抗生素pyrazolofluostatinA‑C及其制备方法和应用与流程

本发明属于工业微生物领域，具体涉及新的抗生素pyrazolofluostatin A-C及其制备方法和应用。

背景技术：
：

Fluostatins是一类非典型角环素类化合物，这一家族的化合物结构多样，具有抗菌、抗肿瘤、蛋白酶抑制等多种生物活性。Pyrazolofluostatin A-C是具有吡唑环结构的新颖的fluostatins家族化合物。

技术实现要素：
：

本发明的第一个目的是提供三种新的非典型角环素pyrazolofluostatins A-C。

本发明的三种新的非典型角环素pyrazolofluostatin A-C，其结构如式(I)所示：

化合物1为pyrazolofluostatin A，R₁为OH，C1为R构型，R₂为OH，C2为S构型，R₃为OH，C3为S构型；化合物2为pyrazolofluostatin B，R₁为OH，C1为R构型，R₂为OH，C2为R构型，R₃为OH，C3为S构型；化合物3为pyrazolofluostatin C，R₁为OH，C1为R构型，R₂为OH，C2为R构型，R₃为H，C3为S构型。

本发明的第二个目的是提供一种制备抗生素pyrazolofluostatin A-C的方法，其特征在于，包括以下步骤：

a)制备小单孢菌(Micromonospora rosaria)SCSIO N160的发酵培养物，将该发酵培养物的发酵液和菌丝体分离开，发酵液经大孔树脂吸附，后用丙酮洗脱大孔树脂，洗脱液回收丙酮后剩余的水混合液用丁酮萃取，丁酮层经蒸馏浓缩后得到浸膏A；菌丝体先用丙酮浸提，浸取液回收丙酮后剩余的水混合液再用丁酮萃取，丁酮层经蒸馏浓缩后得到浸膏B；

b)将浸膏A和浸膏B合并的粗提物经硅胶柱层析，用氯仿/甲醇作为洗脱剂，从体积比100：0～0：100进行梯度洗脱，收集氯仿/甲醇体积比50:50梯度洗脱下来的馏分Fr.4，后经LH-20凝胶柱，以氯仿/甲醇体积比1:1作为流动相洗脱，洗脱馏分再经HPLC制备分离，得到化合物pyrazolofluostatin A-C。

所述的a步骤的制备小单孢菌(Micromonospora rosaria)SCSIO N160的发酵培养物是通过以下方法制备：将活化的小单孢菌(Micromonospora rosaria)SCSIO N160接入种子培养基，28℃，200rpm，培养144h得种子液，将种子液以10％的接种量接入到发酵培养基中，28℃，200rpm，振荡培养120h，而制得发酵培养物，所述的种子培养基和发酵培养基的配方都为每升培养基中含有：淀粉10g，葡萄糖20g，酵母粉10g，玉米粉3g，牛肉膏3g，MgSO₄·7H₂O 0.5g，K₂HPO₄ 0.5g，CaCO₃ 2g，余量为海盐质量分数为3％的海水或陈海水。

本发明的第三个目的是提供小单孢菌(Micromonospora rosaria)SCSIO N160在制备权利要求1所述的化合物pyrazolofluostatin A、pyrazolofluostatin B和pyrazolofluostatin C中的应用。

本发明的第四个目的是提供化合物pyrazolofluostatin A、pyrazolofluostatin B或pyrazolofluostatin C在制备抗氧化药物中的应用。

一种抗氧化药物，其特征在于，包括化合物pyrazolofluostatin A、pyrazolofluostatin B或pyrazolofluostatin C作为抗氧化活性成分。

本发明从小单孢菌(Micromonospora rosaria)SCSIO N160的发酵培养物中分离到了三个具有抗氧化活性的新的化合物pyrazolofluostatin A、pyrazolofluostatin B和pyrazolofluostatin C，这三个化合物具有良好的抗氧化活性，能用于制备抗氧化活性药物，具有良好的应用前景。

本发明的小单孢菌(Micromonospora rosaria)SCSIO N160于2012年10月08日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址：中国武汉武汉大学，其保藏编号为：CCTCC NO:M 2012392。其公开于专利号为：ZL201210467946.X，发明名称为：一种小单孢菌及利用该菌制备多种抗生素的方法的专利中。

附图说明：

图1是上清液的提取物(上清提取物)-浸膏A和菌丝体的提取物-浸膏B的高效液相色谱图；

高效液相色谱(HPLC)条件：色谱柱为phenomex 150×4.6mm(SphereClone SAX)，流动相包括A相和B相，流动相A相：10％(体积分数)的乙腈+0.08％(体积分数)的甲酸，溶剂为水，流动B相：90％(体积分数)的乙腈，溶剂为水；进样程序：0-20min，流动相比例为A相/B相(体积比)：95:5-0:100，20-21min，流动相比例为A相/B相(体积比)：0:100，21-22min，流动相比例为A相/B相(体积比)：0:100-95:5，22-30min，流动相比例为A相/B相(体积比)：95:5，检测波长254nm，流速1ml/min，其中1代表化合物1，2代表化合物2，3代表化合物3。

图2化合物1的关键的HMBC，¹H–¹H COSY及化合物1的晶体衍射结构。

图3化合物2-3的关键的HMBC，¹H–¹H COSY和NOE相关。

图4化合物1的H谱图。

图5化合物1的C谱图。

图6化合物2的H谱图。

图7化合物2的C谱图。

图8化合物3的H谱图。

图9化合物3的C谱图。

具体实施方式：

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

实施例1：活性代谢产物pyrazolofluostatin A-C的分离和制备

1、配制培养基：

种子培养基配制，每升种子培养基中含有：淀粉10g，葡萄糖20g，酵母粉10g，玉米粉3g，牛肉膏3g，MgSO₄·7H₂O 0.5g，K₂HPO₄ 0.5g，CaCO₃ 2g，余量为海盐质量分数为3％的海水或陈海水，pH 7.2，其配制方法是将上述组分按其含量混合均匀后调pH值，然后115℃，灭菌30min，备用；

发酵培养基与种子培养基相同。

2、发酵：

种子培养：将在平板上活化的海洋来源的小单孢菌(Micromonospora rosaria)SCSIO N160接入种子培养基(800mL)中，28℃，200rpm，培养144h制得种子液；

规模发酵培养：将种子液以体积分数10％的接种量接入到发酵培养基中(8L)，28℃，200rpm，培养120h，而制得小单孢菌(Micromonospora rosaria)SCSIO N160的发酵培养物。3、发酵液的萃取：

发酵培养物先进行离心分离(3500r·min-1，8min)，得到9L体积的上清液(发酵液)和菌丝体。发酵液经大孔树脂XAD16固相萃取，后用丙酮洗脱大孔树脂3次，洗脱液回收丙酮后剩余的水混合液用丁酮萃取3次，丁酮层经蒸馏浓缩后得到上清液提取物-浸膏A(3.6g)；菌丝体用2L丙酮在室温下浸提3次，每次3小时，合并提取液，减压回收丙酮后剩余水混合液用6L丁酮萃取，丁酮层减压蒸馏得菌丝体提取物—浸膏B(0.7g)。将浸膏A与B合并为浸膏C(6.5g)。

浸膏A和浸膏B通过HPLC分析，其含有化合物1、2和3，具体如图1所示。

4、化合物的分离

a)浸膏C经硅胶柱层析(300-400mesh)，以氯仿/甲醇作为洗脱剂，从体积比100：0～0：100进行梯度洗脱，收集氯仿/甲醇体积比50:50梯度洗脱下来的馏分Fr.4。

b)300mg的馏分Fr.4经凝胶sephadex LH-20柱层析，用体积比为1:1的氯仿-甲醇作为流动相洗脱，洗脱1200ml，每100ml收集为一个馏分，先后依次得馏分Fr.4A至Fr.4I，把收集的第7个馏分Fr.4G(120mg)。Fr.4G(120mg)使用半制备型高效液相色谱(乙腈：水85:15v/v，流速2.5ml/min)，运用C-18反相柱(250×10.0mm i.d.,5μm,Phenomenex,USA)制备，收集保留时间为第7分钟的馏分，旋转蒸干制备获得pyrazolofluostatin B(11mg，化合物2)；收集保留时间第9分钟的馏分，旋转蒸干制备获得pyrazolofluostatin A(17mg，化合物1),收集保留时间第11分钟的馏分，旋转蒸干制备获得pyrazolofluostatin C(7mg，化合物3)。

5、化合物的鉴定

通过结构分析，对本发明的从小单孢菌(Micromonospora rosaria)SCSIO N160的发酵培养物中制备得到的3个化合物—化合物1-3(对应化合物pyrazolofluostatin A-C)(式(I))对其进行鉴定，其鉴定结果如下：

图2化合物1的关键的HMBC，¹H–¹H COSY及化合物1的晶体衍射结构。

图3化合物2-3的关键的HMBC，¹H–¹H COSY和NOE相关。

图4化合物1的H谱图。

图5化合物1的C谱图。

图6化合物2的H谱图。

图7化合物2的C谱图。

图8化合物3的H谱图。

图9化合物3的C谱图，化合物1、2和3的核磁数据如表1所示。

化合物1(pyrazolofluostatin A):白色晶体，UV(MeOH)λ_max(logε)202nm(4.04),263nm(4.02),284nm(3.80)；IR(KBr)ν_max 3211,1656,15973cm^-1.¹H and ¹³C NMR data,see Table 1；HRESIMS(m/z 353.0784,[M-H]^-,calcd for 353.0779)

化合物1的负源高分辨电喷雾质谱图显示其准分子离子峰为m/z 353.0784,[M-H]^-，推测其分子式为C₁₈H₁₄N₂O₆(计算值为353.0779，不饱和度为13),IR谱在3265cm^-1有强吸收，提示在分子中存在NH。分析¹H,¹³C和HSQC(表1)数据表明该化合物含有一个甲基(δ_H1.42,3H,s)，一对连氧的相互偶合的次甲基(δ_H 5.03,1H,d,J＝4.0Hz；3.80,1H,d,J＝4.0Hz)，一个1,2,3-三取代的苯环(δ_H 6.71,1H,d,J＝7.5Hz；6.90,1H,dd,J＝7.0,7.5Hz；6.82,d,J＝7.0Hz)，碳谱显示有18个碳，包括1个甲基，2个sp³杂化的次甲基，3个sp²杂化的次甲基，和12个季碳。进一步的2D NMR分析，显示化合物1中有一个典型的fluorenone环(A,B,C环)，和一个不已烯环(D环)，以上的这些信号说明化合物1是非典型角环素家族中的一员(Zhang,W.；Liu,Z.；Li,S.；Lu,Y.；Chen,Y.；Zhang,H.；Zhang,G.；Zhu,Y.；Zhang,G.；Zhang,W.；Liu,J.；Zhang,C.,.J.Nat.Prod.2012,75,1937-1943)。

化合物1的NMR谱与fluostatin C相似。与fluostatin C相比，化合物1中C-2，C-3位碳化学位移下移，说明化合物1中C-2，C-3位是两个羟基，不同于fluostatin C，C-2，C-3是环氧。另外，根据化合物1的分子式、不饱和度，及C-4位的化学位移的变化，推测化合物1中含有吡唑环。这样构建了化合物1的平面结构，化合物1的相对构型是通过偶合常数与NOE相关来确定的。根据H-1/H-2间的偶合常数(³J_H1-H2 4.0Hz)及与参考文献的比较(Zhang,W.；Liu,Z.；Li,S.；Lu,Y.；Chen,Y.；Zhang,H.；Zhang,G.；Zhu,Y.；Zhang,G.；Zhang,W.；Liu,J.；Zhang,C.,.J.Nat.Prod.2012,75,1937-1943)，将H-1/H-2归属为反式构型。H-1/H-3间的NOE相关说明了H-1/H-3同侧。最后，在水：甲醇混合体系中，我们得到了化合物1的单晶(CCDC 1481191)，从而进一步确证了化合物1的结构。根据化合物的Flack常数0.05(3),将化合物1确定为1R,2S,和3S。

化合物2(pyrazolofluostatin B):白色固体，Pyrazolofluostatin B(2):UV(MeOH)λ_max(logε)203nm(4.11),263nm(4.06),284nm(3.88),331nm(3.62)；IR(KBr)ν_max 3265,1660,1589,cm^-1.¹H and ¹³C NMR data,see Table 1；HRESIMS(m/z 353.0788,[M-H]^-,calcd for 353.0779,Figure S2A).

化合物2的负源高分辨电喷雾质谱图显示其准分子离子峰为m/z 353.0788([M-H]^-，推测其分子式为C₁₈H₁₄N₂O₆(计算值为353.0779)。化合物2的¹H和¹³C谱数据(表1)与化合物1的很相似，分子量与化合物1相同。推测化合物2与化合物1是一对立体异构体。进一步，通过仔细分析化合物2的2D NMR确认了化合物2的平面结构。与化合物1相比，化合物2中H-1/H-2间的偶合常数变大[³J_H1-H2(7.3Hz)，化合物1中为(³J_H1-H2 4.0Hz)]，推测化合物2中H-1/H-2间的构型为顺式。化合物2中OH-1/OH-3和H-2/H₃-12间的NOE相关说明OH-2与OH-3在同一侧，也进一步说明H-1与H-2为顺式。最后，通过与化合物1相比，将化合物2的绝对构型归属为1R，2R，3S。

化合物3(pyrazolofluostatin C):UV(MeOH)λ_max(logε)202nm(4.02),261nm(4.01),285nm(3.97),323nm(3.48)；IR(KBr)ν_max 3265,167,1662cm^-1.¹H and ¹³C NMR data,see Table 1；HRESIMS(m/z 337.0838,[M-H]^-,calcd for 337.0830,Figure S3A)

化合物3为白色固体。化合物3的负源高分辨电喷雾质谱图显示其准分子离子峰为m/z337.0838[M-H]-，推测其分子式为C₁₈H₁₄N₂O₅(计算值为337.0830)。化合物3的¹H和¹³C NMR数据与化合物1的很相似(表1)。主要的不同之处在于化合物3中C-3位由甲基取代了羟基。H-3/H₃-12间的COSY相关及H₃-12到C-2/C-3/C-4的HMBC相关证明了这种不同。进一步，通过详细的分析2D NMR归属了化合物3的平面结构。根据化合物3中H-1/H-2and H-2/H-3间的偶合常数(JH-1/H-2＝2.0Hz和JH-2/H-3＝3.0Hz)及H-1/H-3，和H-2/H₃-12的NOE相关，将H-1/H-2，H-2/H-3间确定为反式构型。

由此确定化合物1-3的结构如式(I)所示：

化合物1为pyrazolofluostatin A，R₁为OH，C1为R构型，R₂为OH，C2为S构型，R₃为OH，C3为S构型；化合物2为pyrazolofluostatin B，R₁为OH，C1为R构型，R₂为OH，C2为R构型，R₃为OH，C3为S构型；化合物3为pyrazolofluostatin C，R₁为OH，C1为R构型，R₂为OH，C2为R构型，R₃为H，C3为S构型。

表1.化合物pyrazolofluostatin A–C(1–3)的NMR(500MHz)核磁数据归属

Table1.¹H NMR(500MHz)and ¹³C NMR(125MHz)assignments of compounds 1–3(J in Hz within parentheses).

^aRecorded at 500MHz in DMSO-d₆；assignments were based on DEPT,HSQC,COSY,HMBC,and NOESY experiments.

实施例2：pyrazolofluostatin A–C的抗氧化活性测定

Pyrazolofluostatin A–C针对DPPH进行了抗氧化活性测定，实验方法参考文献[Chou,T.-H.；Ding,H.-Y.；Lin,R.-J.；Liang,J.-Y.；Liang,C.-H.,Inhibition of Melanogenesis and Oxi dation by Protocatechuic Acid from Origanum vulgare(Oregano).J.Nat.Prod.2010,73,1767-1774]，以Vitamin C作为对照(对DPPH的EC₅₀是19.8±0.89μM)。结果表明pyrazo lofluostatin A对DPPH的EC₅₀是48.6±0.62μM；Pyrazolofluostatin B对DPPH的EC₅₀是31.7±0.43μM；Pyrazolofluostatin C对DPPH的EC₅₀是21.7±0.47μM。Pyrazolofluostatin A–C对所测的DPPH有抗氧化活性，通过生物工程或化学修饰可望开发成为抗氧化新药。

表2.化合物pyrazolofluostatin A–C的抗氧化测定。

^aVitamin C,positive control。