本发明涉及分子遗传学领域，具体来说是一种人类Y染色体29个STR基因座的荧光标记复合扩增试剂盒。
背景技术：
：短串联重复序列基因座(ShortTandemRepeat，STR)遗传标记又称微卫星DNA，其广泛存在于原核及真核生物基因组中，是一类由2-6个核苷酸为重复单元组成的几十至一百多个的核苷酸重复序列,不同数目的核心序列呈中联重复排列,而长度呈现多态性,根据两端保守性序列，设计引物，进行PCR，然后通过聚丙烯酰胺、琼脂糖凝胶电泳或毛细管电泳等检测STR遗传标记的多态性,STR标记与其他遗传标记物相比，STR基因座片段小、容易扩增,更适用于微量和降解检材，各基因座的扩增条件相近而能够复合扩增,因而具有快速、高效、准确、灵敏、信息量大等优点,尤其是在建立DNA数据库方面，与以往RFLP等技术相比，STR复合扩増技术具有极大的优越性。Y染色体STR遗传标记是指存在于人类Y染色体非重组区域的短串联重复序列,目前，以各种形式确认并命名的Y-STR基因座己有220多个，将己发现的Y染色体STR遗传标记与常染色体STR遗传标记相比，大多数Y染色体STR遗传标记具有复杂重复结构，含有两种或两种以上的不同重复单位，群体中个体的核心重复序列或重复次数不同，形成群体遗传多态性,Y染色体STR遗传标记具有男性特有、父系遗传及单倍型造传等三大特征，将其独特性与STR位点分型检测的优越性相结合，可进行法医学个体识别、亲子鉴定及DNA家谱构建等。法医上将突变率高于1%的基因座称为快速突变基因座(RapidlyMutatingY-STR),快速突变基因座具有较高的相关男性区分能力，而且一般具有较高的多态性,但基因座突变率较高会干扰某些情况的Y-STR家系排査。目前法医上利用Y-STR进行建库,主要功能是家系排査,缩小嫌疑人范围，而非认定嫌疑人,在中国,特别是农村，主要是家族聚居的方式,在Y-STR建库的实际操作过程中，往往只对一个大家族中一个或者几个成员进行采样建库,这样在花费较小的情况下就能利用Y-STR快速缩小侦査范围，然后通过比对常染色体STR,对嫌疑人进行认定,由于Y-STR建库釆样的一个或几个人即代表了整个家系的Y-STR信息，这就存在一种不利的情況：嫌疑人属于此家系一员，但与建库对象Y-STR有3个或更多基因座分型不一致，此时容易将嫌疑人所属的真实家系排除,如果建库试剂盒中快速突变基因座较多，那么这种可能性会变得非常高,另一方面，由于Y-STR建库主要目的不是认定嫌疑人，不需要区分相关男性，因而快速突变基因座的优势在这里用处不大,所以，不建议在这种情况下使用快速突变率的基因座,然而，低突变率基因座往往多态性较低，不利于家系之间的区分,因此,需要基因座的数量要多，同时基因座的多态性要高，以保证Y-STR试剂金具有足够高的整体多态性。目前市场上主流的商品化试剂盒通常采用的是五色荧光检测技术,但随着Y-STR建库市场的扩大,现有的Y-STR试剂盒已无法满足目前市场的需求，市场急需一个的个体别率更高，检测基因座数更多的Y-STR试剂盒,是STR荧光检测试剂盒的必然趋勢。市面上主流试剂盒有Yfiler、YfilerPlus、PowerPlexY23、GoldeneyeY26、STRtyper27Y、AGCUDatabaseY24等荧光检测试剂盒,基因座数量分别为17个、27个、23个、26个、27个、24个,法医学常用的Yfiler的基因座数量较少，累积个体识别率较低，Yfiler已被确认在某些特定的人群中具有非常低的多态性,YfilerP1us、STRtyper27Y、powerplexY23、GoldeneyeY26分别含有7个、7个、2个和3个快速突变基因。技术实现要素：本发明的目的是为了解决现有技术中的累积个体识别率较低、具有等位基因越界的风险的缺陷，提供一种人类Y染色体29个STR基因座的荧光标记复合扩增试剂盒来解决上述问题。本发明公开了一种人类Y染色体29个STR基因座的荧光标记复合扩增试剂盒，其特点在于：所述的试剂盒包含29对STR基因座的特异性扩增引物，其中STR基因座为:DYS389Ⅰ/Ⅱ、DYS458、DYS19、DYS385a/b、DYS393、DYS391、DYS439、DYS635、DYS392、YGATAH4、DYS437、DYS438、DYS448、DYS456、DYS390、DYS449、DYS576、DYS481、DYS549、DYS533、DYS570、DYS643、DYS460、DYS627、DYS387a/b、DYS518。作为优选，在本发明的一个实施例中，针对上述29个基因座在其重复序列的侧翼分别设计特异性荧光标记引物。作为优选，所述的26对STR基因座的特异性扩増引物分为五组:第一组，DYS392、DYS389I、DYS449、DYS389II、DYS438、DYS526、DYS570；第二组，DYS391、DYS456、DYS19、DYS448、DYS385a、DYS385b；第三组,DYS481、DYS437、DYS390、DYS460、DYS533、DYS458；第四组,DYS393、YGATAH4、DYS439、DYS635、DYS570、DYS643；第五组,DYS549、DYS627、DYS387a、DYS387b、DYS518；每对引物中至少一条采用荧光染料标记其5'端。作为优选，所述的人类Y染色体29个STR基因座的荧光标记复合扩增试剂盒包括反应混合液、26对STR基因座的特异性扩増引物、29个基因座的等位基因、热启动Taq酶、DNA标准品、sdH20和荧光分子量内标，具体成分为：反应混合液含Tris-HCl、MgCl2、KCl和dNTPMix2mlDatabaseY29Primers含29个基因座荧光引物1ml热启动Taq酶具有热稳定性的DNA聚合酶200ulDNA标准品人类基因组DNA20ulsdH2O超纯水1.85mlDatabaseY29AllelicLadder含29个基因座的等位基因25ulMarkerSIZ-500荧光分子量内标250ul作为优选，所述的反应混合液的组成为：MgCl27.5mM，Tris-HCl125mM，KCl125mM，dNTPs7.5mM，BSA2g/L。作为优选，本发明还公开了采用上述人类Y染色体29个STR基因座的荧光标记复合扩增试剂盒在法医鉴定、亲权鉴定和DNA家谱构建中的检测应用，具体检测方法为：将试剂盒内试剂与样品DNA装入PCR扩増管，置于热循环仪上，进行PCR扩增，然后在4℃的条件下进行保温，得到扩增产物，将扩增产物在遗传分析仪上进行荧光检测，再用片段分析软件GeneMapper分析基因测序仪上进行检测，即得到检测结果。作为优选，Y染色体STR基因座的扩増采用聚合酶链式反应，其扩増产物的检测采用毛细管电泳、聚丙烯酰胺或琼脂糖凝胶电泳，聚合酶链式反应的扩增程序为：95℃2min，94℃30S、59℃1min、72℃1min，共29个循环；60℃30min。作为优选，所述的样品DNA包括利用Che1ex法、磁珠提取法或有机抽提法中任意一种方法提取的人基因组DNA，或采用免提取的、滤纸、FTA卡、棉签、纱布中任意一种裁体收集的人类血液或口腔细胞。作为优选，所述的检材的来源包括人的血液、血痕、精液、唾液、体液、毛发、肌肉或组织器官。本发明相比现有技术具有以下优点：（1）ANLONGY29拥有29个低突变率基因座，为市面上基因座数量最多的Y-STR试剂盒之一；（2）通过五色荧光检测系统检测获得一种具有高分辨率，低突变率且能够满足Y-STR建库运行家系快速排查的需求；（3）ANLONGY29不仅基因座数量更多，基因座Marker覆盖的等位基因范围更大，減少了等位基因越界的风险，而且其他方面的性能也有较大改善。具体实施方式下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。本发明公开了一种人类Y染色体29个STR基因座的荧光标记复合扩增试剂盒，其特点在于：所述的试剂盒包含29对STR基因座的特异性扩增引物，其中STR基因座为:DYS389Ⅰ/Ⅱ、DYS458、DYS19、DYS385a/b、DYS393、DYS391、DYS439、DYS635、DYS392、YGATAH4、DYS437、DYS438、DYS448、DYS456、DYS390、DYS449、DYS576、DYS481、DYS549、DYS533、DYS570、DYS643、DYS460、DYS627、DYS387a/b、DYS518。作为优选，在本发明的一个实施例中，针对上述29个基因座在其重复序列的侧翼分别设计特异性荧光标记引物。作为优选，所述的26对STR基因座的特异性扩増引物分为五组:第一组，DYS392、DYS389I、DYS449、DYS389II、DYS438、DYS526、DYS570；第二组，DYS391、DYS456、DYS19、DYS448、DYS385a、DYS385b；第三组,DYS481、DYS437、DYS390、DYS460、DYS533、DYS458；第四组,DYS393、YGATAH4、DYS439、DYS635、DYS570、DYS643；第五组,DYS549、DYS627、DYS387a、DYS387b、DYS518；每对引物中至少一条采用荧光染料标记其5'端。作为优选，所述的人类Y染色体29个STR基因座的荧光标记复合扩增试剂盒包括反应混合液、26对STR基因座的特异性扩増引物、29个基因座的等位基因、热启动Taq酶、DNA标准品、sdH20和荧光分子量内标，具体成分为：反应混合液含Tris-HCl、MgCl2、KCl和dNTPMix2mlDatabaseY29Primers含29个基因座荧光引物1ml热启动Taq酶具有热稳定性的DNA聚合酶200ulDNA标准品人类基因组DNA20ulsdH2O超纯水1.85mlDatabaseY29AllelicLadder含29个基因座的等位基因25ulMarkerSIZ-500荧光分子量内标250ul作为优选，所述的反应混合液的组成为：MgCl27.5mM，Tris-HCl125mM，KCl125mM，dNTPs7.5mM，BSA2g/L。作为优选，本发明还公开了采用上述人类Y染色体29个STR基因座的荧光标记复合扩增试剂盒在法医鉴定、亲权鉴定和DNA家谱构建中的检测应用，具体检测方法为：将试剂盒内试剂与样品DNA装入PCR扩増管，置于热循环仪上，进行PCR扩增，然后在4℃的条件下进行保温，得到扩增产物，将扩增产物在遗传分析仪上进行荧光检测，再用片段分析软件GeneMapper分析基因测序仪上进行检测，即得到检测结果。作为优选，Y染色体STR基因座的扩増采用聚合酶链式反应，其扩増产物的检测采用毛细管电泳、聚丙烯酰胺或琼脂糖凝胶电泳，聚合酶链式反应的扩增程序为：95℃2min，94℃30S、59℃1min、72℃1min，共29个循环；60℃30min。作为优选，所述的样品DNA包括利用Che1ex法、磁珠提取法或有机抽提法中任意一种方法提取的人基因组DNA，或采用免提取的、滤纸、FTA卡、棉签、纱布中任意一种裁体收集的人类血液或口腔细胞。作为优选，所述的检材的来源包括人的血液、血痕、精液、唾液、体液、毛发、肌肉或组织器官。实施例1Y染色体STR基因座的筛选通过对DYS392、DYS389I、DYS389II、DYS531、DYS630、DYS447、DYS438、DYS527a、DYS527b、DYS522、DYS391、DYS456、DYS19、DYS622、DYS388、DYS448、DYS385a、DYS385b、DYS443、DYS446、DYS552、DYS510、DYS630、DYS587、DYS481、DYS437、DYS390、DYS460、DYS533、DYS458、DYS393、YGATAH4、DYS439、DYS635、DYS444、DYS643、DYS549、DYS557、DYS643、DYS607、DYS525、DYS576、DYS520DYS557、YGATA-A10共45个Y染色体短串联重复序列基因座及其等位基因遗传特征进行了深入研究，筛选出29个Y染色体短串联重复序列基因座：DYS389Ⅰ/Ⅱ、DYS458、DYS19、DYS385a/b、DYS393、DYS391、DYS439、DYS635、DYS392、YGATAH4、DYS437、DYS438、DYS448、DYS456、DYS390、DYS449、DYS576、DYS481、DYS549、DYS533、DYS570、DYS643、DYS460、DYS627、DYS387a/b、DYS518。这29个Y染色体短串联重复序列基因座在人群中具有较低的遗传多态性盒良好的的等位基因频率分布，符合本发明对于位点的要求。实施例2本试剂盒因为需要满足不同检材的适应性及不同退火温度的耐受性,所以需要测试不同的扩増程序,保证不同检材在较宽的温度范围内均能得到正确的DNA分型。首先,循环数测试：分别测试了28个循环,29个循环,30个循环,31个循环,最佳循环为29；其次,退火温度测试：分别测试了56℃，57℃，58℃，59℃，60℃，62℃，最佳温度为59度。最终扩增程序为：95℃2min，94℃30S，59℃1min,72℃1min29循环；60℃30min，4℃延伸。本试剂盒检测扩增产物的方法为采用毛细管遗传分析仪或凝胶电泳进行测定。以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明的范围内。本发明要求的保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。当前第1页1 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