本发明涉及一种新型抗微生物肽及其用途，更具体地，涉及具有抗微生物效果和调节免疫细胞活性的功能二者的新型肽及其用途。
背景技术：
抗微生物肽可存在于自然界中，也可存在于合成的肽中。与正常蛋白质相比这些抗微生物肽由相对短的氨基酸序列(10-100个氨基酸残基)组成。当这些抗微生物肽主要结合至细胞膜时，1)其在细胞膜上形成离子通道，从而抑制微生物的能量产生，或2)在细胞膜中产生大孔，导致细胞死亡。由于这些抗微生物肽物理上破坏微生物，微生物很难具有对这些抗微生物肽的抗性，不像抑制微生物细胞壁或胞内聚合物合成的传统抗生素，因此迄今尚未报道对这些抗微生物肽的抗性。尽管目前已知的许多抗微生物肽之间几乎不存在序列相似性，但关于其结构和活性显示出存在一些一般趋势。代表性地，抗微生物肽具有带正电的部分，例如赖氨酸、精氨酸和组氨酸，以及疏水部分。当前，在shai-matsuzaki-huang(smh)模型(在提示与抗微生物肽的作用机制相关的假说中，其显示出最有说服力)中，序列的特征和抗微生物肽的机制描述如下：带正电的亲水部分结合细菌的带负电的细胞膜之后，结合至细胞膜的肽的疏水部分与细胞膜的磷脂的疏水部分相互作用，并在细胞膜上形成孔隙以改变细胞膜的通透性，从而破坏细胞。吞噬细胞例如中性粒细胞和单核细胞中表达的甲酰基肽受体组(甲酰基肽受体1(fpr1)和甲酰基肽受体2(fpr2))在宿主对病原体感染的防御中发挥重要作用(mangmool,s.等人,toxins,3:884-899,2011)。已知这些受体结合百日咳毒素敏感的gi蛋白(nakashima,k.等人,j.biol.chem.,290(22):13678-91,2015)。受体之中，已知fpr2在炎症性疾病中发挥重要作用。fpr2的活化诱导gβγ亚基与gαi亚基分离，βγ-亚基诱导磷脂酶cβ或磷酸肌醇3-激酶的活化(duru,e.a.等人,j.surg.res.,195(2):396-405,2015)。这些分子的活化诱导复杂的下游信号传导，从而通过使细胞应答例如趋化性迁移、脱粒和超氧化物产生多样化而调节体内的免疫应答。
发明的公开内容
技术问题
已完成本发明以解决包括上述问题在内的多个问题，因此本发明的一个目标为提供同时具有更有效的抗细菌活性和免疫活性二者的新型肽。
另外，本发明的另一个目标为提供所述肽的各种用途，包括包含肽的抗细菌剂、用于治疗特应性皮炎的药物组合物、用于改善特应性皮肤的化妆品组合物等。
然而，这些目标为了说明目的而提供，其不应限制本发明的范围。
技术方案
根据本发明的另一个方面，提供由seqidno:1的氨基酸序列组成的新型抗细菌和免疫调节肽。
根据本发明的又一个方面，提供包含所述肽作为活性成分的抗细菌剂。
根据本发明的又一个方面，提供用于治疗特应性皮炎的药物组合物，其包含所述肽作为活性成分。
根据本发明的又一个方面，提供用于治疗特应性皮炎的化妆品组合物，其包含所述肽作为活性成分。
有益效果
根据本发明的实施方案的抗细菌肽不仅对各种细菌例如革兰氏阴性细菌和革兰氏阳性菌具有极其高的抗微生物活性，也具有治疗特应性皮炎的效果，因此，可用于多种目的，例如用于改善特应性皮炎的皮肤外用剂或化妆品组合物以及抗生素。
附图简述
图1显示说明肽针对革兰氏阳性细菌(表皮葡萄球菌(staphylococcusepidermidis)和金黄色葡萄球菌(staphylococcusaureus))和革兰氏阴性细菌(铜绿假单胞菌(pseudomonasaeruginosa)和大肠杆菌(escherichiacoli))的抗细菌活性结果的图，根据本发明的实施方案所述肽具有seqidno:1的氨基酸序列，并且其中辛酰基加至n端。
图2显示说明根据本发明的实施方案具有seqidno:1的氨基酸序列的肽的fpr2依赖的增加免疫细胞中胞内钙离子的活性的图，其中图2a显示表示rbl细胞以及fpr2和fpr1分别过表达的rbl细胞中肽的fl比率的图；图2b显示表示在fpr2过表达的rbl细胞中根据seqidno:1肽的浓度而增加钙离子的活性的图。
图3显示说明根据本发明的实施方案，辣椒素所诱导的特应性皮炎模型在肽治疗时的实验程序的示意图。
图4显示结果，证实根据本发明的实施方案，在通过辣椒素诱导的特应性皮炎模型中，肽治疗改善真皮以及真皮中的施用位点的皮炎的效果，其中图4a显示说明在通过辣椒素处理诱导特应性皮炎的大鼠(neo-cap)中改善皮炎的效果的图，图4b显示说明在通过辣椒素处理诱导特应性皮炎的2周龄大鼠(2wcaps)中改善皮炎的效果的图。
图5显示一系列照片图像，其说明根据本发明的实施方案，根据肽(ncp112)治疗后的时间(3-5周)，与对照组的那些相比，新模型动物(neo-cap，a)和2周龄模型动物(2wcap，b)中皮肤状况的结果。
图6显示根据本发明的实施方案，肽(ncp112)治疗后5周，分别在新模型动物(neo-cop，顶部)和2周龄模型动物(2wcap，底部)中，在显微镜下观察到的皮肤组织状况的组织学染色图像(左图)和说明关于表皮厚度的测量结果的图(右图)。
本发明实施方式
术语定义：
如本文所使用的术语定义如下。
如本文所使用的，术语“免疫调节肽”指直接或间接牵涉免疫强化作用例如抗细菌和抗病毒活性、炎症应答、刺激天然杀伤细胞、调节抗体-依赖细胞的细胞毒性等的肽，然而其具有非免疫球蛋白的蛋白形式。换言之，关于由基因解码的蛋白，吞噬细胞例如中性粒细胞和单核细胞中表达的甲酰基肽受体组(甲酰基肽受体1(fpr1)和甲酰基肽受体2(fpr2))在宿主对病原体感染的防御中发挥重要作用。已知受体结合百日咳毒素敏感的gi蛋白。其中，已知fpr2在炎症性疾病中发挥重要作用。fpr1和fpr2的活化诱导gβγ亚基与gαi亚基分离，βγ-亚基诱导磷脂酶cβ或磷酸肌醇3-激酶的活化。这些分子的活化诱导复杂的下游信号传导，从而使细胞应答例如趋化性迁移、脱粒和超氧化物产生多样化。
如本文所使用的，术语“抗微生物肽”指阳离子肽化合物，其一般由相对简单的结构组成，对于革兰氏阳性细菌、革兰氏阴性细菌、真菌、病毒等具有广泛的抗微生物谱。尽管抗微生物肽的机制尚未完全理解，其通常已知为通过破坏微生物的细胞膜的作用机制显示抗细菌活性。
如本文所使用的，术语“特应性皮炎”指婴儿和儿童中最常见的炎症性皮肤疾病，其特征在于严重的瘙痒、红斑、水肿、渗出、疥癣、鳞屑、苔藓样变等。特应性皮炎频繁反复、慢性进展，并且由于反复搔抓皮肤，显示特征性继发损伤例如葡萄创(scratches)、苔藓样变等。
发明详述：
在下文中，将会对本发明详细描述。
根据本发明的一个方面，提供由seqidno:1的氨基酸序列组成的新型抗细菌和免疫调节肽。
所述肽可为其中连接辛酰基(ch3(ch2)6co-，下文缩写为“oct-”)的肽，或可为其中1-6个氨基酸连接到肽的c端的肽。根据本发明的另一个方面，提供包含肽作为活性成分的抗细菌剂。
抗细菌剂可对革兰氏阴性细菌和革兰氏阳性细菌具有抗细菌活性，其中革兰氏阴性细菌可为大肠杆菌、沙门菌属(salmonella)物种、弧菌属(vibrio)物种或铜绿假单胞菌，并且革兰氏阳性细菌可为金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、痤疮丙酸杆菌(propionibacteriumacnes)或变形链霉菌(streptomycesmutans)。
根据本发明的又一个方面，提供用于治疗特应性皮炎的药物组合物，其包含所述肽作为活性成分。
包含肽作为活性成分的药物组合物可包含选自盐水、缓冲盐水、右旋糖、水、甘油和乙醇的至少一种药物稀释剂，但稀释剂不限于此。
药物组合物可有差别地施用，取决于给药目的和疾病。实际给予的活性成分的量必须考虑不同的因素决定，即，待治疗的疾病、患者的状况水平、与不同药物(例如，趋化性药物)组合给药的存在情况、患者的年龄、性别、体重和饮食、组合物的给药持续时间、给药途径和给药速率。尽管组合物的剂量和给药途径可根据疾病的类型和严重性调整，但组合物可每日给予一次，或每日以分开的剂量给予1-3次。
包含本发明的肽或物质的组合物可口服或胃肠外给予。胃肠外给予指通过口服给予之外的途径给予药物，例如直肠、静脉内、腹膜和肌肉、动脉、透皮、鼻、吸入、眼睛和皮下给予。包含肽或物质的药物组合物可配制为任何形式，例如口服剂型、可注射的溶液或局部制剂。配方优选制备为适于口服和可注射给予(真溶液、悬浮液或乳液)，并且最优选地，配方制备为口服剂型，例如片剂、胶囊、软胶囊、水性药剂、丸剂、颗粒等。在配制中，本发明的肽在无赋形剂下装入软胶囊中，与载体混合或稀释以制备为合适的制剂。合适的载体的实例包括淀粉、水、盐水、林格氏溶液、右旋糖等。
根据本发明的又一个方面，提供用于改善特应性皮炎的化妆品组合物，其包含所述肽。
所述化妆品组合物可包含化妆品组合物配方中使用的至少一种添加剂。例如，添加剂可包括1,3-丁二醇、大豆磷脂胆碱、鞘氨醇、胆固醇、吐温80、植物鞘氨醇、水杨酸、皮肤保湿剂(湿润剂)、软化剂、天然油、角蛋白、类脂化合物、可吸收的水溶性物质、角质层神经酰胺、表皮脂质酸膜脂肪酸(epidermallipidacidfilmfattyacid)、胆固醇酯、乙醇、蒸馏水等。
发明方式
下文中，本发明将通过实施例和实验实施例更详细地描述。然而，本发明不限于下文描述的这些实施例和实验实施例，而是可以以多种其它形式实现，并且下列实施例和实验实施例为了使本发明的公开内容完整和向本领域技术人员完全公开本发明的范围而提供。
实施例1：制备抗微生物肽
本发明人通过基本筛选已经筛选由seqidno:1描述的氨基酸序列(kfkwrym)构成的具有抗微生物活性的肽。在肽的氨基酸序列中，每一大写字母指示一个正常的l型氨基酸，小写字母“m”指示d型甲硫氨酸。肽可使用用于氨基酸合成的常规方法制备(umbarger,h.e.,ann.rev.biochem.,47:533-606,1978)。
实施例2：抗微生物肽的修饰
为了进一步改善实施例1中经受基本筛选的肽的抗细菌活性，本发明人通过合成修饰的肽检查了这些肽的抗细菌活性，其中多个脂质元件，例如棕榈酰基、辛酰基等连接到这些肽的n端。结果，证实其中连接辛酰基的修饰的肽具有最高的活性，因此，oct-kfkwrym肽(下文指定为“ncp112”)用在后续实验中。
实施例1：新型肽的抗细菌活性实验
为了进一步改善实施例2中制备的肽的抗细菌活性，进行抗细菌检验。制备革兰氏阳性细菌(表皮葡萄球菌和金黄色葡萄球菌)和革兰氏阴性细菌(铜绿假单胞菌和大肠杆菌)，使用四象限连续划线技术在琼脂平板培养基上划线，并在36℃培养箱中培养过夜。第二天，将琼脂平板培养基上的菌株集落接种至营养肉汤(3ml)中并在摇动的培养箱中在36℃和220rpm培养过夜。第二天，将细菌培养物稀释，测量600nm的吸光度并调整至0.5。然后，以1:100比率将细菌培养物稀释到营养肉汤中。然后，将实施例2中制备的肽分别以0μm、1.25μm、2.5μm、5μm、10μm和20μm的浓度以1ml的量在营养肉汤中连续稀释，将1ml稀释的细菌接种，在摇动的培养箱中在36℃和220rpm培养18小时。然后，在600nm测量吸光度，并分析结果。
结果，如图1中所示，根据本发明的实施方案的肽以浓度依赖性方式显示对所有细菌的抗细菌活性。特别地，肽在10μm的浓度完全抑制4种细菌的生长。在4种细菌中，铜绿假单胞菌显示具有最高的抗细菌效果。
实施例2：通过fprl1分析胞内ca离子
为了检查根据本发明的实施方案的肽是否活化活有机体的体内免疫功能，本发明人观察了钙离子通透性的变化。具体地，本发明人测量胞内钙离子浓度以检查肽是否活化fpr2。为了这个目的，本发明人使用其中不表达fpr2的rbl细胞、其中过表达fpr1的rbl细胞(fpr1-fbl)和其中过表达fpr2的rbl细胞，并使用fura-2/am(对钙具有强结合亲和力的染色物质)，作为用于灵敏测量胞内钙离子释放的方法。即，将细胞在包含10%胎牛血清的rpmi培养基中培养，在对数中期(1-3×107细胞/ml)离心并收集。然后，将细胞用不包含胎牛血清的rpmi培养基洗涤数次，并以1×107细胞/ml的浓度重悬在rpmi培养基中。然后，将fura-2/am以终浓度3μm加入其中并在培养箱(37℃,5%co2)中在连续搅拌下孵育45分钟。经过适当的时间后，将细胞收集并用rpmi培养基再次洗涤数次。然后，将细胞悬浮在适当量的rpmi培养基中，其中补充浓度250μm的磺吡酮以防止进入细胞的fura-2释放到细胞外。每次取大约2×106个细胞并通过快速离心收集，重悬在1ml洛克溶液中，其中加入egta但未加入钙离子，在分光光度计上监测两个波长340nm和380nm处的吸光度比率。用本发明的肽以不同的浓度(1μm、0.1μm和0.01μm)以约1分钟的间隔处理后，检查两个波长340nm和380nm处的吸光度差异，随后根据grynkiewicz的方法将其转换为流入细胞中的钙离子浓度。结果，如图2中所示，当细胞用根据本发明的实施方案的肽处理时，胞内钙离子迅速增加，特别是在fpr2-rbl细胞(a)中，并且根据肽处理，钙离子胞内浓度增加的量显示浓度依赖性特征(b)。这提示根据本发明的实施方案的肽可通过结合fpr2以及其后活化调节受试者的免疫功能。
实验实施例3：在特应性皮炎模型中改善皮炎的效果
3-1：外部变化的分析
因此，为了确认根据本发明的实施方案的肽是否可实际上通过激活体内免疫功能治疗免疫相关的疾病，本发明人在特应性皮炎动物模型上检查了特应性皮炎的症状是否可通过用肽治疗改善。具体地，为了确认肽在辣椒素诱导的特应性皮炎模型中是否具有改善皮炎的效果，本发明人观察了用根据本发明的实施方案的肽(ncp112)治疗特应性动物(neo-cap和2wcap)后特应性诱导的皮肤组织的真皮中、真皮中的施用位点和葡萄创位点的皮肤改善的程度。neo-cap为特应性皮炎的代表性模型，在小于48小时的新生大鼠(spraguedawley大鼠)背部皮肤上皮下注射辣椒素(50mg/kg)以诱导特应性皮炎。2wcap为模拟在青年期或成年发展的特应性皮炎的模型，向2周龄大鼠(spraguedawley)皮下注射辣椒素(25mg/kg)两次以诱导特应性皮炎。
具体的实验程序在图3中显示。在neo-cap模型中，皮炎分数在注射辣椒素后两周测量，对照组(pbs)和ncp112在背部(200μl)和两只耳朵(50μl)处以10μm的浓度每日施用，并且皮炎分数以一周间隔测量，持续三周。皮炎分数在面部、耳朵、背部(总体)和耳朵以及背部(施用位点)根据皮肤状况测量，并将分数通过将第二周(即，起点)的分数设置为1标准化，如图4中所示。参考在下表1中显示。
表1
在2w-cap模型中，皮炎分数在辣椒素注射后1周测量，对照组(pbs)和ncp112在背部(200μl)和两只耳朵(50μl)处以10μm的浓度每日施用，并且皮炎分数以一周间隔以与neo-cap模型中相同的方式测量，持续两周。分数通过将3w(即，起点)的分数设置为1标准化，如图4中所示。
3-2：特应性皮炎的皮肤组织学和厚度评估
将实验实施例3-1中分析的小鼠用根据本发明的实施方案的肽治疗，五周后，将小鼠处死。将通过辣椒素处理诱导皮炎的位点处的皮肤组织以约3cm×3cm的尺寸移除，并将组织在4%低聚甲醛溶液中固定2-3天。将固定的组织再次片段化为1cm×0.5cm的尺寸，加入用于组织的盒中并使用组织处理机(leicamicrosystems,germany)进行脱水、透明和石蜡化，并储存于-20℃。对于组织切片的制备，将石蜡块切成5μm的尺寸，将薄切的组织丝带漂浮在恒温水浴中并压平。将组织切片附着在载玻片上并在加热板上在40℃干燥。为了评估小鼠皮肤组织的病理学评估，将皮肤组织切片分别用二甲苯脱石蜡3次，持续3分钟，浸泡在70%-100%的乙醇中1分钟，最后用蒸馏水洗涤。将皮肤组织切片浸入苏木精溶液中之后，组织细胞的核被染色，用蒸馏水洗涤，然后再次用伊红染色。将染色组织以与脱石蜡过程相反的次序经受70%-100%乙醇和二甲苯，最后向其施加包埋试剂，并通过用盖玻片覆盖封闭。为了在光学显微镜下观察，将染色的组织在200×放大率下拍照，并进行病理学评估。图5显示在诱导特应性皮炎的区域中皮肤组织随时间的状况的图像。图6显示说明在特应性皮炎位点处皮肤组织的组织染色的结果的图，其中用对照组处理的neo-cap和2wcap组二者显示表皮增厚，因此显示特应性皮炎的典型症状，而在用根据本发明的实施方案的肽(ncp112)处理的组中，在neo-cap组中表皮层轻微减少和在2wcap组中显著减少，因此证实接近正常水平的恢复。因此，动物实验结果证实根据本发明的实施方案的肽在neo-cap和2wcap组二者中显示改善特应性皮炎症状的效果，并且特别地，2wcap组中的动物模型显示与正常状况相当的皮肤状况，因此证实肽的有效性。
尽管本发明已经参考上述实施例和实验实施例描述，其在本文中仅为了说明性目的提供，并且本领域技术人员将会理解各种修饰和等价的其它实施例和实验实施例在不脱离本发明的范围下是可能的。因此，本发明的真实范围应由所附权利要求的技术思想确定。
工业适用性
根据本发明的实施方案的抗微生物肽不仅显示对多种细菌例如革兰氏阴性细菌和革兰氏阳性细菌的抗细菌活性，还显示在特应性皮炎的动物模型中改善特应性皮炎症状的显著效果，因此可用作用于改善特应性皮炎的功能化妆品等以及各种抗生素，特别地，用于皮肤外用剂的抗生素的原料。
序列表自由文本
seqidno:1为根据本发明的实施方案的抗微生物肽的氨基酸序列。
<110>诺娃细胞科技公司
<120>新型抗微生物肽及其用途
<130>po18-5170
<150>kr10-2015-0161837
<151>2015-11-18
<160>1
<170>kopatentin3.0
<210>1
<211>7
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>人工抗微生物肽
<220>
<221>变体
<222>(7)
<223>d-甲硫氨酸
<400>1
lysphelystrpargtyrxaa
15