具有抗微生物活性的新型肽和能够将肽中的L-构型残基转变成D-构型氨基酸的新型酶的制作方法

本发明涉及医学，特别是肽的抗微生物活性，并且还涉及酶学。
背景技术：
：抗微生物剂耐药性威胁由细菌、寄生虫、病毒和真菌引起的范围不断增长的感染的有效预防和治疗。它是对全球公共卫生的越来越严重的威胁，需要所有政府部门和社会共同行动。抗微生物剂耐药性存在于世界的所有地区。新的耐药机制出现并在全球扩散。考虑到由抗微生物剂耐药性造成的常见问题，对新的抗微生物剂类型存在强烈需求。具体来说，抗微生物肽是非常有益的。这些肽通常是强效的。此外，它们与通常用作治疗剂的小分子相比常常提供更好的选择性和特异性。然而，它们的使用和治疗性开发的主要限制与它们的半衰期相关。事实上，半衰期常常由于生物体中存在的蛋白酶和肽酶的作用而缩短。因此，为了减少肽的降解已开发了大量策略，例如抵抗外肽酶的C-酰胺化和N-乙酰化，非天然氨基酸或D-构型氨基酸的引入。然而，这些策略只能在合成肽的背景中使用，并且不适合于肽的重组生产。具体来说，没有能够在肽中引入D-构型氨基酸的容易的方式，尽管这种修饰有益。事实上，D-构型氨基酸表现出与天然氨基酸相同的性质，但通常对蛋白酶的抗性更高并且甚至可能免疫原性更低。总而言之，任何新的抗微生物剂类型都是极为有益的，特别是抗微生物肽。此外，在这种背景下，适合于将肽中的L-构型氨基酸修饰成D-构型氨基酸的任何方法都是高度有价值的。技术实现要素：本发明人鉴定到一种源自于细菌即枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)的抗微生物肽，其具有D-氨基酸残基。因此，本发明人发现了一类新的细菌素。这种肽具有只在它的某些氨基酸为D-构型时才表现出抗微生物效应的特异性。这种肽可以通过源自于同一细菌的表现出将肽中氨基酸的构型从L-构型改变成D-构型的性质的酶来制备。因此，这种酶可用于将肽、特别是通过重组生产制备的肽中的L-构型氨基酸转变成D-构型氨基酸。因此，本发明涉及一种具有至少两个D-构型氨基酸的抗微生物肽，其包含与SEQIDNo1的第33至49位的序列具有至少40％同一性的17个残基的序列，并且所述序列包含序列W-Y-F-[V/I/A](SEQIDNo71)和W-[I/V/A]-X4-G-S(SEQIDNo69)以及在SEQIDNo69与SEQIDNo71之间的4-8个氨基酸的连接序列，其中X4是任何氨基酸，其中SEQIDNo69和71的残基[V/I/A]具有D-构型。优选地，所述肽包含序列W-Y-F-[V/I/A]-[K/R]-Xa-Xb-Xc-N-R-W-[V/I/A]-Xd-G-S-Xe-H(SEQIDNo72)、基本上由所述序列构成或由所述序列构成，其中Xa、Xb和Xc是极性氨基酸，Xd是脂族氨基酸，并且Xe是任何氨基酸。更优选地，所述肽包含序列W-Y-F-[V/I/A]-[K/R]-[S/N]-[S/Q/K]-[E/K/S/Q]-N-R-W-[V/I/A]-[L/V/A]-G-S-[A/G]-H(SEQIDNo73)、基本上由所述序列构成或由所述序列构成。在优选实施方式中，所述肽包含选自SEQIDNo61-68的序列、基本上由所述序列构成或由所述序列构成。在一个实施方式中，所述肽包含与SEQIDNo1的第26至49位的序列具有至少40％同一性的24个残基的序列，并且所述序列包含序列N/D-D-L-W-Y-F-[V/I/A](SEQIDNo21)和W-[I/V/A]-X4-G-S(SEQIDNo69)以及在SEQIDNo21与SEQIDNo69之间的4-7个氨基酸的连接序列，其中X4是任何氨基酸。优选地，所述肽包含序列L-X1-X2-X3-N-D-L-W-Y-F-V/I(SEQIDNo23)和W-I/V-X4-G-S(SEQIDNo22)，其中X1、X2、X3和X4是任何氨基酸。更优选地，X1是丙氨酸、天冬氨酸或谷氨酸，X2是赖氨酸、天冬酰胺或天冬氨酸，并且X3是缬氨酸、异亮氨酸或谷氨酰胺。优选地，所述肽包含序列L-A-K-V-N-D-L-W-Y-F-V(SEQIDNo24)和W-I/V-X4-G-S(SEQIDNo22)，其中X4是疏水氨基酸，优选为亮氨酸、缬氨酸、丙氨酸或甲硫氨酸。优选地，序列N/D-D-L-W-Y-F-[V/I/A](SEQIDNo21)中的缬氨酸或异亮氨酸具有D-构型，并且序列W-I/V-X4-G-S(SEQIDNo22)中的异亮氨酸或缬氨酸具有D-构型。在优选实施方式中，所述肽包含SEQIDNo20的序列、基本上由所述序列构成或由所述序列构成，并且第19位的缬氨酸为D-构型，第27位的异亮氨酸为D-构型。本发明还涉及一种药物组合物，其包含本发明的肽。本发明还涉及本发明的肽，其用作药物，优选地用作抗微生物剂，更优选地用作抗细菌剂。本发明涉及本发明的肽在制造药物、优选为抗微生物剂、更优选为抗细菌剂中的用途。本发明涉及一种用于治疗有需要的对象的方法，所述方法包括给药治疗量的本发明的肽。本发明涉及一种用于制备本发明的肽的体外方法，其中所述方法包括将肽与游离基SAM肽差向异构酶相接触的步骤，所述肽包含与SEQIDNo1的第33至49位的序列具有至少40％同一性的17个残基的序列，并且所述序列包含序列W-Y-F-[V/I/A](SEQIDNo71)和W-[I/V/A]-X4-G-S(SEQIDNo69)以及在SEQIDNo69与SEQIDNo71之间的4-8个氨基酸的连接序列，其中X4是任何氨基酸，所述差向异构酶具有与SEQIDNo25具有至少30％同一性并且其中SEQIDNo25的第14-15、18、20-24、27、58-60、63、83、84、87-90、112、115、117、120、150、152、169、176、180、181、183、204、206-208、214、217、220-225、228、230、252、254、262、289、292、296和309位中的70％是保守的氨基酸序列。在一个实施方式中，所述肽包含与SEQIDNo1的第26至49位的序列具有至少40％同一性的24个残基的序列，并且所述序列包含序列N/D-D-L-W-Y-F-[V/I/A](SEQIDNo21)和W-I/V-X4-G-S(SEQIDNo22)以及在SEQIDNo21与SEQIDNo22之间的4-7个氨基酸的连接序列，其中X4是任何氨基酸。本发明还涉及一种游离基SAM肽差向异构酶在制备本发明的肽中的用途，所述差向异构酶具有与SEQIDNo25具有至少30％同一性并且其中SEQIDNo25的第14-15、18、20-24、27、58-60、63、83、84、87-90、112、115、117、120、150、152、169、176、180、181、183、204、206-208、214、217、220-225、228、230、252、254、262、289、292、296和309位中的70％是保守的氨基酸序列。本发明还涉及一种重组宿主细胞，其包含编码肽的异源核酸和编码差向异构酶的异源核酸，并且能够共表达所述肽和所述差向异构酶，所述肽包含与SEQIDNo1的第33至49位的序列具有至少40％同一性的17个残基的序列，并且所述序列包含序列W-Y-F-[V/I/A](SEQIDNo71)和W-[I/V/A]-X4-G-S(SEQIDNo69)以及在SEQIDNo69与SEQIDNo71之间的4-8个氨基酸的连接序列，其中X4是任何氨基酸，并且所述差向异构酶具有与SEQIDNo25具有至少30％同一性并且其中SEQIDNo25的第14-15、18、20-24、27、58-60、63、83、84、87-90、112、115、117、120、150、152、169、176、180、181、183、204、206-208、214、217、220-225、228、230、252、254、262、289、292、296和309位中的70％是保守的氨基酸序列。在一个实施方式中，所述肽包含与SEQIDNo1的第26至49位的序列具有至少40％同一性的24个残基的序列，并且所述序列包含序列N/D-D-L-W-Y-F-[V/I/A](SEQIDNo21)和W-I/V-X4-G-S(SEQIDNo22)以及在SEQIDNo21与SEQIDNo22之间的4-7个氨基酸的连接序列，其中X4是任何氨基酸。最后，本发明涉及一种用于制备本发明的肽的方法，其中所述方法包括将本发明的重组宿主细胞在适合于所述肽和所述差向异构酶共表达的条件下进行培养，并且回收具有至少一个D-构型氨基酸的肽；或者用于肽合成的合成方法，其允许组装L-和D-构型氨基酸。发明详述通过研究枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)的yydFGHIJ操纵子，本发明人首先鉴定到一类新的抗微生物肽，其次鉴定到能够在体外将肽中的L-构型氨基酸转变成D-构型残基的差向异构酶。因此，这种差向异构酶可用于肽工程改造。抗微生物肽在搜索涉及假定参与感应细菌细胞壁完整性的双组分系统LiaRS的调控的基因时，Butcher等人(2007,JBacteriol,189,8616)鉴定到似乎诱导LiaRS表达的操纵子YydFGHIJ。然而，未能分离或在体外调查这个操纵子的组分。本发明人显示，所述操纵子产生肽YydF，并且这种肽被非常令人吃惊地编码一类新的游离基SAM差向异构酶的YydG酶进行翻译后修饰。此外，本发明人发现所述YydF肽具有抗微生物活性，但是只在它包含D-构型氨基酸的情况下。在不存在D-构型氨基酸的情况下，所述肽不具有这种抗微生物活性，这是一种到目前为止在生物活性肽中未知的特点。更具体来说，这种抗微生物活性需要两个D-构型氨基酸。因此，在一个实施方式中，本发明涉及一种具有至少一个D-构型氨基酸、优选地两个D-构型氨基酸的肽，其包含与SEQIDNo1的第33至49位的序列具有至少40％同一性的17个残基的序列。具体来说，所述肽可以包含与SEQIDNo1的第33至49位的序列具有至少45、50、55、60、70、80、85、90、95、98或99％同一性的17个残基的序列。或者，所述肽可以包含SEQIDNo1的第33至49位的17个残基的序列并包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个替换、添加或缺失。在一个优选实施方式中，所述肽包含其中SEQIDNo1的第33-35、40-43、46和47位的残基是保守的序列。在另外的情况下，SEQIDNo1的第36和44位的残基选自V、I和A，优选为V和I。在优选实施方式中，本发明涉及一种具有至少两个D-构型氨基酸的肽，其包含与SEQIDNo1的第33至49位的序列具有至少40％同一性的17个残基的序列，并包括序列W-[I/V/A]-X4-G-S(SEQIDNo69)，其中X4是疏水氨基酸，优选为亮氨酸、缬氨酸或丙氨酸。具体来说，所述肽可以包含与SEQIDNo1的第33至49位的序列具有至少40、45、50、55、60、70、80、85、90或95％同一性的17个残基的序列。任选地，所述肽还包含序列W-Y-F-[V/I/A](SEQIDNo71)。优选地，SEQIDNo69和71的氨基酸[V/I/A]是D-构型氨基酸。在所述肽序列中，当考虑从N-端末端向C-端末端的取向时，序列W-Y-F-[V/I/A](SEQIDNo71)在序列W-[I/V/A]-X4-G-S(SEQIDNo69)、优选地W-[I/V]-X4-G-S(SEQIDNo22)之前。在优选实施方式中，基序W-Y-F-[V/I/A](SEQIDNo71)与基序W-[I/V/A]-X4-G-S(SEQIDNo69)、优选为W-[I/V]-X4-G-S(SEQIDNo22)被包含4至8个氨基酸的连接序列、优选地5或7个氨基酸、优选地6个氨基酸的连接序列分隔开。在最优选的实施方式中，所述肽包含序列W-Y-F-[V/I/A]-[K/R]-Xa-Xb-Xc-N-R-W-[V/I/A]-Xd-G-S-Xe-H(SEQIDNo72)，其中Xa、Xb和Xc是极性氨基酸，Xd是脂族氨基酸，并且Xe是任何氨基酸。优选地，Xa选自S、N、C和T，更优选为S或N。优选地，Xb选自S、N、T、Q、D、E、K、R和H，更优选地选自S、N、Q和K，更优选地选自S、Q和K。优选地，Xc选自S、N、T、Q、D、E、K、R和H，更优选地选自S、N、Q、E、R和K，更优选地选自E、K、S和Q。优选地，Xd选自L、I、V、A，更优选地选自L、V和A。优选地，Xe选自A、G或S，更优选为A或G。在非常特定的实施方式中，所述肽基本上由序列W-Y-F-[V/I/A]-[K/R]-[S/N]-[S/Q/K]-[E/K/S/Q]-N-R-W-[V/I/A]-[L/V/A]-G-S-[A/G]-H(SEQIDNo73)构成或由所述序列构成。在本发明的一种情况下，所述肽包含选自SEQIDNo61-68的序列、基本上由所述序列构成或由所述序列构成。在一个实施方式中，本发明涉及具有至少一个D-构型氨基酸、优选地两个D-构型氨基酸的肽，其包含与SEQIDNo1的第26至49位的序列具有至少40％同一性的24个残基的序列。具体来说，所述肽可以包含与SEQIDNo1的第26至49位的序列具有至少45、50、60、70、80、85、90、95、98或99％同一性的24个残基的序列。或者，所述肽可以包含SEQIDNo1的第26至49位的24个残基的序列并包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个替换、添加或缺失。在优选实施方式中，所述肽包含其中SEQIDNo1的第26、31-35、43、46和47位的残基是保守的序列。在另外的情况下，SEQIDNo1的第23、25、27-30、36、37、38、41、42、44、48和49位中的一个或几个残基也是保守的。例如，SEQIDNo1的第23、25、27-30、36、37、38、41、42、44、48和49位中的1-11个残基，特别是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11个残基可以是保守的。更优选地，SEQIDNo1的第23、25、27-30、36、37、38、41、42、44、48和49位的残基是保守的。更优选地，SEQIDNo1的第25、29和38位的残基是保守的。因此，本发明的肽包含序列N/D-D-L-W-Y-F-[V/I/A](SEQIDNo21)、特别是L-X1-X2-X3-N-D-L-W-Y-F-V/I(SEQIDNo23)，或/和W-I/V/A-X4-G-S(SEQIDNo22)，其中X1、X2、X3和X4是任何氨基酸。任选地，所述肽包含两种序列。任选地，所述序列W-I/V/A-X4-G-S(SEQIDNo69)是序列W-I/V-X4-G-S(SEQIDNo22)。优选地，X1是丙氨酸、天冬氨酸或谷氨酸，优选为丙氨酸和天冬氨酸，更优选为丙氨酸。优选地，X2是赖氨酸、天冬酰胺或天冬氨酸，优选为赖氨酸或天冬酰胺，更优选为赖氨酸。优选地，X3是缬氨酸、异亮氨酸或谷氨酰胺，优选为缬氨酸或异亮氨酸，更优选为缬氨酸。优选地，X4是疏水氨基酸，优选为亮氨酸、缬氨酸、丙氨酸或甲硫氨酸。在特定实施方式中，X1是丙氨酸和天冬氨酸，优选为丙氨酸，X2是赖氨酸或天冬酰胺，优选为赖氨酸，X3是缬氨酸或异亮氨酸，优选为缬氨酸，并且X4是疏水氨基酸，优选为亮氨酸、缬氨酸或丙氨酸。在优选实施方式中，所述肽包含序列L-A-K-V-N-D-L-W-Y-F-V(SEQIDNo24)和W-I/V-X4-G-S(SEQIDNo22)，其中X4是疏水氨基酸，优选为亮氨酸、缬氨酸或丙氨酸。“I/V”或“V/I”在本文中是指异亮氨酸或缬氨酸。“N/D”在本文中是指天冬酰胺或天冬氨酸。“I/V/A”在本文中是指异亮氨酸、缬氨酸或丙氨酸。在优选情况下，在序列W-I/V-X4-G-S(SEQIDNo22)中，I/V是异亮氨酸(SEQIDNo57)。或者，在序列W-I/V-X4-G-S(SEQIDNo22)中，I/V是缬氨酸(SEQIDNo58)。在另一种情况下，W-I/V/A-X4-G-S(SEQIDNo69)是W-A-X4-G-S(SEQIDNo70)。优选地，X4是疏水氨基酸，更优选为亮氨酸、缬氨酸、丙氨酸或甲硫氨酸，更优选为亮氨酸、缬氨酸或丙氨酸。在优选情况下，在序列N/D-D-L-W-Y-F-[V/I/A](SEQIDNo21)中，N/D是天冬酰胺并且I/V是缬氨酸。或者，在序列N/D-D-L-W-Y-F-[V/I/A](SEQIDNo21)中，N/D是天冬氨酸并且I/V是异亮氨酸。在所述肽序列中，当考虑从N-端末端到C-端末端的取向时，序列N/D-D-L-W-Y-F-[V/I/A](SEQIDNo21)、特别是L-X1-X2-X3-N-D-L-W-Y-F-V/I(SEQIDNo23)在序列W-I/V-X4-G-S(SEQIDNo22)之前。在优选实施方式中，基序N/D-D-L-W-Y-F-[V/I/A](SEQIDNo21)与基序W-I/V-X4-G-S(SEQIDNo22)被包含4至7个氨基酸的连接序列、优选地5或6个氨基酸、优选地5个氨基酸的连接序列分隔开。在最优选的实施方式中，所述肽包含序列N/D-D-L-W-Y-F-V/I-(X)5-W-I/V-X4-G-S(SEQIDNo59)或N/D-D-L-W-Y-F-V/I-(X)6-W-I/V-X4-G-S(SEQIDNo60)，X4具有与上述相同的含义。因此，在优选实施方式中，本发明涉及一种具有至少一个D-构型氨基酸的肽，其包含与SEQIDNo1的第26至49位的序列具有至少40％同一性的24个残基的序列，并包括序列L-A-K-V-N-D-L-W-Y-F-V(SEQIDNo24)和/或W-I/V-X4-G-S(SEQIDNo22)，其中X4是疏水氨基酸，优选为亮氨酸、缬氨酸或丙氨酸。具体来说，所述肽可以包含与SEQIDNo1的第26至49位的序列具有至少45、50、60、70、80、85、90或95％同一性的24个残基的序列。在优选实施方式中，SEQIDNo1的第23、25、27-30、36、37、38、41、42、44、48和49位中的一个或几个残基、特别是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11个残基也是保守的。所述肽包含至少一个D-构型氨基酸，优选地两个D-构型氨基酸。例如，它可以包含1、2、3、4或5个D-构型氨基酸。任选地，所述D-构型氨基酸可以是任何氨基酸，优选为选自I、V、A、N、S和T的氨基酸，更优选地选自I、V和A，更优选地选自I和V。在特定实施方式中，序列N/D-D-L-W-Y-F-[V/I/A](SEQIDNo21)中的缬氨酸、异亮氨酸或丙氨酸具有D-构型，和/或序列W-[I/V/A]-X4-G-S(SEQIDNo69)、优选为W-I/V-X4-G-S(SEQIDNo22)中的异亮氨酸、缬氨酸或丙氨酸具有D-构型。在优选实施方式中，序列N/D-D-L-W-Y-F-[V/I/A](SEQIDNo21)中的缬氨酸、异亮氨酸或丙氨酸和序列W-[I/V/A]-X4-G-S(SEQIDNo69)、优选为W-I/V-X4-G-S(SEQIDNo22)中的异亮氨酸、缬氨酸或丙氨酸具有D-构型。在优选情况下，序列N/D-D-L-W-Y-F-V/I-(X)5-W-I/V-X4-G-S(SEQIDNo59)或N/D-D-L-W-Y-F-V/I-(X)6-W-I/V-X4-G-S(SEQIDNo60)中的缬氨酸或异亮氨酸具有D-构型。任选地，所述肽可以包含其他的D-构型氨基酸。优选地，所述肽的长度不超过约65个氨基酸，更优选地不超过50个氨基酸，具体来说可以是约15至约50个氨基酸，例如约17至约50个氨基酸、约18至约50个氨基酸、约17至约40个、约20至约40个或约25至约35个氨基酸。所述肽可以包含选自SEQIDNo1-19中示出的氨基酸序列或其功能性片段的序列，基本上由所述序列构成或由所述序列构成，所述功能性片段包含序列N/D-D-L-W-Y-F-[V/I/A](SEQIDNo21)、特别是L-X1-X2-X3-N-D-L-W-Y-F-V/I(SEQIDNo23)和/或W-I/V-X4-G-S(SEQIDNo22)，更优选为L-A-K-V-N-D-L-W-Y-F-V(SEQIDNo24)和W-I/V-X4-G-S(SEQIDNo22)。功能性意指具有抗微生物活性，特别是抗细菌活性。在非常特定的实施方式中，所述肽包含SEQIDNo20的序列、基本上由所述序列构成或由所述序列构成，并且第19位的缬氨酸为D-构型和/或第27位的异亮氨酸为D-构型。优选地，第19位的缬氨酸和第27位的异亮氨酸两者都为D-构型。在另一个非常特定的实施方式中，所述肽具有SEQIDNo1的序列，并且第36位的缬氨酸为D-构型和/或第44位的异亮氨酸为D-构型。优选地，第36位的缬氨酸和第44位的异亮氨酸两者都为D-构型。在特定实施方式中，所述肽在自然界中不存在。所述肽是非天然肽。本文中描述的肽的N-和C-端可以任选地被保护以对抗蛋白水解。在优选实施方式中，所述N-端可以为乙酰基的形式，和/或所述C-端可以为酰胺基的形式。在优选实施方式中，所述肽具有游离的C-端末端。可选地或另外地，也可以设想所述肽的内部修饰以便对蛋白水解具有抗性，例如其中至少-CONH-肽键被修饰并被(CH2NH)还原键、(NHCO)逆反键、(CH2-O)亚甲基-氧基键、(CH2-S)硫代亚甲基键、(CH2CH2)碳键、(CO-CH2)羰基亚甲基键、(CHOH-CH2)羟基亚乙基键、(N-N)键、E-烯烃(E-alcene)键或-CH＝CH-键代替。例如，所述肽可以通过乙酰化、酰化、酰胺化、交联、环化、二硫键形成、共价交联的形成、半胱氨酸的形成、焦谷氨酸酯的形成、甲酰化、γ-羧化、糖基化、GPI锚形成、羟基化、碘化、甲基化、十四烷基化、氧化、磷酸化等进行修饰。本发明的肽可以包含一个或多个作为稀有氨基酸的氨基酸，特别是羟脯胺酸、羟赖氨酸、别羟赖氨酸、6-N-甲基赖氨酸、N-乙基甘氨酸、N-甲基甘氨酸、N-乙基天冬酰胺、别异亮氨酸、N-甲基异亮氨酸、N-甲基缬氨酸、焦谷氨酰胺、氨基丁酸，或合成的氨基酸特别是鸟氨酸、正亮氨酸、正缬氨酸和环己基-丙氨酸。任选地，所述肽可以任选地通过连接物或间隔物(例如二甘氨酸)连接到另外的组成部分。任选地，所述肽可以是蛋白质融合物的一部分。所述另外的组成部分可以是促进细胞摄入或进入的组成部分，特别是PTD(蛋白转导结构域)或细胞穿透肽，归巢肽(homingpeptide)，稳定剂例如PEG(聚乙二醇)、寡聚N-甲氧基-乙基甘氨酸(NMEG)、白蛋白、白蛋白结合性蛋白或免疫球蛋白Fc结构域，亲和标签例如免疫标签、生物素、凝集素或螯合剂，纯化标签例如His标签，可检测标记物例如光学标签、螯合的镧系元素、荧光染料或FRET受体/供体，靶向组成部分，分泌信号肽，或其组合。所述另外的组成部分可以被添加在所述肽的N-端末端或C-端末端处。优选地，所述另外的组成部分被添加在所述肽的N-端末端处。在本发明的另一种情况下，肽通过它们的C-端末端或赖氨酸残基被共价结合到聚乙二醇(PEG)分子，尤其是1500或4000MW的PEG，以减少尿液清除和使用的治疗剂量并增加在血浆中的半衰期。在又一个实施方式中，通过将所述肽包含在用于形成微球的药物递送系统的可生物降解并且生物相容的聚合物材料中，增加肽的半衰期。聚合物和共聚物是例如聚(D,L-丙交酯-乙交酯)共聚物(PLGA)(正如在SoonKapHahn等人的US2007/0184015中说明的)。本发明还涵盖了本发明的肽的可药用盐。可药用盐可以是例如可药用无机酸例如盐酸、氢溴酸、硫酸和磷酸的盐，可药用有机酸例如乙酸、柠檬酸、马来酸、苹果酸、琥珀酸、抗坏血酸和酒石酸的盐，可药用无机碱的盐例如钠盐、钾盐、钙盐、镁盐或铵盐，或在制药技术中常用的含有可成盐的氮的有机碱的盐。用于制备所述盐的方法对于本领域技术人员来说是公知的。在优选实施方式中，所述肽是分离的。所述抗微生物肽的用途本发明涉及一种包含如上所定义的肽的药物组合物。所述药物组合物还可以包含可药用载体和/或赋形剂。制药用途也设想了兽医用途。任选地，所述药物组合物还可以包含另一种活性成分，优选为另一种抗微生物剂，更优选为另一种抗细菌剂或抗炎剂。包含所述分子的药物组合物按照本领域技术人员已知的标准制药实践来配制(LippincottWilliams&Wilkins,2000和《制药技术百科全书》(EncyclopediaofPharmaceuticalTechnology)，J.Swarbrick和J.C.Boylan主编，1988-1999,MarcelDekker,NewYork)。本发明还涉及一种如上所定义的肽，其用作药物、特别是用作抗微生物剂、更优选为抗细菌剂。本发明还涉及如上所定义的肽在制造用作抗微生物剂、更优选为抗细菌剂的药物中的用途。此外，本发明涉及一种治疗或预防感染、特别是细菌感染的方法，所述方法包括给药治疗有效量的如上所定义的肽，从而治疗或预防感染。在优选实施方式中，如上所定义的肽使得序列N/D-D-L-W-Y-F-[V/I/A](SEQIDNo21)中的缬氨酸、异亮氨酸或丙氨酸和序列W-[I/V/A]-X4-G-S(SEQIDNo69)、优选为W-I/V-X4-G-S(SEQIDNo22)中的异亮氨酸、缬氨酸或丙氨酸具有D-构型的肽。在非常特定的实施方式中，所述肽包含SEQIDNo20的序列、基本上由所述序列构成或由所述序列构成，并且第19位的缬氨酸和第27位的异亮氨酸为D-构型。在另一个非常特定的实施方式中，所述肽具有SEQIDNo1的序列，并且第36位的缬氨酸和第44位的异亮氨酸为D-构型。在另一个非常特定的实施方式中，所述肽包含选自SEQIDNo61-68的序列、基本上由所述序列构成或由所述序列构成，其中第4和12位的残基为D-构型。任选地，如上所定义的肽可以与另一种药物、优选为另一种抗微生物剂、更优选为另一种抗细菌剂或抗炎剂相组合使用。“治疗”意指疾病被治愈、缓解或延迟。它包括预防性或治愈性治疗。当在本申请中使用时，术语“治疗有效量”意指被给药到患者的足以构成感染的治疗的治疗剂的量。所述药物组合物的形式、给药途径、剂量和方案自然取决于待治疗的病症、疾病的严重性、患者的年龄、体重和性别等。本发明的药物组合物可以被配制成用于表面、口服、肠胃外、鼻内、静脉内、肌肉内、皮下或眼内给药等。对于口服给药来说，所述组合物可以被配制成常规口服剂型例如片剂、胶囊、粉剂、颗粒剂和液体制剂例如糖浆、酏剂和浓缩滴剂。可以使用无毒性固体载体或稀释剂，其包括例如制药级甘露糖醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、滑石、纤维素、葡萄糖、蔗糖、碳酸镁等。对于压缩片剂来说，作为向粉状材料提供内聚品质的试剂的粘合剂也是必需的。例如，淀粉、明胶、糖例如乳糖或右旋糖以及天然或合成树胶可以用作粘合剂。在片剂中，为了促进片剂的崩裂，崩解剂也是必需的。崩解剂包括淀粉、粘土、纤维素、藻胶、树胶和交联的聚合物。此外，润滑剂和助流剂也被包含在片剂中以防止片剂材料在制造过程中粘附到表面并提高粉末材料在制造期间的流动特性。胶体二氧化硅最常用作助流剂，并且诸如滑石或硬脂酸的化合物最常用作润滑剂。对于经皮给药来说，所述组合物可以被配制成软膏、霜剂或凝胶形式，并且可以使用适合的渗透剂或去污剂来促进渗透，例如二甲基亚砜、二甲基乙酰胺和二甲基甲酰胺。对于经粘膜给药来说，可以使用鼻喷剂、直肠或阴道栓剂。可以通过本领域中已知的方法将活性化合物并入到任何已知的栓剂基料中。这些基料的实例包括可可脂、聚乙二醇(碳蜡(carbowax))、聚乙烯失水山梨糖醇单硬脂酸酯以及它们与其他相容材料的混合物，以修改熔点或溶出速率。本发明的药物组合物可以被配制成在给药后基本上立即释放活性药物或在给药后任何预定的时间或时间段释放活性药物。在特定实施方式中，本发明的药物组合物包含0.001mg至10g本发明的分子。优选地，本发明的药物组合物包含0.01mg至1g本发明的分子。在另一种情况下，本发明涉及本发明的肽作为消毒剂、防腐剂或杀虫剂的用途。术语“消毒剂”是指所述肽对表面(例如墙、门、医疗设备)、液体(例如水)或气体(例如麻醉气体)的抗微生物活性。根据一个实施方式，本发明的肽被用于消除细菌生物膜。根据优选实施方式，本发明的肽被具体用于对外科或假体设备进行消毒。在另一种情况下，本发明涉及一种医疗装置或植入物，其包含具有至少一个涂覆有或包含本发明的肽的表面的主体。本发明还涉及一种制备医疗装置或植入物的方法，所述方法包括将本发明的肽的涂层施加在所述装置或植入物的至少一个表面上，或将所述涂层放置成与所述至少一个表面相接触。例如在专利申请WO2005/006938中描述了这种类型的医疗装置或植入物及其用途和制备方法。涂覆有或包含本发明的肽的表面可以由热塑性或聚合材料例如聚乙烯、涤纶、尼龙、聚酯、聚四氟乙烯、聚氨酯、乳胶、硅酮弹性体等或金属材料例如金构成。在特定实施方式中，本发明的肽通过其N-端或C-端末端被共价附连到官能化表面，优选为金属表面。任选地，所述肽可以通过间隔臂被附连到所述表面。优选地，所述表面可以涂覆有密度为0.4至300mg/cm2的肽。或者，所述装置或植入物、特别是骨骼和关节假体装置可以涂覆有包含本发明的肽的胶结剂混合物。所述肽可以与另一种活性分子、优选为抗生素组合。所述装置或植入物可以是例如血管内、腹膜、胸膜和泌尿导管，心脏瓣膜，心脏起搏器，血管转流管，冠状动脉支架，牙科植入物，或者整形外科或眼内假体。所述肽的制备本文中描述的肽可以使用本领域技术人员已知的标准合成方法，例如化学合成或遗传重组来合成。具体来说，所述肽可以按照最初由Merrifield描述的方法来合成。化学合成技术的实例是固相合成和液相合成。作为固相合成，例如将对应于待合成的肽的C-端的氨基酸结合到在有机溶剂中不溶的支持物，并且通过两个反应的交替重复，在一个反应中将氨基和侧链官能团用适合的保护基团保护的氨基酸按照从C-端到N-端的顺序一个接一个地缩合，在另一个反应中将所述肽的结合到树脂的氨基酸或氨基的保护基团释放，从而以这种方式延长所述肽链。取决于所使用的保护基团的类型，固相合成方法主要被分类成tBoc方法和Fmoc方法。通常使用的保护基团包括用于氨基的tBoc(叔丁氧基羰基)、Cl-Z(2-氯苯甲氧基羰基)、Br-Z(2-溴苯甲氧基羰基)、Bzl(苯甲基)、Fmoc(9-芴基甲氧基羰基)、Mbh(4,4'-二甲氧基二苯甲基)、Mtr(4-甲氧基-2,3,6-三甲基苯磺酰基)、Trt(三苯甲基)、Tos(甲苯磺酰基)、Z(苯甲氧基羰基)和Clz-Bzl(2,6-二氯苯甲基)；用于胍基的NO2(硝基)和Pmc(2,2,5,7,8-五甲基色满-6-磺酰基)；以及用于羟基的tBu(叔丁基)。在合成所需的肽后，对它进行去保护反应并从固体支持物上切下。这种肽切割反应对于Boc方法来说可以使用氟化氢或三氟甲磺酸来进行，并且对于Fmoc方法来说可以使用TFA来进行。或者，所述肽可以使用重组技术来合成。在这种情况下，使用包含编码本发明的肽的核苷酸序列的核酸和/或遗传构建物。因此，本发明涉及一种核酸和/或遗传构建物，其包含编码本发明的肽的核苷酸序列。所述遗传构建物包含编码如本文中所定义的本发明的肽的多核苷酸，以及允许本发明的肽在宿主细胞中表达(例如转录和翻译)的调控序列(例如适合的启动子、增强子、终止子等)。因此，在另一种情况下，本发明涉及一种宿主或宿主细胞，其表达(或者在适合的情况下能够表达)本发明的肽，和/或含有本发明的多核苷酸或本发明的遗传构建物。为了获得含有D-氨基酸的肽，可以将所述肽与本发明中描述的肽差向异构酶共表达。生产所述肽的方法可以任选地包括纯化所述肽、化学修饰所述肽和/或将所述肽配制成药物组合物的步骤。例如，本文中描述的肽可以作为含有分泌信号肽或纯化标签的蛋白质融合物通过重组技术来制备。这种分泌信号肽或纯化标签可以在生产的另一个阶段切掉或移除。在本发明的特定目的中，用于制备所述肽的方法包括提供或合成具有L-构型氨基酸的如上所述的肽，并将所述肽与酶(即差向异构酶)相接触，从而将所述肽的至少一个L-构型氨基酸转变成D-构型氨基酸，所述差向异构酶如下文所定义。游离基SAM差向异构酶本发明人在枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)中鉴定到一种被称为YydG的游离基SAM差向异构酶，其能够将肽中包含的氨基酸的构型从L-构型修饰成D-构型。这种酶甚至能够在体外条件下进行这种转化。它的序列示出在SEQIDNo18中。此外，这种酶与其他已知的差向异构酶、甚至是游离基SAM酶超家族中已知的差向异构酶没有相关性。因此，本发明涉及一种差向异构酶，其能够将肽中包含的氨基酸的构型从L-构型修饰成D-构型，并包含与SEQIDNo25具有至少30％同一性的氨基酸序列。优选地，所述差向异构酶包含与SEQIDNo25具有至少35、40、50、60、70、80、85、90、95、97.5或99％同一性的氨基酸序列。枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)的YydG在下述识别号下描述在公共数据库中：UniProtQ45595，GeneID937720，GenBankNP_391897.1和NC_000964.3。基于本公开的教导，本领域技术人员可以从具有游离基SAM差向异构酶的微生物中鉴定其他酶。可以使用探针，从其他来源，包括从自然界(例如土壤、堆肥、水等)分离的微生物或从天然材料(例如土壤、堆肥、水等)直接获得的DNA样品中鉴定并获得所述多肽。用于从天然生境直接分离微生物和DNA的技术在本领域中是公知的。然后对另一种微生物的基因组DNA或cDNA文库或混合的DNA样品进行相似性筛选，可以获得编码所述多肽的多核苷酸。在检测到编码多肽的多核苷酸后，可以利用本领域普通技术人员已知的技术(参见例如Sambrook等，1989)分离或克隆所述多肽。本领域技术人员也可以使用数据库中已经可用的序列数据。此外，本领域技术人员可以通过当前使用的方法制备具有SEQIDNo25的氨基酸序列的差向异构酶的变体。具体来说，所述变体具有有利性质，例如稳定性(例如热稳定性)提高、D-构型氨基酸的生产增加、改良差向异构酶的特异性和/或选择性等。与SEQIDNo25相比100％相同的序列公开在UniprotAOAOC2UHS5、AOAOA1MJP5和L8AWU7中。其他枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)菌株存在具有高同一性(高达90％同一性)的序列，并公开在SEQIDNo26-29和32中。其他芽孢杆菌菌株存在具有高同一性的序列，并公开在SEQIDNo30和33-35中。已在Salinibacillusaidiingensis、马胃葡萄球菌(Staphylococcusequorum)、伪中间葡萄球菌(Staphylococcuspseudintermedius)、表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)、类芽孢杆菌物种(Paenibacillussp)、Enterococcuscaccae、粪肠球菌(Enterococcusfaecalis)、白喉棒状杆菌(Corynebacteriumdiphtheria)、无乳链球菌(Streptococcusagalactiae)和波西米亚双歧杆菌(Bifidobacteriumbohemicum)中鉴定到具有显著同一性的序列，并公开在SEQIDNo31和36-52中。图6示出了酶序列的比对。粗体且带下划线的位置在上面公开的序列名单中是完全保守的。粗体且斜体的位置在上面公开的序列名单中在具有强烈相似性质的组之间是保守的。因此可以观察到，尽管同一性百分数在30％左右，但存在大量完全保守和良好保守的氨基酸。因此，在优选实施方式中，所述差向异构酶的氨基酸序列与SEQIDNo25具有至少30％同一性，并且其中当将所述序列与SEQIDNo25比对时，粗体且带下划线的位置(SEQIDNo25的第14-15、18、20-24、27、58-60、63、83、84、87-90、112、115、117、120、150、152、169、176、180、181、183、204、206-208、214、217、220-225、228、230、252、254、262、289、292、296和309位)中的70、80或90％是保守的。优选地，粗体且带下划线的位置中的95％是保守的。在特定实施方式中，所有粗体且带下划线的位置是保守的。更优选地，SEQIDNo25的第14-15、18、20-24、27、58-60、63、83、84、87-90、112、115、117、120、204、206-208、214、217、220-225、228和230位中的90或95％在所述差向异构酶序列中是保守的。在特定实施方式中，SEQIDNo25的第14-15、18、20-24、27、58-60、63、83、84、87-90、112、115、117、120、204、206-208、214、217、220-225、228和230位在所述差向异构酶序列中全部都是保守的。在优选实施方式中，所述差向异构酶具有与SEQIDNo25具有至少30％同一性的氨基酸序列，并且选自13-27、56-63、83-90、112-120和204-230区段的一个或几个区段与SEQIDNo25的序列具有至少50％的同一性。在这个实施方式中，另外地，SEQIDNo25的第14-15、18、20-24、27、58-60、63、83、84、87-90、112、115、117、120、204、206-208、214、217、220-225、228和230位中的90或95％在所述差向异构酶序列中是保守的。在特定实施方式中，SEQIDNo25的第14、18、21、222和223位的半胱氨酸残基在所述差向异构酶序列中是保守的。在一个实施方式中，所述差向异构酶的氨基酸序列包含与选自SEQIDNo25-52、优选地选自SEQIDNo25-30、32和34、更优选地SEQIDNo25的序列具有至少80、85、90或95％同一性的序列，基本上由所述序列构成或由所述序列构成。所述差向异构酶的氨基酸序列可以包含选自SEQIDNo25-52、优选地选自SEQIDNo25-30、32和34、更优选地SEQIDNo25的序列，基本上由所述序列构成或由所述序列构成；并具有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个替换、添加或缺失。例如在实施例部分中详细公开了一种用于测试差向异构酶将肽中包含的氨基酸的构型从L-构型修改为D-构型的能力的方法。例如，在辅因子S-腺苷-L-甲硫氨酸(SAM)存在下将所述差向异构酶与具有选自SEQIDNo1-20的序列的肽相接触，并检测包括D-构型氨基酸的肽的产生。更具体来说，在辅因子S-腺苷-L-甲硫氨酸(SAM)存在下将所述差向异构酶与SEQIDNo20的肽YydF18-49相接触，并检测在第19和/或27位包括D-构型氨基酸的肽的产生。还提供了一种混杂多肽或融合多肽，其中将如上所定义的酶的氨基酸序列融合在另一个多肽的区域的N-端或C-端。用于生产融合多肽的技术在本领域中是已知的，并且包括将编码所述酶和另一个多肽的添加区域的编码序列相连以使它们同框，并使所述融合多肽的表达在相同启动子和终止子的控制之下。融合多肽也可以使用内含肽技术来构建，其中融合多肽在翻译后产生(Cooper等，1993，EMBOJ.12:2575-2583；Dawson等，1994，Science266:776-779)。可以选择所述融合多肽的添加区域以便提高本公开的酶的稳定性，促进所述融合蛋白从细胞(例如细菌细胞或酵母细胞)中分泌(例如N-端疏水信号肽)，或协助所述融合蛋白的纯化。更具体来说，所述添加区域可以是可用于所述酶的纯化或固定化的标签。这种标签对于本领域技术人员来说是公知的，例如His标签(His6)、FLAG标签、HA标签(源自于流感病毒蛋白血细胞凝集素的表位)、麦芽糖结合蛋白(MPB)、MYC标签(源自于人原癌蛋白MYC的表位)、STREP标签或GST标签(小的谷胱甘肽-S-转移酶)。融合多肽还可以在所述酶与所述添加区域之间包含切割位点。在所述融合蛋白分泌后，所述位点被切割，释放出所述两种多肽。切割位点的实例包括但不限于在下述文献中公开的位点：Martin等，2003，J.Ind.Microbiol.Biotechnol.3:568-576；Svetina等，2000，J.Biotechnol.76:245-251；Rasmussen-Wilson等，1997，Appl.Environ.Microbiol.63:3488-3493；Ward等，1995，Biotechnology13:498-503；Contreras等，1991，Biotechnology9:378-381；Eaton等，1986，Biochemistry25:505-512；Collins-Racie等，1995，Biotechnology13:982-987；Carter等，1989，Proteins:Structure，Function，andGenetics6:240-248；和Stevens，2003，DrugDiscoveryWorld4:35-48。还提供了一种重组核酸构建物或载体，其包含编码如上所定义的差向异构酶的核酸序列。更具体来说，所述核酸构建物或载体适合于表达所述差向异构酶。此外，提供了一种重组宿主细胞，其包含含有编码如上所定义的差向异构酶的核酸序列的核酸、重组核酸构建物或重组载体。核酸构建物事实上，本发明涉及一种编码本发明的差向异构酶的多核苷酸。所述核酸可以是DNA(cDNA或gDNA)、RNA或两者的混合物。它可以为单链形式或双链体形式或两者的混合物。它可以包含修饰的核苷酸，包括例如修饰的键、修饰的嘌呤或嘧啶碱基或修饰的糖。它可以通过本领域技术人员已知的任何方法来制备，包括化学合成、重组和诱变。本发明还涉及一种核酸构建物，其包含被可操作地连接到一个或多个控制序列的编码本公开的差向异构酶的多核苷酸，所述控制序列指导所述编码序列在适合的宿主细胞中，在与所述控制序列相容的条件下表达。可以以多种方式对多核苷酸进行操作以提供差向异构酶的表达。取决于表达载体，所述多核苷酸在插入到载体中之前的操作可能是理想或必需的。利用重组DNA方法修饰多核苷酸的技术在本领域中是公知的。所述控制序列可以包括被用于表达编码本发明的差向异构酶的多核苷酸的宿主细胞或体外表达系统识别的启动子。所述启动子含有介导所述差向异构酶的表达的转录控制序列。所述启动子可以是在所述宿主细胞中显示出转录活性的任何多核苷酸，包括突变、截短和混杂的启动子，并且可以从与所述宿主细胞同源或异源的编码细胞外或细胞内多肽的基因获得。任选地，所述启动子可以是诱导型的。在细菌宿主细胞中，适合的启动子的实例是从以下获得的启动子：解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)α-淀粉酶基因(amyQ)，地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)α-淀粉酶基因(amyL)，地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)青霉素酶基因(penP)，嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillusstearothermophilus)产麦芽糖淀粉酶基因(amyM)，枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)果聚糖蔗糖酶基因(sacB)，枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)xylA和xylB基因，苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis)crylllA基因(Agaisse和Lereclus，1994，MolecularMicrobiology13:97-107)，大肠埃希氏杆菌(E.coli)lac操纵子，大肠埃希氏杆菌(E.coli)trc启动子(Egon等，1988，Gene69:301-315)，天蓝色链霉菌(Streptomycescoelicolor)琼脂水解酶基因(dagA)和原核生物β-内酰胺酶基因(Villa-Kamaroff等，1978，Proc.Natl.Acad.Sci.USA75:3727-3731)，以及tac启动子(DeBoer等，1983，Proc.Natl.Acad.Sci.USA80:21-25)。在Gilbert等，1980,ScientificAmerican242:74-94中的“来自于重组细菌的有用蛋白质”(Usefulproteinsfromrecombinantbacteria)和Sambrook等，1989中描述了其他启动子。WO99/43835中公开了串联启动子的实例。在丝状真菌宿主细胞中，适合的启动子的实例是从下述基因获得的启动子：构巢曲霉(Aspergillusnidulans)乙酰胺酶，黑曲霉(Aspergillusniger)中性α-淀粉酶，黑曲霉(Aspergillusniger)酸稳定性α-淀粉酶，黑曲霉(Aspergillusniger)或泡盛曲霉(Aspergillusawamori)葡糖淀粉酶(glaA)，米曲霉(Aspergillusoryzae)TAKA淀粉酶，米曲霉(Aspergillusoryzae)碱性蛋白酶，米曲霉(Aspergillusoryzae)磷酸丙糖异构酶，尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)胰蛋白酶样蛋白酶(WO96/00787)，Fusariumvenenatum淀粉葡萄糖苷酶(WO00/56900)，FusariumvenenatumDaria(WO00/56900)，FusariumvenenatumQuinn(WO00/56900)，米黑根毛霉(Rhizomucormiehei)脂肪酶，米黑根毛霉(Rhizomucormiehei)天冬氨酸蛋白酶，里氏木霉(Trichodermareesei)β-葡萄糖苷酶，里氏木霉(Trichodermareesei)纤维二糖水解酶I，里氏木霉(Trichodermareesei)纤维二糖水解酶II，里氏木霉(Trichodermareesei)内切葡聚糖酶I，里氏木霉(Trichodermareesei)内切葡聚糖酶II，里氏木霉(Trichodermareesei)内切葡聚糖酶III，里氏木霉(Trichodermareesei)内切葡聚糖酶IV，里氏木霉(Trichodermareesei)内切葡聚糖酶V，里氏木霉(Trichodermareesei)木聚糖酶I，里氏木霉(Trichodermareesei)木聚糖酶II，里氏木霉(Trichodermareesei)β-木糖苷酶，以及NA2-tpi启动子(一种来自于曲霉(Aspergillus)中性α-淀粉酶基因的改良的启动子，其中非翻译前导区被来自于曲霉(Aspergillus)磷酸丙糖异构酶基因的非翻译前导区代替；非限制性实例包括来自于黑曲霉(Aspergillusniger)中性α-淀粉酶基因的改良的启动子，其中非翻译前导区被来自于构巢曲霉(Aspergillusnidulans)或米曲霉(Aspergillusoryzae)磷酸丙糖异构酶基因的非翻译前导区代替)；以及它们的突变、截短和混杂的启动子。在酵母宿主中，有用的启动子从下述基因获得：啤酒糖酵母(Saccharomycescerevisiae)烯醇酶(ENO-1)，啤酒糖酵母(Saccharomycescerevisiae)半乳糖激酶(GAL1)，啤酒糖酵母(Saccharomycescerevisiae)醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH1、ADH2/GAP)，啤酒糖酵母(Saccharomycescerevisiae)磷酸丙糖异构酶(TPI)，啤酒糖酵母(Saccharomycescerevisiae)金属硫蛋白(CUP1)和啤酒糖酵母(Saccharomycescerevisiae)3-磷酸甘油酸激酶。Romanos等，1992,Yeast8:423-488描述了酵母宿主细胞的其他有用的启动子。所述控制序列也可以是转录终止子，其被宿主细胞识别以终止转录。所述终止子被可操作地连接到编码所述多肽的多核苷酸的3'-端。在本发明中可以使用在宿主细胞中起作用的任何终止子。用于细菌宿主细胞的优选终止子从下述基因获得：克劳氏芽孢杆菌(Bacillusclausii)碱性蛋白酶(aprH)，地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)α-淀粉酶(amyL)和大肠埃希氏杆菌(Escherichiacoli)核糖体RNA(rrnB)。用于丝状真菌宿主细胞的优选终止子从下述基因获得：构巢曲霉(Aspergillusnidulans)邻氨基苯甲酸合酶，黑曲霉(Aspergillusniger)葡糖淀粉酶，黑曲霉(Aspergillusniger)α-葡萄糖苷酶，米曲霉(Aspergillusoryzae)TAKA淀粉酶和尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)胰蛋白酶样蛋白酶。用于酵母宿主细胞的优选终止子从下述基因获得：啤酒糖酵母(Saccharomycescerevisiae)烯醇酶，啤酒糖酵母(Saccharomycescerevisiae)细胞色素C(CYC1)和啤酒糖酵母(Saccharomycescerevisiae)甘油醛-3-磷酸脱氢酶。Romanos等，1992，同上描述了酵母宿主细胞的其他有用的终止子。所述控制序列也可以是在启动子下游和基因编码序列上游的mRNA稳定区，其提高所述基因的表达。适合的mRNA稳定区的实例从苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis)crylllA基因(WO94/25612)和枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)SP82基因(Hue等，1995，JournalofBacteriology177:3465-3471)获得。所述控制序列也可以是前导区，这是对宿主细胞的翻译来说重要的mRNA非翻译区。所述前导区被可操作地连接到编码所述差向异构酶的多核苷酸的5'-端。可以使用在宿主细胞中起作用的任何前导区。对于丝状真菌宿主细胞来说，优选的前导区从米曲霉(Aspergillusoryzae)TAKA淀粉酶和构巢曲霉(Aspergillusnidulans)磷酸丙糖异构酶的基因获得。适合用于酵母宿主细胞的前导区从下述基因获得：啤酒糖酵母(Saccharomycescerevisiae)烯醇酶(ENO-1)，啤酒糖酵母(Saccharomycescerevisiae)3-磷酸甘油酸激酶，啤酒糖酵母(Saccharomycescerevisiae)α-因子和啤酒糖酵母(Saccharomycescerevisiae)醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH2/GAP)。所述控制序列也可以是多腺苷化序列，所述序列被可操作地连接到编码所述差向异构酶的多核苷酸的3'-端，并且在转录时被宿主细胞识别为向转录的mRNA添加多腺苷残基的信号。可以使用在宿主细胞中起作用的任何多腺苷化序列。用于丝状真菌宿主细胞的优选的多腺苷化序列从下述基因获得：构巢曲霉(Aspergillusnidulans)邻氨基苯甲酸合酶，黑曲霉(Aspergillusniger)葡糖淀粉酶，黑曲霉(Aspergillusniger)α-葡萄糖苷酶，米曲霉(Aspergillusoryzae)TAKA淀粉酶和尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)胰蛋白酶样蛋白酶。Guo和Sherman，1995，Mol.CellularBiol.15:5983-5990描述了酵母宿主细胞的有用的多腺苷化序列。所述控制序列也可以是信号肽编码区，其编码连接到所述差向异构酶的N-端的信号肽并将所述差向异构酶引导到细胞的分泌途径中。所述多核苷酸的编码序列的5'-末端可以固有地含有与编码所述差向异构酶的编码序列的区段天然地连接在翻译阅读框中的信号肽编码序列。或者，所述编码序列的5'-末端可以含有对于所述编码序列来说外来的信号肽编码序列。当编码序列不天然含有信号肽编码序列时，可能需要外来的信号肽编码序列。或者，可以简单地用外来的信号肽编码序列代替天然的信号肽编码序列以便增强所述多肽的分泌。然而，可以使用引导表达的多肽进入宿主细胞的分泌途径的任何信号肽编码序列。细菌宿主细胞的有效的信号肽编码序列是从下述基因获得的信号肽编码序列：芽孢杆菌(Bacillus)NCIB11837产麦芽糖淀粉酶，地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)枯草杆菌蛋白酶，地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)β-内酰胺酶，嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillusstearothermophilus)α-淀粉酶，嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillusstearothermophilus)中性蛋白酶(nprT、nprS、nprM)和枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)prsA。Simonen和Palva，1993，MicrobiologicalReviews57:109-137描述了其他信号肽。丝状真菌宿主细胞的有效的信号肽编码序列是从下述基因获得的信号肽编码序列：黑曲霉(Aspergillusniger)中性淀粉酶，黑曲霉(Aspergillusniger)葡糖淀粉酶，米曲霉(Aspergillusoryzae)TAKA淀粉酶，特异腐质霉(Humicolainsolens)纤维素酶，特异腐质霉(Humicolainsolens)内切葡聚糖酶V，柔毛腐质霉(Humicolalanuginosa)脂肪酶和米黑根毛霉(Rhizomucormiehei)天冬氨酸蛋白酶。酵母宿主细胞的有用的信号肽从啤酒糖酵母(Saccharomycescerevisiae)α-因子和啤酒糖酵母(Saccharomycescerevisiae)转化酶的基因获得。Romanos等，1992，同上描述了其他有用的信号肽编码序列。可能还希望添加相对于宿主细胞的生长来调控所述多肽的表达的调控序列。调控系统的实例是对化学或物理刺激物、包括调控性化合物的存在作出响应而引起基因表达被打开或关闭的调控系统。原核生物系统中的调控系统包括lac、tac和trp操纵基因系统。在酵母中，可以使用ADH2系统或GAL1系统。在丝状真菌中，可以使用黑曲霉(Aspergillusniger)葡糖淀粉酶启动子、米曲霉(Aspergillusoryzae)TAKAα-淀粉酶启动子和米曲霉(Aspergillusoryzae)葡糖淀粉酶启动子。调控序列的其他实例是允许基因扩增的调控序列。在真核生物系统中，这些调控序列包括在甲氨蝶呤存在下扩增的二氢叶酸还原酶基因和使用重金属来扩增的金属硫蛋白基因。在这些情况下，将编码所述多肽的多核苷酸与所述调控序列可操作地连接。表达载体本发明还涉及重组表达载体，其包含如上所公开的核酸构建物或编码本发明的差向异构酶、启动子以及转录和翻译终止信号的多核苷酸。所述各种不同的核苷酸和控制序列可以被接合在一起以产生重组表达载体，其可以包括一个或多个方便的限制性位点，以允许在这些位点处插入或替换编码所述差向异构酶的多核苷酸。或者，可以通过将所述多核苷酸或包含所述多核苷酸的核酸构建物插入到适合于表达的载体中来表达所述多核苷酸。在特定实施方式中，所述表达载体可以还包含编码如上所公开的本发明的肽的多核苷酸，并与表达所必需的控制序列可操作地连接。更具体来说，用于本发明的差向异构酶和肽的表达的控制序列适合于在宿主细胞中共表达。任选地，编码所述肽的多核苷酸和编码所述差向异构酶的多核苷酸可以在单一启动子的控制之下(即操纵子)或在可以相同或不同的两个启动子的控制之下。可选地，本发明涉及一种试剂盒，其包含含有编码本发明的差向异构酶的核酸的第一表达载体和含有编码本发明的肽的核酸的第二表达载体。在另一个可选方式中，所述试剂盒可以包含含有编码本发明的差向异构酶的核酸和编码本发明的肽的核酸的表达载体。在产生所述表达载体时，将编码序列置于所述载体中，使得所述编码序列与适用于表达的控制序列可操作地连接。所述重组表达载体可以是可方便地进行重组DNA程序并且可以引起所述多核苷酸的表达的任何载体(例如质粒或病毒)。载体的选择通常取决于载体与所述载体将被引入到其中的宿主细胞的相容性。所述载体可以是线性或闭合环状质粒。所述载体可以是自主复制载体，即作为染色体外实体存在的载体，其复制不依赖于染色体复制，例如质粒、染色体外元件、微型染色体或人工染色体。所述载体可以含有确保自身复制的任何机构。或者，所述载体可以是在被引入到宿主细胞中时整合到基因组中并与它已被整合在其中的染色体一起复制的载体。此外，可以使用单一载体或质粒或合在一起含有待引入到宿主细胞基因组中的全部DNA的两个或更多个载体或质粒，或转座子。所述载体优选含有一个或多个可选择标记，其允许容易地选择被转化、转染、转导等的细胞。可选择标记是其产物提供杀生物剂或病毒抗性、对重金属的抗性、营养缺陷型的原养型等的基因。细菌可选择标记的实例是地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)或枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)的提供抗生素抗性例如氨苄青霉素、氯霉素、卡那霉素、新霉素、大观霉素或四环素抗性的基因或标记。用于酵母宿主细胞的适合的标记包括但不限于ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1和URA3。用于丝状真菌宿主细胞的可选择标记包括但不限于amdS(乙酰胺酶)、argB(鸟氨酸氨甲酰基转移酶)、bar(草丁膦乙酰转移酶)、hph(潮霉素磷酸转移酶)、niaD(硝酸还原酶)、pyrG(乳清苷-5'-磷酸脱羧酶)、sC(硫酸腺苷转移酶)和trpC(邻氨基苯甲酸合酶)及其等同物。优选用于曲霉(Aspergillus)细胞的是构巢曲霉(Aspergillusnidulans)或米曲霉(Aspergillusoryzae)的amdS和pyrG基因以及吸水链霉菌(Streptomyceshygroscopicus)的基因。所述载体优选地含有允许所述载体整合到宿主细胞基因组中或允许所述载体在细胞中独立于基因组自主复制的元件。当发生在宿主细胞中的整合时，所述序列在基因组中的整合可能依赖于同源或非同源重组。可选地，所述载体可以含有用于指导在染色体中的准确位置处通过同源重组整合到宿主细胞的基因组中的另外的多核苷酸。为了提高在准确位置处整合的可能性，所述整合元件应该含有足够数量例如100至10,000个碱基对、400至10,000个碱基对和800至10,000个碱基对的与相应的靶序列具有高度序列同一性的核酸，以提高同源重组的可能性。所述整合元件可以是与宿主细胞的基因组中的靶序列同源的任何序列。此外，所述整合元件可以是非编码或编码的多核苷酸。另一方面，所述载体可以通过非同源重组整合到宿主细胞的基因组中。为了自主复制，所述载体还可以包含能够使所述载体在所讨论的宿主细胞中自主复制的复制起点。所述复制起点可以是在细胞中起作用的介导自主复制的任何质粒复制子。术语“复制起点”或“质粒复制子”是指能够使质粒或载体在体内复制的多核苷酸。细菌复制起点的实例是允许在大肠埃希氏杆菌中复制的质粒pBR322、pUC19、pACYC177和pACYC184的复制起点和允许在芽孢杆菌中复制的质粒pUB110、pE194、pTA1060和pAMβ1的复制起点。在酵母宿主细胞中使用的复制起点的实例是2μ复制起点、ARS1、ARS4、ARS1与CEN3的组合、以及ARS4与CEN6的组合。在丝状真菌细胞中有用的复制起点的实例是AMA1和ANSI(Gems等，1991，Gene98:61-67；Cullen等，1987，NucleicAcidsRes.15:9163-9175；WO00/24883)。可以按照WO00/24883中公开的方法来实现AMA1基因的分离和包含所述基因的质粒或载体的构建。可以将超过一个拷贝的本发明的多核苷酸插入到宿主细胞中，以增加多肽的生产。所述多核苷酸的拷贝数的增加可以通过将至少一个另外的序列拷贝整合到宿主细胞基因组中或通过伴随着所述多核苷酸包含可扩增的可选择标记基因来获得，在后一种情况下含有所述可选择标记基因的扩增的拷贝并因此含有所述多核苷酸的另外的拷贝的细胞可以通过在适合的选择试剂的存在下培养所述细胞来选择。用于连接上述元件以构建本发明的重组表达载体的程序对于本领域技术人员来说是公知的(参见例如Sambrook等，1989，同上)。宿主细胞本发明还涉及重组宿主细胞，其包含被可操作地连接到指导本发明的差向异构酶的生产的一个或多个控制序列的编码本公开的差向异构酶的多核苷酸。将包含编码本公开的差向异构酶的多核苷酸的构建物或载体引入到宿主细胞中，使得所述构建物或载体如前所述作为染色体整合物或作为自主复制的染色体外载体得以维持。本发明还涉及一种重组宿主细胞，其还包含被可操作地连接到指导本公开的肽的生产的一个或多个控制序列的编码所述肽的多核苷酸。具体来说，所述宿主细胞可以共表达本公开的差向异构酶和肽。在这个实施方式中，所述宿主细胞产生本发明的肽和能够通过将肽的氨基酸的构型从L-构型改变成D-构型而修饰所述抗微生物肽的差向异构酶两者。在优选实施方式中，宿主细胞包含与所述宿主细胞异源的编码本发明的差向异构酶的核酸。在可选的优选实施方式中，宿主细胞包含与所述宿主细胞异源的编码肽的核酸。在另一个优选实施方式中，宿主细胞包含编码肽和差向异构酶的核酸，两者均与所述宿主细胞异源。术语“宿主细胞”涵盖了由于在复制期间发生的突变而与亲代细胞不一致的亲代细胞的任何后代。宿主细胞的选择在很大程度上取决于编码所述多肽的基因及其来源。宿主细胞可以是可用于本发明的差向异构酶的重组生产的任何细胞，例如原核细胞或真核细胞。所述原核宿主细胞可以是任何革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌。革兰氏阳性细菌包括但不限于芽孢杆菌(Bacillus)、梭菌(Clostridium)、肠球菌(Enterococcus)、地芽孢杆菌(Geobacillus)、乳杆菌(Lactobacillus)、乳球菌(Lactococcus)、海洋芽孢杆菌(Oceanobacillus)、葡萄球菌(Staphylococcus)、链球菌(Streptococcus)和链霉菌(Streptomyces)。革兰氏阴性细菌包括但不限于弯曲杆菌(Campylobacter)、大肠埃希氏杆菌(E.coli)、黄杆菌(Flavobacterium)、梭杆菌(Fusobacterium)、螺旋杆菌(Helicobacter)、泥杆菌(Ilyobacter)、奈瑟氏菌(Neisseria)、假单胞菌(Pseudomonas)、沙门氏菌(Salmonella)和脲原体(Ureaplasma)。所述细菌宿主细胞可以是任何芽孢杆菌细胞，包括但不限于嗜碱芽孢杆菌(Bacillusalkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)、短芽孢杆菌(Bacillusbrevis)、环状芽孢杆菌(Bacilluscirculans)、克劳氏芽孢杆菌(Bacillusclausii)、凝结芽孢杆菌(Bacilluscoagulans)、坚强芽孢杆菌(Bacillusfirmus)、灿烂芽孢杆菌(Bacilluslautus)、迟缓芽孢杆菌(Bacilluslentus)、地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)、巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)、短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillusstearothermophilus)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)和苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis)细胞。所述细菌宿主细胞也可以是任何链球菌细胞，包括但不限于似马链球菌(Streptococcusequisimilis)、酿脓链球菌(Streptococcuspyogenes)、乳房链球菌(Streptococcusuberis)、马链球菌(Streptococcusequi)和兽疫链球菌(Streptococcuszooepidemicus)细胞。所述细菌宿主细胞还可以是任何链霉菌细胞，包括但不限于不产色链霉菌(Streptomycesachromogenes)、阿维链霉菌(Streptomycesavermitilis)、天蓝色链霉菌(Streptomycescoelicolor)、灰色链霉菌(Streptomycesgriseus)和变铅青链霉菌(Streptomyceslividans)细胞。将DNA引入到芽孢杆菌细胞中可以通过原生质体转化(参见例如Chang和Cohen,1979,Mol.Gen.Genet.168:111-115)、感受态细胞转化(参见例如Young和Spizizen,1961,J.Bacteriol.81:823-829或Dubnau和Davidoff-Abelson,1971,J.Mol.Biol.56:209-221)、电穿孔(参见例如Shigekawa和Dower,1988,Biotechniques6:742-751)或接合(参见例如Koehler和Thorne,1987,J.Bacteriol.169:5271-5278)来执行。将DNA引入到大肠埃希氏杆菌细胞中可以通过原生质体转化(参见例如Hanahan,1983,J.Mol.Biol.166:557-580)或电穿孔(参见例如Dower等，1988，NucleicAcidsRes.16:6127-6145)来执行。将DNA引入到链霉菌细胞中可以通过原生质体转化、电穿孔(参见例如Gong等，2004，FoliaMicrobiol.(Praha)49:399-405)、接合(参见例如Mazodier等，1989,J.Bacteriol.171:3583-3585)或转导(参见例如Burke等，2001,Proc.Natl.Acad.Sci.USA98:6289-6294)来执行。将DNA引入到假单胞菌细胞中可以通过电穿孔(参见例如Choi等，2006，J.Microbiol.Methods64:391-397)或接合(参见例如Pinedo和Smets,2005,Appl.Environ.Microbiol.71:51-57)来执行。将DNA引入到链球菌细胞中可以通过自然感受(参见例如Perry和Kuramitsu,1981,Infect.Immun.32:1295-1297)、原生质体转化(参见例如Catt和Jollick,1991,Microbios68:189-207)、电穿孔(参见例如Buckley等，1999，Appl.Environ.Microbiol.65:3800-3804)或接合(参见例如Clewell,1981,Microbiol.Rev.45:409-436)来执行。然而，可以使用本领域中已知的用于将DNA引入到宿主细胞中的任何方法。所述宿主细胞也可以是真核生物，例如哺乳动物、昆虫、植物或真菌细胞。所述宿主细胞可以是真菌细胞。当在本文中使用时，“真菌”包括子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basidiomycota)、壶菌门(Chytridiomycota)和接合菌门(Zygomycota)以及卵菌门(Oomycota)和所有有丝分裂孢子真菌(如Hawksworth等，在《Ainsworth和Bisby真菌词典》(AinsworthandBisby'sDictionaryofTheFungi)，第8版，1995,CABInternational,UniversityPress,Cambridge,UK中所定义)。所述真菌宿主细胞可以是酵母细胞。当在本文中使用时，“酵母”包括产子囊孢子酵母(内孢霉目(Endomycetales))、产担子酵母和属于不完全菌纲的酵母(芽孢菌纲(Blastomycetes))。由于酵母的分类在将来可能改变，出于本发明的目的，酵母应该如《酵母的生物学和活性》(BiologyandActivitiesofYeast)(Skinner，Passmore和Davenport主编，Soc.App.Bacteriol.SymposiumSeriesNo.9,1980)中所定义。所述酵母宿主细胞可以是假丝酵母(Candida)、汉逊酵母(Hansenula)、克鲁维酵母(Kluyveromyces)、毕赤酵母(Pichia)、糖酵母(Saccharomyces)、裂殖糖酵母(Schizosaccharomyces)或耶氏酵母(Yarrowia)细胞，例如乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyceslactis)、卡尔斯伯糖酵母(Saccharomycescarlsbergensis)、啤酒糖酵母(Saccharomycescerevisiae)、糖化糖酵母(Saccharomycesdiastaticus)、道格拉斯糖酵母(Saccharomycesdouglasii)、克鲁弗糖酵母(Saccharomyceskluyveri)、诺地糖酵母(Saccharomycesnorbensis)、卵形糖酵母(Saccharomycesoviformis)或解脂耶氏酵母(Yarrowialipolytica)细胞。所述真菌宿主细胞可以是丝状真菌细胞。“丝状真菌”包括真菌亚门(Eumycota)和壶菌亚门(Oomycota)(如Hawksworth等，1995，同上所定义)的所有丝状形式。丝状真菌通常以由几丁质、纤维素、葡聚糖、壳聚糖、甘露聚糖和其他复杂多糖构成的菌丝体壁为特征。所述丝状真菌宿主细胞可以是支顶孢(Acremonium)、曲霉(Aspergillus)、短梗霉(Aureobasidium)、烟管霉(Bjerkandera)、拟蜡菌(Ceriporiopsis)、金孢霉(Chrysosporium)、鬼伞(Coprinus)、革盖菌(Coriolus)、隐球菌(Cryptococcus)、Filibasidium、镰刀菌(Fusarium)、腐质霉(Humicola)、稻瘟菌(Magnaporthe)、毛霉(Mucor)、毁丝霉(Myceliophthora)、新美鞭菌(Neocallimastix)、脉孢菌(Neurospora)、拟青霉(Paecilomyces)、青霉(Penicillium)、平革菌(Phanerochaete)、白腐菌(Phlebia)、梨囊鞭菌(Piromyces)、侧耳(Pleurotus)、裂褶菌(Schizophyllum)、篮状菌(Talaromyces)、嗜热子囊菌(Thermoascus)、梭孢壳(Thielavia)、弯颈霉(Tolypocladium)、栓菌(Trametes)或木霉(Trichoderma)细胞。例如，所述丝状真菌宿主细胞可以是泡盛曲霉(Aspergillusawamori)、臭曲霉(Aspergillusfoetidus)、烟曲霉(Aspergillusfumigatus)、日本曲霉(Aspergillusjaponicus)、构巢曲霉(Aspergillusnidulans)、黑曲霉(Aspergillusniger)、米曲霉(Aspergillusoryzae)、Bjerkanderaadusta、干拟蜡菌(Ceriporiopsisaneirina)、Ceriporiopsiscaregiea、Ceriporiopsisgilvescens、Ceriporiopsispannocinta、Ceriporiopsisrivulosa、Ceriporiopsissubrufa、虫拟蜡菌(Ceriporiopsissubvermispora)、Chrysosporiuminops、嗜角质金孢霉(Chrysosporiumkeratinophilum)、Chrysosporiumlucknowense、粪状金孢霉(Chrysosporiummerdarium)、Chrysosporiumpannicola、Chrysosporiumqueenslandicum、热带金孢霉(Chrysosporiumtropicum)、环纹金孢霉(Chrysosporiumzonatum)、灰盖鬼伞(Coprinuscinereus)、毛革盖菌(Coriolushirsutus)、Fusariumbactridioides、禾谷镰刀菌(Fusariumcerealis)、克地镰刀菌(Fusariumcrookwellense)、黄色镰刀菌(Fusariumculmorum)、禾本科镰刀菌(Fusariumgraminearum)、禾赤镰刀菌(Fusariumgraminum)、异孢镰刀菌(Fusariumheterosporum)、合欢木镰刀菌(Fusariumnegundi)、尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)、多枝镰刀菌(Fusariumreticulatum)、粉红镰刀菌(Fusariumroseum)、接骨木镰刀菌(Fusariumsambucinum)、肤色镰刀菌(Fusariumsarcochroum)、拟枝孢镰刀菌(Fusariumsporotrichioides)、硫色镰刀菌(Fusariumsulphureum)、Fusariumtorulosum、拟丝孢镰刀菌(Fusariumtrichothecioides)、Fusariumvenenatum、特异腐质霉(Humicolainsolens)、柔毛腐质霉(Humicolalanuginosa)、米黑毛霉(Mucormiehei)、嗜热毁丝霉(Myceliophthorathermophila)、粗糙脉孢菌(Neurosporacrassa)、产紫青霉(Penicilliumpurpurogenum)、黄孢原毛平革菌(Phanerochaetechrysosporium)、射脉侧菌(Phlebiaradiata)、刺芹侧耳(Pleurotuseryngii)、太瑞斯梭壳孢(Thielaviaterrestris)、长绒毛栓菌(Trametesvillosa)、变色栓菌(Trametesversicolor)、哈茨木霉(Trichodermaharzianum)、康氏木霉(Trichodermakoningii)、长梗木霉(Trichodermalongibrachiatum)、里氏木霉(Trichodermareesei)或绿色木霉(Trichodermaviride)细胞。真菌细胞可以通过包括原生质体形成、原生质体转化和细胞壁以本身已知的方式再生的过程来转化。在EP238023，Yelton等，1984,Proc.Natl.Acad.Sci.USA81:1470-1474和Christensen等，1988,Bio/Technology6:1419-1422中描述了适合于转化曲霉和木霉宿主细胞的程序。Malardier等，1989,Gene78:147-156和WO96/00787描述了适合于转化镰刀菌物种的方法。酵母可以使用下述文献描述的程序来转化：Becker和Guarente，在Abelson,J.N.和Simon,M.I.主编的《酵母遗传学和分子生物学指南》(GuidetoYeastGeneticsandMolecularBiology)中，MethodsinEnzymology,Volume194,pp182-187,AcademicPress,Inc.,NewYork；Ito等，1983，J.Bacteriol.153:163；和Hinnen等，1978，Proc.Natl.Acad.Sci.USA75:1920。所述细胞也可以是哺乳动物细胞例如COS、CHO(US4,889,803；US5,047,335)。在特定实施方式中，所述细胞是非人类和非胚胎的。此外，本发明的差向异构酶可以通过非人类转基因动物来生产，例如在由动物生产的奶中。所述细胞可以是植物细胞。因此，本发明的差向异构酶可以通过转基因植物来生产。可选地，还提供了一种用于生产本发明的差向异构酶的方法，所述方法包括将如上所定义的宿主细胞在有利于生产所述差向异构酶的条件下培养，并回收和/或纯化所述差向异构酶。可选地，还提供了一种用于生产本发明的差向异构酶的方法，所述方法包括使用如上所定义的编码差向异构酶的核酸在体外表达所述差向异构酶。任选地，所述方法还包括将所述差向异构酶固定化在固体支持物上的步骤。所述酶可以使用本领域中已知的方法来回收。例如，可以通过常规程序从营养培养基中回收所述酶，所述程序包括但不限于收集、离心、过滤、抽提、喷雾干燥、蒸发或沉淀。所述酶可以通过本领域中已知的各种不同程序来纯化，所述程序包括但不限于层析(例如离子交换、亲和、疏水、层析聚焦和尺寸排阻)、电泳程序(例如制备型等电聚焦)、差异溶解度(例如硫酸铵沉淀)、SDS-PAGE或抽提(参见例如《蛋白质纯化》(ProteinPurification)，Janson和Ryden主编，VCHPublishers,NewYork,1989)，以获得实质上纯的多肽。在可选情况下，不回收所述酶，而是将本发明的表达所述酶的宿主细胞用作酶源。还提供了一种组合物或试剂盒，其包含分离或重组的如上所定义的差向异构酶。具体来说，所述组合物或试剂盒可以包括作为酶添加剂的铁(例如(NH4)2Fe(SO4)2)和硫(例如Na2S)以及还原剂例如二硫苏糖醇或β-巯基乙醇。此外，所述组合物可以包括酶的辅因子——S-腺苷L-甲硫氨酸(SAM)，或者当存在SAM合酶时包括甲硫氨酸和ATP。任选地，所述差向异构酶可以被固定化在固体支持物上。本发明还涉及如上所定义的差向异构酶，包含所述差向异构酶的组合物、试剂盒或固体支持物，或者包含含有编码如上所定义的差向异构酶的核酸序列的核酸、重组核酸构建物或重组载体的重组宿主细胞在生产具有D-构型氨基酸的肽中的用途。所述差向异构酶用于将肽中的L-氨基酸转变成D-氨基酸的用途因此，本发明涉及本发明的差向异构酶用于将肽中的L-氨基酸转变成D-氨基酸的用途。本发明还涉及一种用于将肽中的L-氨基酸转变成D-氨基酸的方法，所述方法包括将本发明的差向异构酶与所述肽相接触，并任选地回收至少一个氨基酸从L-构型转变成D-构型的肽。在优选实施方式中，本发明涉及一种用于制备本发明的肽的方法，其中所述方法包括将本发明的肽与如上所定义的差向异构酶相接触的步骤。本发明还涉及如上所定义的差向异构酶在制备本发明的肽中的用途。具体来说，所述肽可以具有如上所定义的任何特定序列。优选地，所述方法在体外进行。在第一个实施方式中，所述肽包含与SEQIDNo1的第33至49位的序列具有至少40％同一性的17个残基的序列，并且所述序列包含序列W-Y-F-[V/I/A](SEQIDNo71)和W-[I/V/A]-X4-G-S(SEQIDNo69)以及在SEQIDNo69与SEQIDNo71之间的4-8个氨基酸的连接序列，其中X4是任何氨基酸。在第二个实施方式中，所述肽包含与SEQIDNo1的第26至49位的序列具有至少40％同一性的24个残基的序列，并包含序列N/D-D-L-W-Y-F-[V/I/A](SEQIDNo21)和W-I/V-X4-G-S(SEQIDNo22)，其中X4是任何氨基酸。最后，本发明涉及一种用于制备本发明的肽的方法，其中所述方法包括将本发明的重组宿主细胞在适合于所述肽和所述差向异构酶共表达的条件下进行培养，并回收具有至少一个D-构型氨基酸的肽。优选地，所述方法离体进行。本发明还涉及本发明的重组宿主细胞在制备如上所定义的肽中的用途。在特定情况下，差向异构酶和肽的来源可以是匹配的。例如，来自于枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)的差向异构酶可以优选地用于制备来自于或源自于枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)的肽。在这种特定情况下，如果如上所定义的肽包含与选自SEQIDNo1-5或其至少24个连续残基的片段的序列具有至少80、85、90或95％同一性的序列，则所选的差向异构酶与选自SEQIDNo25-35的序列具有至少80、85、90或95％的同一性。如果如上所定义的肽包含与选自SEQIDNo6-9或其至少24个连续残基的片段的序列具有至少80、85、90或95％同一性的序列，则所选的差向异构酶与选自SEQIDNo36-38的序列具有至少80、85、90或95％的同一性。如果如上所定义的肽包含与SEQIDNo10或其至少24个连续残基的片段的序列具有至少80、85、90或95％同一性的序列，则所选的差向异构酶与选自SEQIDNo39-40的序列具有至少80、85、90或95％的同一性。如果如上所定义的肽包含与选自SEQIDNo11-13和17-18或其至少24个连续残基的片段的序列具有至少80、85、90或95％同一性的序列，则所选的差向异构酶与选自SEQIDNo41-50的序列具有至少80、85、90或95％的同一性。如果如上所定义的肽包含与选自SEQIDNo14-16或其至少24个连续残基的片段的序列具有至少80、85、90或95％同一性的序列，则所选的差向异构酶与SEQIDNo51的序列具有至少80、85、90或95％的同一性。如果如上所定义的肽包含与SEQIDNo19或其至少24个连续残基的片段的序列具有至少80、85、90或95％同一性的序列，则所选的差向异构酶与SEQIDNo52的序列具有至少80、85、90或95％的同一性。定义约：当在本文中使用时，“约”是指多或少10％，优选地多或少5％。例如，约100是指在90至110之间，优选地在95至105之间。“由……构成”、“基本上由……构成”或“实质上包含”：在本文中使用这些术语对本发明的任何情况或实施方式的描述，例如对一种或多种要素的指称，旨在为本发明的由该一种或多种特定要素构成、基本上由所述要素构成或实质上包含所述要素的类似的情况或实施方式提供支持，除非另有陈述或与上下文明显冲突。例如，本文中被描述为包含特定序列的肽或蛋白质应该被理解为也描述了由该序列构成的肽或蛋白质，除非另有陈述或与上下文明显冲突。“基本上由……构成”意指所述肽或蛋白质由该序列构成，但它也可以包括1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个替换、添加或缺失。具体来说，“基本上由……构成”可以意指所述肽可以在N或C-端末端处包括1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个另外的氨基酸并包含1、2或3个替换、缺失或添加。编码序列：术语“编码序列”是指直接规定多肽的氨基酸序列的多核苷酸。所述编码序列的边界通常由开放阅读框决定，其始于起始密码子例如ATG、GTG或TTG并止于终止密码子例如TAA、TAG或TGA。所述编码序列可以是基因组DNA、cDNA、合成的DNA或其组合。控制序列：术语“控制序列”是指编码本发明的差向异构酶的多核苷酸的表达所必需的核酸序列。控制序列对于编码所述差向异构酶的多核苷酸来说可以是本源的(即来自于同一基因)或异源的(即来自于不同基因和/或不同物种)。优选地，控制序列是异源的。公知的和本领域技术人员目前使用的控制序列是优选的。这些控制序列包括但不限于前导序列、多腺苷化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列和转录终止子。至少，所述控制序列包括启动子以及转录和翻译终止信号。出于引入特定限制性位点以便于所述控制序列与编码所述差向异构酶的多核苷酸的编码区的连接的目的，所述控制序列可以被提供有连接物。控制序列和编码序列的功能性组合可以被称为表达盒。表达：术语“表达”包括多肽生产中涉及的任何步骤，包括但不限于转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰和分泌。表达载体：术语“表达载体”是指包含编码本发明的差向异构酶并与提供其表达的控制序列可操作地连接的多核苷酸的线性或环状DNA分子。因此，所述表达载体包含适合于表达本发明的差向异构酶的表达盒。分离的：术语“分离的”是指物质处于在自然界中不存在的形式或环境下。分离的物质的非限制性实例包括(1)任何非天然存在的物质；(2)至少部分移除了与其在自然界中相伴的一种或多种或所有天然存在的组成成分的任何物质，包括但不限于任何酶、变体、核酸、蛋白质、肽或辅因子；(3)相对于自然界中存在的物质通过人工修饰过的任何物质；或(4)通过相对于与其天然相伴的其他组分提高所述物质的量而修饰过的任何物质(例如编码所述物质的基因的多个拷贝；使用与天然伴随着编码所述物质的基因的启动子相比更强的启动子)。重组体：重组体是指通过遗传工程产生的核酸构建物、载体和蛋白质。异源的：在宿主细胞、载体或核酸构建物的情况下，它是指通过遗传工程引入到所述宿主细胞、载体或核酸构建物中的所述差向异构酶/肽的编码序列。在宿主细胞的情况下，它可以表示所述差向异构酶/肽的编码序列源自于与它被引入的细胞不同的来源。例如，将来自于枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)的差向异构酶在大肠埃希氏杆菌中表达。或者，它也可以表示所述差向异构酶/肽的编码序列来自于与它被引入的细胞相同的物种，但是由于它的环境不是天然的，例如由于它在不是其天然启动子的启动子的控制之下，或者被引入到不同于其天然位置的位置处，因此被认为是异源的。核酸构建物：术语“核酸构建物”是指包含一个或多个控制序列的单链或双链的核酸分子，其被修饰成以不是原本存在于自然界中的方式含有核酸区段，或者是合成的。可操作地连接：术语“可操作地连接”是指将控制序列置于相对于编码序列适合的位置处，使得所述控制序列指导所述编码序列的表达的配置。序列同一性：两个氨基酸序列之间的序列同一性通过参数“序列同一性”来描述。出于本发明的目的，两个氨基酸序列(A)与(B)之间的“同一性百分数”，通过将以最佳方式比对的两个序列通过比较窗口进行比较来确定。所述序列的比对可以通过公知的方法来进行，例如使用Needleman-Wunsch的用于全局比对的算法。蛋白质分析软件使用被指派给各种不同替换、缺失和其他修饰(包括保守氨基酸替换)的相似性的度量来匹配相似的序列。一旦获得总体比对，同一性的百分数可以通过用所比对的相同的氨基酸残基的总数除以在序列(A)和(B)之间最长的序列中包含的残基的总数来获得。序列同一性通常使用序列分析软件来确定。为了比较两个氨基酸序列，人们可以使用例如用于蛋白质的成对序列比对的工具“Embossneedle”，其由EMBL-EBI提供并且可以在：www.ebi.ac.uk/Tools/services/web/toolform.ebi？tool＝emboss_needle&context＝protein上获得，并使用缺省设置：(I)矩阵：BLOSUM62，(ii)空位开放：10，(iii)空位扩展：0.5，(iv)输出格式：成对，(v)末端空位罚分：假，(vi)末端空位开放：10，(vii)末端空位扩展：0.5。或者，序列同一性也可以典型地使用序列分析软件ClustalOmega来确定，所述软件使用HHalign算法及其缺省设置作为其核心比对引擎。所述算法及其缺省设置描述在J.(2005)“通过HMM–HMM比较进行蛋白质同源性检测”(ProteinhomologydetectionbyHMM–HMMcomparison)，Bioinformatics21,951-960中。氨基酸：本文中定义的氨基酸序列由如下所示的单字母符号表示：A，Ala,(丙氨酸)；R，Arg，(精氨酸)；N，Asn，(天冬酰胺)；D，Asp，(天冬氨酸)；C，Cys，(半胱氨酸)；Q，Gln，(谷氨酰胺)；E，Glu，(谷氨酸)；G，Gly，(甘氨酸)；H，His，(组氨酸)；I，Ile，(异亮氨酸)；L，Leu，(亮氨酸)；K，Lys，(赖氨酸)；M，Met，(甲硫氨酸)；F，Phe，(苯丙氨酸)；P，Pro，(脯氨酸)；S，Ser，(丝氨酸)；T，Thr，(苏氨酸)；W，Trp，(色氨酸)；Y，Tyr，(酪氨酸)；和V，Val，(缬氨酸)。保守的：保守的氨基酸意指将限定的序列与参比序列比对，并且所述限定的序列的与所述参比序列中指明的位置相对应的残基与所述参比序列中存在的残基是一致的。所述比对可以通过任何可用方法，特别是通过上文中刚刚为同一性确定所公开的方法，更优选地通过ClustalOmega来进行。所述参比序列中的残基位置被指明。当在本文中使用时，术语“抗微生物”是指抗细菌、抗病毒、抗真菌和/或抗寄生虫活性。所述活性可以通过测量不同参数例如IC50或MIC来评估。“IC50”或“半最高抑制浓度”是将微生物群体的体外生长降低一半所需的物质浓度。“MIC”或“最低抑制浓度”是在物质存在下，通常在37℃下温育18小时后完全抑制微生物生长的所述物质的最低浓度。当在本文中使用时，术语“50％致死浓度”或“LC50”是指杀死一半的群体所需的物质浓度。LC50是物质毒性的定量指标。具体来说，LC50在本文中用于评估AMP的细胞裂解活性，并且在这种情况下对应于引起一半的细胞群体裂解的肽的浓度。附图说明图1.YydG的纯化、光谱分析和活性。(图1A)yydFGHIJ操纵子的结构。yydF：假设的肽，yydG：游离基SAM酶，yydH：蛋白酶，yydIJABC型转运蛋白。(图1B)在大肠埃希氏杆菌中表达的纯化的YydG的凝胶电泳分析。(图1C)厌氧重构的YydG的UV-可见光谱。(图1D)在特别是枯草芽孢杆菌(B.subtilis)和葡萄球菌(Staphylococci)物种中发现的近缘YydF同源物的多重比对。在存在或不存在连二亚硫酸钠(2mM)的情况下在厌氧条件下温育4小时后(图1E)SAM切割的HPLC分析(257nm)和(图1F)在反应中产生的肽(280nm)。(图1G)通过反相HPLC定量并通过UV-可见光检测(280nm)监测的5'-dA(■)和修饰肽(◆)的生产的时间过程。将YydG(100μM)与连二亚硫酸钠(2mM)在厌氧条件下，在1mM底物YydF18-49存在下进行温育。(图1H&I)与(图1H)YydF或(图1I)截短形式的YydF18-49温育的YydG的HPLC分析。YydG在厌氧重构后，在厌氧条件下，在DTT(6mM)和SAM(1mM)存在下，在有或没有连二亚硫酸钠(2mM)的情况下温育。图2-YydG催化H原子向肽骨架转移。(图2A)YydF18-49或(图2B)YydF18-49在与YydG温育后的胰蛋白酶解肽图谱和LC-MS分析。数字指示每种肽的m/z值。粗体序列指示通过LC-MS鉴定到的相关肽(即肽1：NH2-GLLDESQK，[M+H]+＝931.48；肽2：VNDLWYF，[M+2H]2+＝592.31；肽3：WILGSGH-Ac，[M+H]+＝768.41)。(图2C)肽YydF18-49在与YydG在氘化缓冲液中温育后的LC-MS分析。(图2D)YydF18-49在与YydG在氘化缓冲液中温育后的胰蛋白酶解肽图谱和LC-MS分析。图3-YydG催化氨基酸差向异构化。(图3A)L-Ile/D-allo-Ile和(图3B)L-/D-Val(上方迹线)与在将YydF18-49与rSAM酶YydG在氘化缓冲液中温育后获得的氨基酸(下方迹线)进行比较的LC-MS/MS分析。所述氨基酸通过N-α-(2,4-二硝基-5-氟苯基)-L-缬氨酰胺(L-FDVA)进行衍生并通过LC-MS作为FDVA-衍生物检测。图4-YydG突变体的活性。(图4A)YydG的序列，其中半胱氨酸残基被突出显示。(图4B)纯化的突变酶的凝胶电泳分析。(图4C)A3(即AxxxAxxA)(蓝色迹线)、C22A(绿色迹线)、C222A(红色迹线)和C223A(紫色迹线)突变体在厌氧重构后的UV-可见光谱。(图4D)在将YydF18-49与4种突变体在SAM(1mM)和连二亚硫酸钠存在下温育后，反应的HPLC分析。(图4E)由C223A突变体产生的肽的LC-MS分析以及它们相应的质量和序列。图5-YydG的YydF18-49的活性。(图5A)枯草芽孢杆菌在YydF18-49或差向异构化产物YydFb存在下的平板生长抑制测定。(图5B)枯草芽孢杆菌在LB培养基中在以下情况下的生长：在不存在肽的情况下(□)或在存在具有游离C-端的YydF18-49：Ac-GLLDESQKLAKVNDLWYFVKSKENRWILGSGH(SEQIDNo20)的情况下，所述肽不含修饰(■)、含有D-allo-Ile(◆)、D-Val(◇)或两个差向异构化的残基：Ac-GLLDESQKLAKVNDLWYF{d-V}KSKENRW{d-I}LGSGH(SEQIDNo20)(▲)。所述OD值是3个独立培养物的平均值。图6-在特别是枯草芽孢杆菌(B.subtilis)和葡萄球菌(Staphylococci)物种中发现的近缘YydG同源物的多重比对。图7–从枯草芽孢杆菌分离的并被命名为YydF33-49的YydF肽的质谱分析。(a)由枯草芽孢杆菌分泌的所述肽，(b)含有两个D-氨基酸残基的合成的YydF33-49DD肽和(c)合成的YydF33-49肽的LC-MS/MS分析。相关的离子被注明。完整的指派参见表1。在所述肽序列中，具有D-构型的氨基酸用灰色标明。图8–(A)枯草芽孢杆菌在液体LB培养基中，在YydF33-49或YydF33-49DD存在下的生长。将枯草芽孢杆菌生长在单独的LB培养基(◆)、存在YydF33-49(□)或YydF33-49DD(■)的培养基中。每个测量值是三个生长实验的平均值并且SD被注明。差向异构化的残基用黑体表示。(b)枯草芽孢杆菌在存在YydF18-49(100μM)或YydF18-49DD(100、10或1μM)的情况下的生长比率。比率通过与在不存在肽的情况下的生长进行比较来确定。(c)枯草芽孢杆菌在存在YydF33-49或YydF33-49DD(100、10、1、0.1或0.01μM)的情况下的生长比率。比率通过与在不存在肽的情况下的细菌生长进行比较来确定。图9-枯草芽孢杆菌在液体LB培养基中，在存在YydF18-49(□)的情况下或在生长3小时后添加(箭头)YydF18-49DD(■)后的生长。每个测量值是三个生长实验的平均值并且SD被注明。图10-枯草芽孢杆菌在液体LB培养基中，在存在100μM的YydF33-49(a)、YydF33_49AA(b)、YydF33_49VV(c)、YydF33_49II(d)、肽-SA1(e)、肽-SA2(f)、肽-SE(g)或肽-SP(h)的情况下的生长。粗体表示差向异构化的残基。图11-粪肠球菌(Enterococcusfaecalis)在液体BHI培养基中，在存在100μM的YydF33-49(a)、YydF33_49AA(b)、YydF33_49VV(c)、YydF33_49II(d)、肽-SA1(e)、肽-SA2(f)、肽-SE(g)或肽-SP(h)的情况下的生长。粗体表示差向异构化的残基。图12-无乳链球菌(Streptococcusagalactiae)在液体BHI培养基中，在存在100μM的YydF33-49(a)、YydF33_49AA(b)、YydF33_49VV(c)、YydF33_49II(d)、肽-SA1(e)、肽-SA2(f)、肽-SE(g)或肽-SP(h)的情况下的生长。粗体表示差向异构化的残基。实施例实施例1在这里，本发明人显示，常用的实验室菌株枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)能够生产含有D-氨基酸的新型生物活性肽，尽管是核糖体起源的。这种肽被属于游离基SAM酶超家族的新型酶翻译后修饰。他们证实了这种新型酶使用前所未有的基于游离基的机制来将L-异亮氨酸和L-缬氨酸残基转变成D-别异亮氨酸和D-缬氨酸。他们确立了这种酶产生5'-脱氧腺苷游离基来催化CαH原子提取，导致形成以碳为中心的游离基。诱变实验支持这种酶具有两个必需的[4Fe-4S]中心，并允许鉴定催化循环的终止所需的关键的H原子供体。最后，以独一无二的方式，他们发现D-氨基酸的存在是这种生物活性肽的活性所需要的，其可能诱导LiaRS这种细菌细胞壁完整性的主要组分。枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)的Lia系统是一种由双组分系统(LiaRS)和抑制性蛋白(LiaF)构成的细胞被膜应激模块。这种遗传系统在厚壁菌门中高度保守，并且是统筹细胞壁应激反应的复杂调控网络的一部分。尽管它的调控已被极其详细地描述，但它在枯草芽孢杆菌中的准确生理作用尚未被充分理解。LiaRS被靶向细胞壁的抗生素例如尼生素、万古霉素或枯草杆菌肽特异且强烈诱导，并因此已被开发作为细胞壁抗生素的生物传感器和高通量筛选工具。在感应到抗生素后，LiaRS转导细胞被膜应激信号，激活可能维持细胞壁完整性的基因表达，但是它不提供抗生素抗性。在鉴定参与LiaRS调控的基因的尝试中，在枯草芽孢杆菌中进行了诱变研究，并导致yydFGHIJ操纵子的发现(Butcher等，2007，JBacteriol,189,8616)。这个操纵子对LiaRS显示出正调控，并具有编码假定肽(YydF)的遗传系统的所有特征性特点，所述肽被游离基SAM酶和蛋白酶(分别为YydG和YydH)修饰，然后通过ABC型转运蛋白(YydIJ)最后输出到细胞外介质中，尽管这些组分都尚未被分离或调查(图1A)。游离基SAM酶是一种新出现的酶家族，其催化多种多样的蛋白质和肽修饰例如氧化、不寻常的甲基转移反应或硫醚键形成。它们作为所谓的RiPP(核糖体合成且翻译后修饰的肽)的生物合成的主要参与者出现，所述RiPP参与没有其他酶能够执行的化学激惹反应。为了调查所述假定的游离基SAM酶YydG的生物学作用和催化功能，本发明人在大肠埃希氏杆菌中过表达了所述蛋白质，并测定它针对YydF肽的活性。纯化的蛋白质(图1B)具有游离基SAM酶的与众不同的光谱性质，在320和420nm处具有电荷转移吸收带(图1C)。基于[4Fe-4S]2+簇的410～15,000M-1cm-1的摩尔消光系数，所述酶在厌氧重构后似乎具有1到2个[4Fe-4S]中心(图1C)。基因组挖掘揭示出yydF和yydG也存在于几种革兰氏阳性病原体例如粪肠球菌(Enterococcusfaecalis)和几种链球菌和葡萄球菌(包括无乳链球菌(S.agalactiae)和表皮葡萄球菌(S.epidermidis))中。YydF同源物的序列比对表明推测的前导序列位于N-端部分中，并且高度保守的基序位于从17位残基到肽的末端(图1D)。本发明人测定了用全长YydF肽或涵盖第18至49位的保守氨基酸残基的被我们称为YydF18-49的截短形式所重构的酶。正如所示(图1E)，在厌氧和还原条件下，YydG产生了预期的由S-腺苷-L-甲硫氨酸(SAM)的均裂切割产生的5'-脱氧腺苷(5'-dA；在12.3min洗脱)以及在46、47.6和48min洗脱的三种肽衍生物YydFa、YydFb和YydFc(图1E、F、G和H)。所述三种肽的形成严格依赖于作为单电子供体的连二亚硫酸钠的存在，并且使用YydF或YydF18-49获得了类似产物(图1F、G和H)。反应的动力学分析显示，YydG对每摩尔修饰的产物产生1摩尔5'-dA，并且在体外条件下催化几次周转，尽管随着反应进行发生未偶联的SAM切割(图1G)。这些结果证实，在体外，YydG使用SAM通过基于游离基的机制来修饰YydF。由于YydF18-49被证明是更好的底物并且更容易表征，因此我们决定使用它来鉴定由YydG催化的修饰。形成的所述三种肽的质谱检查揭示出与底物(YydF18-49[M+3H]3+＝1258.92)相比没有质量差异。这与众所周知的催化肽或蛋白质的翻译后修饰例如交联、氧化或甲基化的rSAM酶相反(7、9、14-16)。所述底物的胰蛋白酶解肽图谱给出在22、27和19.2min洗脱的三种肽(肽1：[M+H]+＝931.48，肽2：[M+H]2+＝592.31，肽3：[M+H]+＝768.41)，如图2A上所示。与酶法修饰的肽的比较显示出现了两个新的肽(即肽2*和肽3*)，其具有与肽2和3相同的分子量，但分别在26.5和23.5min洗脱(图2B)。这个结果支持YydG引入了两个修饰，一个位于内部(在肽2中)，另一个在肽的C-端末端中(在肽3中)。在进行的所有实验中，YydFc是主要产物。胰蛋白酶解肽图谱揭示出所述肽的C-端末端基本上被修饰，因为肽3*/肽3的比率比肽2*/肽2的比率大5倍(图2B)，表明YydG具有一些优选的位点。为了鉴定由YydG催化的修饰的本质和位置，本发明人在>90％的氘化缓冲液中重复了所述反应，因为已知rSAM酶在催化期间提取并且有时交换H原子。在氘化缓冲液中，YydG产生类似的产物谱，YydFc总是最丰富的产物(图2C)。有趣的是，所述反应的LC-MS分析显示，在这些条件下YydFa和YydFc具有[M+3H]3+＝1259.24的分子量并且YydFb具有[M+3H]3+＝1259.6的分子量。这对应于比底物YydF18-49([M+3H]3+＝1258.92)大1和2个道尔顿单位，明确证实了1个氘原子被并入到YydFa、YydFc中，两个氘原子被并入到YydFb中。所述反应的胰蛋白酶解肽图谱允许将氘的掺入排他地定位在分子质量迁移1个道尔顿单位的肽2*和肽3*(即[M+2H]2+＝593.04和[M+2H]+＝769.52)中(图2D)。这两种肽的LC-MS/MS片段化证实，氘掺入到肽2*中的Val36上(正如由特征性离子y1、y2+1和b7、b8+1所示)和肽3*中的Ile44上(正如由离子y5和y6+1的鉴定所示)。合在一起，这些结果证实了YydG催化两个肽的H原子被两个溶剂可交换的H原子置换。为了确定所述修饰的本质，本发明人进行了所述肽的酸水解，并在用N-α-(2,4-二硝基-5-氟苯基)-L-缬氨酰胺(L-FDVA)衍生后通过LC-MS分析了它的氨基酸含量。YydF18-49肽含有两个Val和一个Ile残基，但含有5个Leu残基，Leu残基不仅具有与Ile相同的分子量，而且在相近的保留时间洗脱。正如在图3A上所示，优化的LC-MS/MS条件允许分离和表征L-Ile和L-Leu以及它们的D-构型对应物(D-allo-Ile和D-Leu)。酶法修饰的肽的分析清楚地显示，除了鉴定到L-Ile和L-Leu之外，还形成与D-allo-Ile相对应的在27.7min洗脱的另一种产物。同样地，Val残基的分析(图3B)显示不仅存在L-Val，而且存在在26min洗脱的D-Val。因此，本发明人确定了YydG是一种游离基SAM差向异构酶，其是第一个在体外显示出在肽骨架上有活性的这种酶。所述酶催化高达～35％的Ile和～10％的Val残基的差向异构化。与这个结论相一致，当人们衍生通过在氘化缓冲液中温育YydG而被差向异构化的氨基酸时，它们的质量分析揭示出+1Da的增加(图3C和D)，与对完整肽和它们的胰蛋白酶解衍生物进行的分析(图2C和D)相一致。为了明确断定它们的身份是D-构型氨基酸，本发明人合成了在第36和44位分别含有1个D-Val和1个D-allo-Ile的YydF18-49变体肽。这种合成的肽的胰蛋白酶解肽图谱和氨基酸情况分析完全重现了酶法修饰的肽的结果(数据未示出)。在这些分析的基础上，本发明人能够将YydFa指定为在第36位含有D-Val的肽，将YydFc指定为在第44位含有D-allo-Ile的肽，并将YydFb指定为在第36和44位分别含有D-Val和D-allo-Ile的肽。因此，YydG产生含有单个或两个修饰的氨基酸的肽的混合物，其中Ile44是偏好的底物(图2C)。在氘化缓冲液中进行的差向异构化反应期间，如果本发明人确立了溶剂可交换的H原子被并入到肽骨架中，则产生的5'-dA不含显著标记，正如由LC-M分析所示。这些结果和图1G上的动力学分析与YydG产生一个5'-dA游离基(5′-dA·)以提取Val36或Ile44的CαH原子并同时形成1摩尔的5'-dA相一致。尚待解决的最后一个问题是在催化期间引入的可交换的H原子的起源。事实上，以碳为中心的游离基不可能与缓冲液组分相互作用，因为这种高反应性物质必须保持密封在酶活性位点中。本发明人倾向于蛋白质的氨基酸残基作为H原子供体和终止反应所需的游离基淬灭剂。YydG序列的严格检查指出，除了来自于游离基SAM基序的3个半胱氨酸残基之外，所述序列中只存在6个半胱氨酸(图4A)。有趣的是，两个半胱氨酸残基(即Cys22和Cys223)与另一个半胱氨酸残基相邻，其中之一在预测的含有rSAM[4Fe-4S]中心的环的内部。5个其他半胱氨酸残基在所述蛋白的C-端末端中的组织，使人联想到参与rSAM酶中的其他[4Fe-4S]中心的配位的基序。为了探测它们的功能，本发明人用丙氨酸残基替换了CxxxCxxC游离基SAM基序中的3个半胱氨酸残基Cys22、Cys222或Cys223。4个设计的突变体(即A3、C22A、C222A和C223A)被成功纯化，尽管C222A突变体被证明难以纯化并部分作为截短的形式产生(图4B)。光谱分析显示，基于其UV-可见光谱，AxxxAxxA突变体含有～1个[4Fe-4S]中心，而在C22A和C223A突变体中[4Fe-4S]中心的量高出两倍(图4C)。重要的是，有氧纯化的AxxxAxxA突变体已经含有大量的铁-硫中心，证实了在这种突变体中[4Fe-4S]中心的存在不依赖于厌氧重构。C22A和C223A突变体的UV-可见光谱与野生型酶完全重叠(图1B)，支持了YydG可能含有两个[4Fe-4S]中心的事实。C222A突变体似乎不含铁-硫中心，即使在厌氧重构之后(图4C)。C222A的最大吸收迁移到250nm，表明所述蛋白质可能折叠错误，因为这在铁-硫酶(包括rSAM酶)中参与[4Fe-4S]配位的半胱氨酸残基被突变时已被重复地报道。因此，可能Cys222参与YydG中存在的第二个[4Fe-4S]中心的配位。使用YydF18-49底物测定了所有突变体的活性(图4D)。正如预期，A3突变体不能转变所述肽底物并切割SAM。C222A突变体也完全缺少酶活性。相反，C22A突变不影响所述酶的活性，并且产生3种差向异构化的肽(即YydFa、YydFb和YydFc)。C223A突变也不阻止差向异构化活性。然而，这种酶变体产生在10min、19.8min和26min洗脱的其他肽衍生物(图4E)。高分辨率质谱术显示，这些肽与预测的水解产物相比具有-30.005Da或-1.032Da的质量迁移。它们都在C-端或N-端末端处含有截短的Val36或Ile44，即YydG酶的靶(图4E)。它们的结构被确定为：Ac-GLLDESQKLAKVNDLWYFVKSKENRWI*(SEQIDNo53)(肽G18-I44*，[M+2H]2+＝1646.3834)和I*LGSGH-NH2(SEQIDNo55)(肽G18-I44*，[M+Na]+＝603.2851)。所述截短被鉴定为由Cα-N或Cα-CO键的断裂引起的氨基酸羧基或氨基的丧失以及氨基酸Cα原子上氧原子的添加。这些结果使人联想到使用rSAM酶家族的另一个成员丙酮酸甲酸裂解酶活化酶，当反应暴露于分子氧时获得的底物片段化。他们也明确地确立了YydG在Val36和Ile44的Cα原子上产生以碳为中心的游离基，并且Cys223对反应的终止发挥关键作用。根据本发明人以前关于另一种rSAM酶——孢子光化产物裂解酶(SP裂解酶)的工作，本发明人将Cys223的作用解释为关键的H原子供体。事实上，在调查SP裂解酶的突变体时，他们已显示在不存在适合的蛋白质H原子供体的情况下，底物游离基中间体可以与偶然的游离基清除剂反应，导致各种不同加成物的形成。在这里，稳定化的Cα游离基在不存在Cys223的硫醇基的情况下，不与分子氧反应以引起这些独特的肽基骨架断裂。最后，由于已显示YydFGHIJ操纵子(图1A)在枯草芽孢杆菌中激活Lia系统，因此本发明人测定了在酶反应之前和之后YydF18-49肽对各种不同的细菌菌株的活性。他们证实，酶法差向异构化的肽或含有D-Val36和D-allo-Ile44的合成肽强烈抑制枯草芽孢杆菌的生长。相反，未修饰的YydF18-49肽没有活性(图5A)。同样地，在液体培养基中，只有差向异构化的肽被证明是有活性的，因为可以测量到强烈且持续的抑制(图5B)。为了破译这种抑制的分子基础还需要进一步的研究，但根据本发明人的了解，这是第一次证明天然差向异构化的肽是调控或抗微生物细菌肽的有活性形式。本研究证实，在本文中被称为Epipeptide的含有D-氨基酸的肽，在活的生物体，包括常用实验室细菌枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)以及许多病原性物种例如无乳链球菌(Streptococcusagalactiae)、粪肠球菌(Enterococcusfaecails)或表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)中，远比以前预期的更加常见。出人意料的是，本发明人在这里证实了D-氨基酸似乎不仅提供对蛋白酶的抗性，而且直接参与细菌的应答。实施例2文献中提出，基因yydF编码一种由枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)产生的肽(SEQIDNo1)。然而，尚未报道它的实际合成或任何翻译后修饰的证据。在将枯草芽孢杆菌(B.subtilis)在合成培养基(5X缓冲液(Na2HPO4：17g；KH2PO4：7.5g；NaCl：1.25g；NH4Cl：2.5g，在500mL中)；微量元素溶液：MnCl2：20mg；ZnCl2：34mg；CuCl2：8.6mg；CoCl2：12mg；Na2MoO4：12mg；在200mL中)中生长之后，本发明人成功地纯化了一种肽，其源自于YydF并涵盖第33至49位残基(图7)，正如通过质谱术分析确定的(表1)。该分离的肽的序列被确定为(SEQIDNo61)：SEQIDNo61：肽YydF33_49的序列此外，本发明人确定了由枯草芽孢杆菌生产的肽YydF33-49含有2个差向异构化的残基(即D-氨基酸)，其位于第36(Val)和44(Ile)位。因此，所述肽被称为YydF_33-49DD。来自于本发明人的以前的工作(实施例1)确立了所述差向异构化的残基是L-氨基酸残基被靶向氨基酸的Cα原子的独特的游离基SAM酶YydG转化的结果。目前，尚不知道由细菌产生的这种含有分立的差向异构化的短肽。由于操纵子YydFGHIJ显示出诱导双组分系统LiaRS，所述系统除了其他刺激之外还感应细菌细胞壁的完整性，因此本发明人搜索了由各种不同的YydF肽衍生物引发的推定的细菌生长抑制。初始试验使用涵盖第18-49位残基的肽(YydF18-49，SEQIDNo20)来进行。正如所示(图5B)，只有在含有两个差向异构化的残基Val36和Ile44(按照SEQIDNo61编号)的肽YydF18-49DD存在下，本发明人才监测到细菌生长抑制。存在一个差向异构化的残基或不存在差向异构化的残基不显著影响细菌生长。这第一次证实了具有差向异构化的残基的短肽可以抑制细菌生长。已确定了两个关键的差向异构化残基的存在对于抑制性质是关键的之后，本发明人合成了与枯草芽孢杆菌产生的肽的序列(SEQIDNo61)相对应的两种肽。这两种肽仅含有L-氨基酸残基(YydF33-49)或含有两个关键的差向异构化残基D-Val36和D-Ile44(YydF33-49DD)。只有YydF33-49DD肽被证明抑制细菌生长(图8a)。已证明，这种新的肽比以前测定的YydF18-49DD肽的效能强出100倍(图8b和c)，MIC<1μM。此外，本发明人显示，这些肽不仅抑制细菌生长，而且诱导细菌细胞死亡。事实上，如果在初始生长3小时后在指数中期添加YydF18-49肽(图9)，则测量到明显的减缓和随后细胞密度的降低。有趣的是，在几种革兰氏阳性细菌例如Salinibacillusaidingensis、凝结芽孢杆菌(Bacilluscoagulans)、类芽孢杆菌物种(Paenibacillussp)以及几种病原性物种例如粪肠球菌(Enterococcusfaecalis)、Enterococcuscaccae、无乳链球菌(Streptococcusagalactiae)、伪中间葡萄球菌(Staphylococcuspseudintermedius)、马胃葡萄球菌(Staphylococcusequorum)、调料葡萄球菌(Staphylococcuscondimenti)和表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)的基因组中预测了YydF肽的同源物(图1D、图6)。为了确定这些肽是否具有生物活性，本发明人在链球菌和葡萄球菌物种的基因组中鉴定到的序列的基础上合成了肽文库。他们推测这些肽应该含有与在枯草芽孢杆菌中鉴定到的相同的翻译后修饰，这是指在第4和12位具有两个D-氨基酸的17个氨基酸残基的加工过的肽(SEQIDNo62-65)。所述差向异构化的残基用粗体表示。此外，本发明人还合成了源自于枯草芽孢杆菌YydF33_49序列(SEQIDNo61)但其中两个差向异构化的残基(即Val36和Ile44)都被Val、Ile或Ala残基替换的3种非天然的肽，分别为YydF33_49VV、YydF33_49II和YydF33_49AA(SEQIDNo66-68)。所述差向异构化的残基用粗体表示。YydF33_49AAWYFAKSKENRWALGSGH(SEQIDNo66)YydF33_49VVWYFVKSKENRWVLGSGH(SEQIDNo67)YydF33_49IIWYFIKSKENRWILGSGH(SEQIDNo68)针对枯草芽孢杆菌(B.subtilis)和两种代表性革兰氏阳性病原体无乳链球菌(S.agalactiae)和粪肠球菌(E.faecalis)测定了这7种肽(SEQIDNo62-68)。正如所示，所有肽都有效地对抗枯草芽孢杆菌(B.subtilis)，包括具有非天然序列的肽(图10)。粪肠球菌(E.faecalis)的生长被肽-SA1和肽-SA2显著延迟，并且生长被肽-SE和非天然肽YydF33_49AA完全抑制(图11)。无乳链球菌(S.agalactiae)被YydF33-49DD和衍生物YydF33-49AA和YydF33-49vv抑制，但是不被YydF33-49II抑制(图12)。肽-SA1、肽-SA2、肽-SE和肽-SP这几种肽都是抑制剂。因此，本发明人证实了含有两个D-氨基酸残基的短肽是一类新的抑制肽，其能够抑制几种革兰氏阳性细菌、包括相关病原体的生长。它们不论是在开始时还是在细菌生长到指数中期后添加，都是有效的。最后，所述序列中的一些分立的修饰能够调整这些肽的抑制性质以及在属和种水平上的特异性，允许开发靶向抗生素。此外，在17个氨基酸的框架和芳香族残基(W或Y)下游的两个D-氨基酸的保守位置(在第4和12位)的基础上，本发明人还证实了可以设计具有非天然序列的肽，其被证明有效地对抗所测定的所有革兰氏阳性细菌。所述生物活性肽被证明相对于原始YydF33-49序列具有在100至58.8％之间变化的序列同一性，这意味着至少7个氨基酸残基可以被改变而不改变它们的整体抑制性质。因此，可以以前所未有的方式对这些肽进行工程改造，以靶向特定细菌属并调整它们的生物学性质。材料和方法YydG表达yydG基因被合成(LifeTechnologies)并克隆到pASK质粒中。所述质粒在大肠埃希氏杆菌BL21(DE3)star(LifeTechnologies)中表达，并且蛋白质表达在含有氨苄青霉素(100μg.mL-1)的LB培养基中进行。在21℃生长过夜后，收集细胞并在缓冲液A(Tris50mM，KCl300mM，甘油10％，pH7.5)中通过超声进行破碎。将细菌悬液以45,000xg离心1.5小时，并将蛋白质上清液装载到预先用缓冲液A平衡的Streptactin高容量(IBAGmbH)柱上。YydG蛋白用6mL含有脱硫生物素(0.6mg/mL)的缓冲液A洗脱，并用截留分子量为10kDa的Amicon浓缩器(Millipore)进一步浓缩。酶的重构YydG在BactronIV厌氧仓中，在厌氧条件下重构。将所述蛋白质与3mMDTT在12℃下混合15分钟，然后添加Na2S和(NH4)2Fe(SO4)2，并将所述溶液在12℃温育4h。酶的测定除非另有指明，否则将YydG与3mMDTT、1mMSAM和1mM肽底物温育。温育在严格厌氧条件下在25℃下进行，并且随时间取10μL等分试样。HPLC分析HPLC分析在装备有反相柱(LiChroSphere100RP-18e5μm)(MerckMillipore)的Agilent1200seriesinfinity上进行。如下使用从溶剂A(H2O，0.1％TFA)到B(80％CH3CN，19.9％H2O，0.1％TFA)的梯度：0-1min：100％A/0％B；1-45min：每分钟1％溶剂B的线性梯度，流速为1ml.min-1。在257和278nm处使用二极管阵列检测器并通过荧光(在278nm处激发并在350nm处发射)来进行检测。液相色谱–质谱/质谱分析高分辨率液相色谱–质谱/质谱分析使用带有纳升电喷雾离子源的LTQ-OrbitrapDiscovery质谱仪(ThermoFisher)和Ultimate3000LC系统(Dionex)来进行。带有纳升电喷雾离子源的LTQ质谱仪(ThermoFisher)被用于常规分析。在纳米柱Pepmap100C18(0.075乘以15cm，3μm)上进行肽分析。在固体培养基上的抑制测定将待测定的细菌菌株的过夜培养物新鲜接种到无菌BHI液体培养基。在细菌在37℃生长4小时后，将培养基稀释到1/1000并接种到在42℃预热的软琼脂糖培养基中。将含有细菌的琼脂糖培养基覆盖在以前胶化的无菌BHI琼脂糖层上。将200μg肽点样到平板上并在37℃下进行细菌生长。在液体培养基上的抑制测定将待测定的细菌菌株的过夜培养物新鲜接种到无菌LB液体培养基。在细菌在37℃生长4小时后，将培养基稀释到1/10,000，并接种到无菌液体LB或BHI培养基中。添加肽溶液(1/100)至终浓度在0.01至100μM的范围内，并使用Tecan微孔板读板器(200PROseries)连续记录600nm处的OD。表1从枯草芽孢杆菌(B.subtilis)分离的肽YydF33-49的质谱片段序列b+b++y+y++W1187.0871894.047532107.087791054.0478317Y2350.15051175.579191921.00848961.0081816F3497.21892249.113401757.94515879.4765115V4596.28734298.647601610.87674805.9423014K5724.38230362.695091511.80833756.4081013S6811.41433406.211101383.71336692.3606212K7939.50929470.258581296.68133648.8446011E81068.55188534.779881168.58637584.7971210N91182.59481591.801341039.54378520.275829R101338.69592669.85190925.50085463.254368W111524.77523762.89155769.39974385.203817I121637.85930819.43358583.32043292.164156L131750.94336875.97562470.23637235.622125G141807.96483904.48635357.15230179.080094S151894.99685948.00236300.13084150.569353G161952.01832976.51309213.09881107.053342H172089.077231045.04255156.0773578.542611(M)2106.07997(M+H)+2107.08779(M+2H)2+1054.04783(M+3H)3+703.03451(M+4H)4+527.52785序列表<110>法国农业科学研究院<120>具有抗微生物活性的新型肽和能够将肽中的L-构型残基转变成D-构型氨基酸的新型酶<130>B2146PC<160>73<170>PatentInversion3.5<210>1<211>49<212>PRT<213>枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）<400>1MetLysLysGluIleThrAsnAsnGluThrValLysAsnLeuGluPhe151015LysGlyLeuLeuAspGluSerGlnLysLeuAlaLysValAsnAspLeu202530TrpTyrPheValLysSerLysGluAsnArgTrpIleLeuGlySerGly354045His<210>2<211>49<212>PRT<213>枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）<400>2MetLysLysGluAsnThrAsnAsnGluThrValLysAsnLeuGluPhe151015LysGlyLeuLeuAspGluSerGlnLysLeuAlaLysValAsnAspLeu202530TrpTyrPheValLysSerLysGluAsnArgTrpIleLeuGlySerGly354045His<210>3<211>49<212>PRT<213>芽孢杆菌物种（Bacillussp）<400>3MetLysLysGluAsnThrAsnAsnGluThrValLysAsnLeuGluPhe151015LysGlyLeuLeuAspGluSerGlnLysLeuAlaLysValAsnAspLeu202530TrpTyrPheValLysSerGlnGluAsnArgTrpIleLeuGlySerGly354045His<210>4<211>49<212>PRT<213>枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）<400>4MetLysLysGluAsnThrAsnAsnGluProValLysAsnLeuGluPhe151015LysGlyLeuLeuAspGluSerGlnLysLeuAlaLysValAsnAspLeu202530TrpTyrPheValLysSerLysGluAsnArgTrpIleLeuGlySerGly354045His<210>5<211>49<212>PRT<213>凝结芽孢杆菌（Bacilluscoagulans）<400>5MetSerLysGluAsnThrGlnAsnSerAsnValLysAsnLeuGluPhe151015LysSerLeuValGluGluSerGlnLysLeuAlaLysValAsnAspLeu202530TrpTyrPheValLysSerLysGlyAsnArgTrpIleValGlySerGly354045His<210>6<211>54<212>PRT<213>伪中间葡萄球菌（Staphylococcuspseudintermedius）<400>6MetLysLysGluIleAsnSerTyrLysSerThrLysGluAsnThrMet151015LysAspLeuGluPheLysLysLeuValAsnAspSerGluLysLeuAla202530LysValAsnAspLeuTrpTyrPheValLysSerGlnSerAsnArgTrp354045IleValGlySerGlyHis50<210>7<211>54<212>PRT<213>马胃葡萄球菌（Staphylococcusequorum）<400>7MetLysGluAsnLeuLysValGluLysGlnAsnLysLysGluValMet151015LysAspLeuGluPheLysThrLeuIleAsnAspSerGlnLysLeuAla202530LysValAsnAspLeuTrpTyrPheValLysSerLysGlnAsnArgTrp354045ValValGlySerGlyHis50<210>8<211>62<212>PRT<213>调料葡萄球菌（Staphylococcuscondimenti）<400>8MetLysGlyLysGlyAspIleLysLysAsnLysAspValGlnIleGln151015LysLysAspLysLysAspAlaMetLysAsnLeuGluPheLysAsnLeu202530ValAsnAspSerGluLysLeuAlaLysValAsnAspLeuTrpTyrPhe354045ValLysSerLysSerHisArgTrpIleValGlySerGlyHis505560<210>9<211>54<212>PRT<213>表皮葡萄球菌（Staphylococcusepidermidis）<400>9MetAsnLysAspLeuHisAsnGlnLysAsnAsnLysGlnAspValMet151015LysAspLeuGluPheLysAsnLeuValAsnAsnSerGluLysLeuAla202530LysValAsnAspLeuTrpTyrPheValLysSerLysAlaAsnArgTrp354045ValValGlySerGlyHis50<210>10<211>42<212>PRT<213>类芽孢杆菌物种（Paenibacillussp）<400>10MetLysLysLeuGluIleLysGluLeuIleSerLysSerGluLysLeu151015AlaLysValAsnAspLeuTrpTyrPheValArgSerGlyGluGlyAla202530TrpIleValGlySerGlyGlyGlySerLys3540<210>11<211>39<212>PRT<213>Enterococcuscaccae<400>11MetLysGluLeuGluMetLysGluLeuValGluLysSerGluLysLeu151015AlaLysValAsnAspLeuTrpTyrPheValLysSerSerSerGlyAla202530TrpIleAlaGlySerGlyArg35<210>12<211>39<212>PRT<213>粪肠球菌（Enterococcusfaecalis）<400>12MetLysGluLeuGluMetLysGluLeuValGluLysSerGluLysLeu151015AlaLysIleAsnAspLeuTrpTyrPheValLysSerLysGlyGlyAla202530TrpIleAlaGlySerGlyLys35<210>13<211>49<212>PRT<213>粪肠球菌（Enterococcusfaecalis）<400>13MetTrpAsnAsnTyrLysGlyAspIleIleMetLysGluLeuGluMet151015LysGluLeuValGluLysSerGluLysLeuAlaLysIleAsnAspLeu202530TrpTyrPheValLysSerLysGlyGlyAlaTrpIleAlaGlySerGly354045Lys<210>14<211>54<212>PRT<213>无乳链球菌（Streptococcusagalactiae）<400>14MetThrIleGluIleLysAsnIleGlnArgGluValLysProIleLeu151015AsnAspMetSerPheAlaLysValLeuThrLysLysAsnLysLeuAsp202530AsnValAsnAspLeuTrpTyrPheValArgAsnSerLysAsnArgTrp354045ValAlaGlySerAlaHis50<210>15<211>52<212>PRT<213>无乳链球菌（Streptococcusagalactiae）<400>15MetLysGlnLysAsnIleGlnArgGluValLysProIleLeuAsnAsp151015MetSerPheAlaLysValLeuThrLysLysAsnGluLeuAspAsnVal202530AsnAspLeuTrpTyrPheValArgSerSerLysAsnArgTrpValAla354045GlySerAlaHis50<210>16<211>36<212>PRT<213>链球菌（Streptococcus）<400>16MetSerPheAlaLysValLeuThrLysLysAsnLysLeuAspAsnVal151015AsnAspLeuTrpTyrPheValArgAsnSerLysAsnArgTrpValAla202530GlySerAlaHis35<210>17<211>49<212>PRT<213>粪肠球菌（Enterococcusfaecalis）<400>17MetCysAsnAsnTyrLysGlyAspIleIleMetLysGluLeuGluMet151015LysGluLeuValGluLysSerGluLysLeuAlaLysIleAsnAspLeu202530TrpTyrPheValLysSerLysGlyGlyAlaTrpIleAlaGlySerGly354045Lys<210>18<211>44<212>PRT<213>粪肠球菌（Enterococcusfaecalis）<400>18MetCysAsnAsnTyrLysGlyAspIleIleMetLysGluLeuValGlu151015LysSerGluLysLeuAlaLysIleAsnAspLeuTrpTyrPheValLys202530SerLysGlyGlyAlaTrpIleAlaGlySerGlyLys3540<210>19<211>40<212>PRT<213>波西米亚双歧杆菌（Bifidobacteriumbohemicum）<400>19MetGluLysSerSerGluIleLeuAsnSerLeuGlnAlaAsnGluAsn151015ValIleAspLeuGluAspGlnAspAspLeuTrpTyrPheIleLysGly202530GlyGlyAsnTrpIleMetGlySer3540<210>20<211>32<212>PRT<213>人工序列<220><223>YyFd18-49<400>20GlyLeuLeuAspGluSerGlnLysLeuAlaLysValAsnAspLeuTrp151015TyrPheValLysSerLysGluAsnArgTrpIleLeuGlySerGlyHis202530<210>21<211>7<212>PRT<213>人工序列<220><223>基序<220><221>MISC_FEATURE<222>(1)..(1)<223>X是D或N<220><221>MISC_FEATURE<222>(7)..(7)<223>X是I、V或A<400>21XaaAspLeuTrpTyrPheXaa15<210>22<211>5<212>PRT<213>人工序列<220><223>基序<220><221>MISC_FEATURE<222>(2)..(2)<223>X是I或V<220><221>MISC_FEATURE<222>(3)..(3)<223>X是任何氨基酸<400>22TrpXaaXaaGlySer15<210>23<211>11<212>PRT<213>人工序列<220><223>基序<220><221>MISC_FEATURE<222>(2)..(2)<223>X是A、D或E<220><221>MISC_FEATURE<222>(3)..(3)<223>X是K、N或D<220><221>MISC_FEATURE<222>(4)..(4)<223>X是V、I或Q<220><221>MISC_FEATURE<222>(11)..(11)<223>X是V或I<400>23LeuXaaXaaXaaAsnAspLeuTrpTyrPheXaa1510<210>24<211>11<212>PRT<213>人工序列<220><223>基序<400>24LeuAlaLysValAsnAspLeuTrpTyrPheVal1510<210>25<211>319<212>PRT<213>枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）<400>25MetTyrAsnLysThrValSerIleAsnLeuAspSerArgCysAsnAla151015SerCysAspHisCysCysPheSerSerSerProThrSerThrThrArg202530MetGluLysGluTyrIleArgGluLeuValThrGluPheAlaLysAsn354045LysThrIleGlnValIleSerPheThrGlyGlyGluValPheLeuAsp505560TyrLysPheLeuLysGluLeuMetGluIleIleLysProTyrGluLys65707580GlnIleThrLeuIleSerAsnGlyPheTrpGlyLeuSerLysLysLys859095ValGlnGluTyrPheHisAspMetAsnSerLeuAsnValIleAlaLeu100105110ThrIleSerTyrAspGluTyrHisAlaProPheValLysSerSerSer115120125IleLysAsnIleLeuGluHisSerArgLysTyrProAspIleAspIle130135140SerLeuAsnMetAlaValThrLysAspLysMetSerAsnHisIleLeu145150155160GluGluLeuGlyAspSerIleLeuGlyValLysIleThrLysPhePro165170175MetIleSerValGlyAlaAlaLysThrArgIleLysGlnGluAsnIle180185190HisLysPheTyrSerLeuGluAspGluAspSerLeuHisCysProGly195200205TyrAspIleValTyrHisHisAspGlyGluIleTyrProCysCysSer210215220ProAlaIlePheGluThrLysIleThrLeuArgGluGluTyrAsnGln225230235240SerPheGluArgThrValGluLysLeuAsnSerAsnLeuLeuLeuPhe245250255IleLeuArgLysGluGlyPheLysTrpPheLeuAsnIleLeuLysGlu260265270AsnAsnLysIleGluGluPheAspIleProTyrGluPheSerSerIle275280285CysGlyValCysGlySerLeuPheAsnSerAlaGluLysIleAsnTyr290295300PheTyrProTyrMetGluLysTyrTyrAsnGluAsnPheLysVal305310315<210>26<211>319<212>PRT<213>枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）<400>26MetTyrAsnLysThrValSerIleAsnLeuAspSerArgCysAsnAla151015SerCysAspHisCysCysPheSerSerSerProSerSerThrThrArg202530MetGluLysGluTyrIleArgGluLeuValThrGluPheAlaLysAsn354045LysThrIleGlnValIleSerPheThrGlyGlyGluValPheLeuAsp505560TyrLysPheLeuLysGluLeuMetGluIleIleLysProTyrGluLys65707580GlnIleThrLeuIleSerAsnGlyPheTrpGlyLeuSerLysLysLys859095ValGlnGluTyrPheHisAspMetAsnSerLeuAsnValIleAlaLeu100105110ThrIleSerTyrAspGluTyrHisAlaProPheValLysSerSerSer115120125IleLysAsnIleLeuGluHisSerArgLysTyrProAspIleAspIle130135140SerLeuAsnMetAlaValThrLysAspLysMetSerAsnHisIleLeu145150155160GluGluLeuGlyAspSerIleLeuGlyValLysIleThrLysPhePro165170175MetIleSerValGlyAlaAlaLysThrArgIleLysGlnGluAsnIle180185190HisLysPheTyrSerLeuGluAspGluAspSerLeuHisCysProGly195200205TyrAspIleValTyrHisHisAspGlyGluIleTyrProCysCysSer210215220ProAlaIlePheGluThrLysIleThrLeuArgGluGluTyrAsnGln225230235240SerPheGluArgThrValGluLysLeuAsnSerAsnLeuLeuLeuPhe245250255IleLeuArgLysGluGlyPheLysTrpPheLeuAsnIleLeuLysGlu260265270AsnAsnLysIleGluGluPheAspIleProTyrGluPheSerSerIle275280285CysGlyValCysGlySerLeuPheAsnSerAlaGluLysIleAsnTyr290295300PheTyrProTyrMetGluLysTyrTyrAsnGluAsnPheLysVal305310315<210>27<211>319<212>PRT<213>枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）<400>27MetTyrAsnLysThrValSerIleAsnLeuAspSerArgCysAsnAla151015SerCysAspHisCysCysPheSerSerSerProThrSerThrThrArg202530MetGluLysGluTyrIleArgGluLeuValThrGluPheAlaLysAsn354045LysThrIleGlnValIleSerPheThrGlyGlyGluValPheLeuAsp505560TyrLysPheLeuLysGluLeuMetGluIleIleLysProTyrGluLys65707580GlnIleThrLeuIleSerAsnGlyPheTrpGlyLeuSerLysLysLys859095ValGlnGluTyrPheHisAspMetSerSerLeuAsnValIleAlaLeu100105110ThrIleSerTyrAspGluTyrHisAlaProPheValLysSerSerSer115120125IleLysAsnIleLeuGluHisSerArgLysTyrProAspIleAspIle130135140SerLeuAsnMetAlaValThrLysAspLysMetSerAsnHisIleLeu145150155160GluGluLeuGlyAspSerIleLeuGlyValLysIleThrLysPhePro165170175MetIleSerValGlyAlaAlaLysThrArgIleLysGlnGluAsnIle180185190HisLysPheTyrSerLeuGluAspGluAspSerLeuHisCysProGly195200205TyrAspIleValTyrHisHisAspGlyGluIleTyrProCysCysSer210215220ProAlaIlePheGluThrLysIleThrLeuArgGluGluTyrAsnGln225230235240SerPheGluArgThrValGluLysLeuAsnSerAsnLeuLeuLeuPhe245250255IleLeuArgLysGluGlyPheLysTrpPheLeuAsnIleLeuLysGlu260265270AsnAsnLysIleGluGluPheAspIleProTyrGluPheSerSerIle275280285CysGlyValCysGlySerLeuPheAsnSerAlaGluLysIleAsnTyr290295300PheTyrProTyrMetGluLysTyrTyrAsnGluAsnPheLysVal305310315<210>28<211>319<212>PRT<213>枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）<400>28MetTyrAsnLysThrValSerIleAsnLeuAspSerArgCysAsnAla151015SerCysAspHisCysCysPheSerSerSerProThrSerThrIleArg202530MetGluLysGluTyrIleArgGluLeuValThrGluPheAlaLysAsn354045LysThrIleGlnValIleSerPheThrGlyGlyGluValPheLeuAsp505560TyrLysPheLeuLysGluLeuMetGluIleIleLysProTyrGluLys65707580GlnIleThrLeuIleSerAsnGlyPheTrpGlyLeuSerLysLysLys859095ValGlnGluTyrPheHisAspMetAsnSerLeuAsnValIleAlaLeu100105110ThrIleSerTyrAspGluTyrHisAlaProPheValLysSerSerSer115120125IleLysAsnIleLeuGluHisSerArgLysTyrProAspIleAspIle130135140SerLeuAsnMetAlaValThrLysAspLysMetSerAsnHisIleLeu145150155160GluGluLeuGlyAspSerIleLeuGlyValLysIleThrLysPhePro165170175MetIleSerValGlyAlaAlaLysThrArgIleLysGlnGluAsnIle180185190HisLysPheTyrSerLeuGluAspGluAspSerLeuHisCysProGly195200205TyrAspIleValTyrHisHisAspGlyGluIleTyrProCysCysSer210215220ProAlaIlePheGluThrLysIleThrLeuArgGluGluTyrAsnGln225230235240SerPheGluArgThrValGluLysLeuAsnSerAsnLeuLeuLeuPhe245250255IleLeuArgLysGluGlyPheLysTrpPheLeuAsnIleLeuLysGlu260265270AsnAsnLysIleGluGluPheAspIleProTyrGluPheSerSerIle275280285CysGlyValCysGlySerLeuPheAsnSerAlaGluLysIleAsnTyr290295300PheTyrProTyrMetGluLysTyrTyrAsnGluAsnPheLysVal305310315<210>29<211>319<212>PRT<213>枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）<400>29MetTyrAsnLysThrValSerIleAsnLeuAspSerArgCysAsnAla151015SerCysAspHisCysCysPheSerSerSerProThrSerThrThrArg202530MetGluLysGluTyrIleArgGluLeuValThrGluPheAlaLysAsn354045LysThrIleGlnValIleSerPheThrGlyGlyGluValPheLeuAsp505560TyrLysPheLeuLysGluLeuMetGluIleIleLysProTyrGluLys65707580GlnIleThrLeuIleSerAsnGlyPheTrpGlyMetSerLysLysArg859095ValGlnGluTyrPheHisAspMetAsnSerLeuAsnValIleAlaLeu100105110ThrIleSerTyrAspGluTyrHisAlaProPheValLysSerSerSer115120125IleLysAsnIleLeuGluHisSerArgLysTyrProAspIleAspIle130135140SerLeuAsnMetAlaValThrLysAspLysMetSerAsnHisIleLeu145150155160GluGluLeuGlyAspSerIleLeuGlyValLysIleThrLysPhePro165170175MetIleSerValGlyAlaAlaLysThrArgIleLysGlnGluAsnIle180185190HisLysPheTyrSerLeuGluAspGluAspSerLeuHisCysProGly195200205TyrAspIleValTyrHisHisAspGlyGluIleTyrProCysCysSer210215220ProAlaIlePheGluThrLysIleThrLeuArgGluGluTyrSerGln225230235240SerPheGluArgThrValGluLysLeuAsnSerAsnLeuLeuLeuPhe245250255IleLeuArgLysGluGlyPheLysTrpPheLeuAsnIleLeuLysGlu260265270AsnAsnLysIleGluGluPheAspIleProTyrGluPheSerSerIle275280285CysGlyValCysGlySerLeuPheAsnSerAlaGluLysIleAsnTyr290295300PheTyrProTyrMetGluLysTyrTyrAsnGluAsnPheLysVal305310315<210>30<211>319<212>PRT<213>芽孢杆菌物种（Bacillussp）<400>30MetTyrAsnLysThrValSerIleAsnLeuAspSerArgCysAsnAla151015SerCysAspHisCysCysPheSerSerSerProSerSerThrThrMet202530MetGluLysGluTyrIleArgGluLeuValThrGluPheAlaLysAsn354045LysThrIleGlnValIleSerPheThrGlyGlyGluValPheLeuAsp505560TyrLysPheLeuLysGluLeuMetGluIleIleLysProTyrGluLys65707580GlnIleThrLeuIleSerAsnGlyPheTrpGlyLeuSerLysLysLys859095ValGlnGluTyrPheHisAspMetAsnSerLeuAsnValIleAlaLeu100105110ThrIleSerTyrAspGluTyrHisAlaProPheValLysSerSerSer115120125IleLysAsnIleLeuGluHisSerArgLysTyrProAspIleAspIle130135140SerLeuAsnMetAlaValThrLysAspLysMetSerAsnHisIleLeu145150155160GluGluLeuGlyAspSerIleLeuGlyValLysIleThrLysPhePro165170175MetIleSerValGlyAlaAlaLysThrArgIleLysGlnGluAsnIle180185190HisLysPheTyrSerLeuGluAspGluAspSerLeuHisCysProGly195200205TyrAspIleValTyrHisHisAspGlyGluIleTyrProCysCysSer210215220ProAlaIlePheGluThrLysIleThrLeuArgGluGluTyrAsnGln225230235240SerPheGluArgThrValGluLysLeuAsnSerAsnLeuLeuLeuPhe245250255IleLeuArgLysGluGlyPheLysTrpPheLeuAsnIleLeuLysGlu260265270AsnAsnLysIleGluGluPheAspIleProTyrGluPheSerSerIle275280285CysGlyValCysGlySerLeuPheAsnSerAlaGluLysIleAsnTyr290295300PheTyrProTyrMetGluLysTyrTyrAsnGluAsnPheLysVal305310315<210>31<211>320<212>PRT<213>Salinibacillusaidingensis<400>31MetTyrAsnLysThrValSerIleAsnLeuAspSerArgCysAsnAla151015SerCysAspHisCysCysPheSerSerSerProThrSerThrThrArg202530MetGluLysGluTyrIleArgGluLeuValThrGluPheAlaLysAsn354045LysThrIleGlnValIleSerPheThrGlyGlyGluValPheLeuAsp505560TyrLysPheLeuLysGluLeuMetGluIleIleLysProTyrGluLys65707580GlnIleThrLeuIleSerAsnGlyPheTrpGlyIleSerLysLysLys859095ValGlnGluTyrPheHisAspMetAsnSerLeuAsnValIleAlaLeu100105110ThrIleSerTyrAspGluTyrHisAlaProPheValLysProSerSer115120125ValLysArgIlePheGluHisSerArgLysTyrArgGlySerIleAsp130135140IleSerLeuAsnMetAlaValThrLysAspLysMetSerAsnHisIle145150155160LeuGluGluLeuGlyAspSerIleLeuGlyValLysIleThrLysPhe165170175ProMetIleSerValGlyAlaAlaLysAsnArgIleLysGlnGluAsn180185190IleHisLysPheTyrSerLeuGluAspGluAspSerLeuHisCysPro195200205GlyTyrAspIleValTyrHisHisAspGlyGluIleTyrProCysCys210215220SerProAlaIlePheGluThrLysIleThrLeuArgGluGluTyrAsn225230235240GlnSerPheGluArgThrValGluLysLeuAsnSerAsnLeuLeuLeu245250255PheIleLeuArgLysGluGlyPheLysTrpPheLeuAsnIleLeuLys260265270GluAsnAsnLysIleGluGluPheAspIleProTyrGluPheSerSer275280285IleCysGlyValCysGlySerLeuPheAsnSerAlaGluLysIleAsn290295300TyrPheTyrProTyrMetGluLysTyrTyrAsnGluAsnPheLysVal305310315320<210>32<211>319<212>PRT<213>枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）<400>32MetTyrAspLysThrValSerIleAsnLeuAspSerLysCysAsnAla151015SerCysAspHisCysCysPheSerSerSerProThrSerThrIleLys202530MetGluLysAspTyrIleArgAspLeuValThrGluPheAlaLysAsn354045LysThrIleGlnValIleSerPheThrGlyGlyGluIlePheLeuAsp505560TyrIlePheLeuLysGluLeuMetGluIleIleLysProTyrGluLys65707580GlnIleThrLeuIleSerAsnGlyPheTrpGlyValSerArgLysArg859095ValGlnGluTyrPheTyrAspMetAsnSerLeuAsnValValAlaLeu100105110ThrIleSerTyrAspGluTyrHisAlaProPheValLysSerSerSer115120125IleLysAsnIleLeuGluHisSerArgLysTyrProAspIleAspIle130135140SerLeuAsnMetAlaValThrLysAspLysMetSerAsnHisIleLeu145150155160GluGluLeuGlyAspSerIleLeuGlyValLysIleThrLysPhePro165170175MetIleSerValGlyAlaAlaArgThrArgIleArgGlnGluAsnIle180185190HisLysPheTyrAsnLeuAspAspGluAspSerLeuTyrCysProGly195200205TyrGluIleValTyrHisHisAspGlyGluIleTyrProCysCysSer210215220ProAlaIlePheGluThrLysIleThrLeuArgGluGluTyrAsnGln225230235240AsnPheGluArgThrValGluLysLeuAsnSerAsnLeuLeuLeuPhe245250255IleLeuArgLysGluGlyPheLysTrpPheLeuAspIleLeuLysGlu260265270AsnAsnLysIleGluGluPheAspIleProTyrGluPheSerSerIle275280285CysGlyValCysGlySerLeuPheAsnSerAlaGluLysIleAsnTyr290295300PheTyrProHisMetGluLysTyrTyrTyrGluAsnPheGluVal305310315<210>33<211>319<212>PRT<213>Bacillustequilensis<400>33MetTyrAspLysThrValSerIleAsnLeuAspSerLysCysAsnAla151015SerCysAspHisCysCysPheSerSerSerProThrSerThrIleLys202530MetGluLysAspTyrIleArgAspLeuValThrGluPheAlaLysAsn354045LysThrIleGlnValIle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