96孔板中：
脂肪酶敏感性污渍：cs61-牛肉脂肪污渍和c646b-使用过的油炸脂肪(cftbv)
洗衣酶(novozymes)：
lipex100l(novozymes)
t.lanuginosa脂肪酶(sigma-aldrich)
酶
psychromonasingrahamii脂肪酶(pinlip)
程序：
测试混合物：总洗涤体积＝200μl
可溶性酶pinlip/lipex(在测定孔中为20mg/l)＝20μl
blackbull制剂8g/l储备液(最终在测定孔中为0.8g/l)＝20μl
prenton水＝160μl
在这两种情况下，最后加入酶。两组反应分别在20和40℃下伴随250rpm振荡温育1小时。
测定板干燥过夜。
干燥后，对污渍板进行数字扫描并测量其δe。该值用于表示清洁效果并被定义为洗涤后白色布与染污布之间的色差。在数学上，δe的定义是：
δe＝[(δl)2+(δa)2+(δb)2]1/2
其中δl是洗涤布和白色布之间的暗色的差异的量度；δa和δb分别是两种布料之间的红色和黄色的差异的量度。从这个等式中可以明显看出，δe值越低，布料越白。关于这种颜色测量技术，参考国际照明委员会(cie)；recommendationonuniformcolourspaces,colourdifferenceequations,psychometriccolourterms,supplementno.2tociepublication,no.15,colormetry,bureaucentraldeiacie,paris1978。
结果
在图6中，清洁效果以去污指数(sri)的形式表示：sri＝100-δe。sri越高，布越清洁，sri＝100(白色)。与lipex相比，pinlip在高(～30％)和低总表面活性(～15％)下显示更好的清洁效果。
剂量依赖性洗涤研究
作为进一步研究，已经进行了相同终点洗涤研究，改变酶的浓度以找到最佳剂量(图7)。这些结果显示，在所用的不同酶剂量下，与基准lipex相比，pinlip在清洁方面更优秀，尤其是在20和2.5mg/l之间的范围内。
鼠李糖脂对酶清洁的影响(无制剂)
为了了解鼠李糖脂对酶的清洁效果的影响，在洗涤研究中，在酶的存在和不存在下，在不同浓度水平筛选不同的鼠李糖脂，即r1(单鼠李糖脂)，4r2(二鼠李糖脂)和mel-b(甘露糖赤藓糖醇脂b)，1614mel(多mel组分)。制备70％(活性)鼠李糖脂的储备浓度用于洗涤研究，并使用mili-q水稀释以获得20％至1.25％范围内的工作储备浓度。以与上述部分中提到的类似的方式进行洗涤研究。
测试混合物：总洗涤体积＝200μl
可溶性酶pinlip/lipex(在测定孔中为20mg/l)＝20μl
鼠李糖脂8g/l储备液(最终在测定孔中为0.8g/l)＝20μl
prenton水＝160μl
在这两种情况下，最后加入酶。将测定板在20℃下伴随250rpm振荡温育1小时。
在高于0.05％4r2rl下，4r2rl随着渐增的浓度自行提高其清洁性能，使得来自酶的贡献是最低限度的。在4r2rl中，pinlip和lipex在r2的存在下显示相等的良好清洁性能，在低rl浓度下甚至更好。
在r1rl中，pinlip显示比基准酶lipex更好的协同清洁性能(酶加rl)。参见图8a。
与mellipex组合相比，1614mel和mel-b的存在结合pinlip在整个剂量范围内显示更优异的清洁。参见图8b和8c。
制剂中由rl替代部分洗涤性
为了研究鼠李糖脂在las/sles/ni存在下对脂肪酶的清洁效果的影响，通过在las、sles和ni存在下添加不同浓度水平的鼠李糖脂制备一系列制剂。制备的制剂中las、sles和ni的比率为2:1:3。如上文部分所述进行洗涤研究。
表1：含有不同水平的生物表面活性剂(鼠李糖脂)和给出100％活性表面活性剂体系的化学表面活性剂的制剂。在给定的化学表面活性剂体系中，las、sles和ni的比率为2:1:3。
表2：生物表面活性剂和表面活性剂共混物中各种组分的量。
在使用cs61牛肉脂肪污渍的终点去除测定中以c剂量测试鼠李糖脂(r1-含一个鼠李糖分子，4r2-含两个鼠李糖分子)和脂肪酶。在同一96孔板上平行进行8次重复实验。实验在20℃下进行。扫描平板并计算sri值。结果在图9a中显示为展示重复实验的平均sri的条形图。误差线展示每种情况的重复实验之间的标准偏差。
在r1改性的化学表面活性剂共混物中，在制剂中至多30％的r1含量下，pinlip显示比lipex更好的清洁，(在制剂中的低浓度下的强的正面影响)。
在r2改性的化学表面活性剂共混物中，结果显示在低于20％的r2含量下，pinlip显示比lipex更好的清洁，而在更高r2含量下，lipex和pinlip在清洁方面显示同等性，并且在高于30％下，不比改性制剂更好。结果在图9b中显示为展示重复实验的平均sri的条形图。再一次，误差线展示每种情况的重复实验之间的标准偏差。
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