1.用于检测SNP或者插入或者缺失的PCR引物组,其特征在于所述引物组由以下引物构成:(1)第一正向引物,其由第一通用尾部序列(Tail)部分和等位基因特异性序列部分构成,所述第一通用尾部序列(Tail)与第一通用TaqMan探针的寡核苷序列的部分序列或全部序列完全一致或者完全反向互补,或者在严格条件下与第一通用TaqMan探针的寡核苷序列或者第一通用TaqMan探针的寡核苷序列的反向互补序列杂交;(2)第二正向引物,其由第二通用尾部序列(Tail)部分和等位基因特异性序列部分构成,所述第二通用尾部序列(Tail)与第二通用TaqMan探针的寡核苷序列的部分序列或全部序列完全一致或者完全反向互补,或者在严格条件下与第二通用TaqMan探针的寡核苷序列或者第二通用TaqMan探针的寡核苷序列的反向互补序列杂交;和(3)一条共用特异性反向引物,所述共用特异性反向引物是针对每条待扩增模板设计的特异性引物,但并非待检测SNP位点的等位基因特异性引物,所述第一通用尾部序列和第二通用尾部序列本身二级结构简单,在PCR扩增反应中不易出现非特异性扩增。
2.根据权利要求1所述的PCR引物组,其特征在于所述第一通用尾部序列和第二通用尾部序列分别由5-60个寡核苷酸构成,或者由5-10个寡核苷酸构成,或者由11-15个寡核苷酸构成,或者由16-20个寡核苷酸构成,或者由21-25个寡核苷酸构成,或者由26-60个寡核苷酸构成,优选由15-25个寡核苷酸构成。
3.根据权利要求1所述的PCR引物组,其特征在于所述第一通用尾部序列和第二通用尾部序列选自以下序列组:
(1)CAAGGTGACCAAGTTCAAGGT(SEQ ID NO:1);
CAAGGTCGGAGTCAACGCTTA(SEQ ID NO:2);
(2)CTGAACTTGGTCACCTTAGGT(SEQ ID NO:3);
CCGTTGACTCCGACCTTCGTA(SEQ ID NO:4);
(3)GAAGGTGACCAAGTTCATGCT(SEQ ID NO:5);
GAAGGTCGGAGTCAACGGATT(SEQ ID NO:6);和
(4)CTACGACACCAAGTTGATGCT(SEQ ID NO:7);
GAACGACGAAGTGAAAGGATT(SEQ ID NO:8)。
4.根据权利要求1-3任一项所述的PCR引物,其特征在于所述严格条件为:在PCR工作条件下,温度为50到70℃,更优选为60到65℃,在最优选情况下,温度为65℃。
5.用于检测SNP或者插入或者缺失的通用TaqMan探针组,其特征在于所述通用TaqMan探针组的组成如下:(1)第一通用TaqMan探针,其是在5’末端和3’末端分别具有报告荧光团和淬灭基团的通用寡核苷酸序列,所述第一通用TaqMan探针的寡核苷酸序列与第一通用尾部序列的部分序列或全部序列完全一致或者完全反向互补,或者在严格条件下与第一通用尾部序列或者第一通用尾部序列的反向互补序列杂交;以及(2)第二通用TaqMan探针,其是在5’末端和3’末端分别具有报告荧光团和淬灭基团的通用寡核苷酸序列,所述第二通用TaqMan探针的寡核苷酸序列与第二通用尾部序列的部分序列或全部序列完全一致或者完全反向互补,或者在严格条件下与第二通用尾部序列或者第二通用尾部序列的反向互补序列杂交,所述第一通用尾部序列和第二通用尾部序列本身二级结构简单,在PCR扩增反应中不易出现非特异性扩增。
6.根据权利要求5所述的通用TaqMan探针组,其特征在于所述严格条件为:在PCR工作条件下温度为50到70℃,更优选为60到65℃,在最优选情况下,温度为65℃。
7.根据权利要求5所述的通用TaqMan探针组,其特征在于所述第一通用尾部序列和第二通用尾部序列分别由5-60个寡核苷酸构成,或者由5-10个寡核苷酸构成,或者由11-15个寡核苷酸构成,或者由16-20个寡核苷酸构成,或者由21-25个寡核苷酸构成,或者由26-60个寡核苷酸构成,优选由15-25个寡核苷酸构成。
8.根据权利要求5所述的通用TaqMan探针组,其特征在于所述第一通用尾部序列和第二通用尾部序列选自以下序列组:
(1)CAAGGTGACCAAGTTCAAGGT(SEQ ID NO:1);
CAAGGTCGGAGTCAACGCTTA(SEQ ID NO:2);
(2)CTGAACTTGGTCACCTTAGGT(SEQ ID NO:3);
CCGTTGACTCCGACCTTCGTA(SEQ ID NO:4);
(3)GAAGGTGACCAAGTTCATGCT(SEQ ID NO:5);
GAAGGTCGGAGTCAACGGATT(SEQ ID NO:6);和
(4)CTACGACACCAAGTTGATGCT(SEQ ID NO:7);
GAACGACGAAGTGAAAGGATT(SEQ ID NO:8)。
9.根据权利要求5所述的通用TaqMan探针组,其特征在于所述通用TaqMan探针组选自如下探针组:
(1)5’-FAM-GTGACCAAGTTCATGCT-MGB-NFQ-3’
5’-VIC-TCGGAGTCAACGGATT-MGB-NFQ-3’
(2)5’-FAM-GAACTTGGTCACCTT-MGB-NFQ-3’
5’-VIC-CGTTGACTCCGACCTT-MGB-NFQ-3’和
(3)5’-FAM-ATCAACTTGGTGTCGTA-MGB-NFQ-3’
5’-VIC-CTTTCACTTCGTCGTT-MGB-NFQ-3’。
10.根据权利要求5所述的通用TaqMan探针组,其特征在于所述报告荧光团选自5-羧基荧光素(5-FAM),6-羧基荧光素(6-FAM),2’,4’,1,4-四氯荧光素(TET),2’,4’,5’,7’,1,4-六氯荧光素(HEX)和2’,7’-二甲氧基-4’,5’-二氯-6-羧基荧光素(JOE),6-羧基-X-罗丹明(ROX),6-羧基四甲基罗丹明(TAMRA),NED,VIC,Alexa染料,Atto染料,Dyomic染料和Thilyte染料。
11.根据权利要求5所述的通用TaqMan探针组,其特征在于所述第一通用TaqMan探针和第二通用TaqMan探针的两个报告荧光基团分别为FAM荧光基团和VIC荧光基团。
12.根据权利要求5所述的通用TaqMan探针组,其特征在于所述淬灭基团选自TAMRA,BHQ,IOWA Black,QSY淬灭剂和Dabsyl和Dabcel磺酸盐/羧酸盐淬灭剂。
13.根据权利要求5所述的通用TaqMan探针组,其特征在于所述淬灭基团连接有小沟结合物MGB基团,所述小沟结合物MGB基团选自:CC 1065类似物,偏端霉素,纺锤菌素,贝尼尔,多卡米星,喷他脒,4,6-二氨基-2-苯基吲哚和吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮和DPI3。
14.根据权利要求5所述的通用TaqMan探针组,其特征在于所述小沟结合物MGB基团将寡核苷酸序列的熔融温度(Tm)提高大约3℃至10℃。
15.用于检测基因组中的SNP或者插入或者缺失的试剂盒,所述试剂盒包含如下成分或者由如下成分组成:(I)PCR引物组,所述引物组由以下引物构成:(1)第一正向引物,其由第一通用尾部序列(Tail)部分和等位基因特异性序列部分构成,所述第一通用尾部序列(Tail)与第一通用TaqMan探针的寡核苷序列的部分序列或全部序列完全一致或者完全反向互补,或者在严格条件下与第一通用TaqMan探针的寡核苷序列或者第一通用TaqMan探针的寡核苷序列的反向互补序列杂交;(2)第二正向引物,其由第二通用尾部序列(Tail)部分和等位基因特异性序列部分构成,所述第二通用尾部序列(Tail)与第二通用TaqMan探针的寡核苷序列的部分序列或全部序列完全一致或者完全反向互补,或者在严格条件下与第二通用TaqMan探针的寡核苷序列或者第二通用TaqMan探针的寡核苷序列的反向互补序列杂交;和(3)一条共用特异性反向引物,所述共用特异性反向引物是针对每条待扩增模板设计的特异性引物,但并非待检测SNP位点的等位基因特异性引物;和(II)通用TaqMan探针组,所述通用TaqMan探针组的组成如下:(1)第一通用TaqMan探针,其是在5’末端和3’末端分别具有报告荧光团和淬灭基团的通用寡核苷酸序列,所述第一通用TaqMan探针的寡核苷酸序列与第一通用尾部序列的部分序列或全部序列完全一致或者完全反向互补,或者在严格条件下与第一通用尾部序列或者第一通用尾部序列的反向互补序列杂交;以及(2)第二通用TaqMan探针,其是在5’末端和3’末端分别具有报告荧光团和淬灭基团的通用寡核苷酸序列,所述第二通用TaqMan探针的寡核苷酸序列与第二通用尾部序列的部分序列或全部序列完全一致或者完全反向互补,或者在严格条件下与第二通用尾部序列或者第二通用尾部序列的反向互补序列杂交;所述成分(I)和成分(II)分别在试剂盒中不同的盒中或者在同一盒中,所述第一通用尾部序列和第二通用尾部序列本身二级结构简单,在PCR扩增反应中不易出现非特异性扩增。
16.根据权利要求15所述的试剂盒,其特征在于所述严格条件为:在PCR工作条件下,温度为50到70℃,更优选为60到65℃,在最优选情况下,温度为65℃。
17.根据权利要求15所述的试剂盒,其特征在于所述第一通用尾部序列和第二通用尾部序列分别由5-60个寡核苷酸构成,或者由6-10个寡核苷酸构成,或者由11-15个寡核苷酸构成,或者由16-20个寡核苷酸构成,或者由21-25个寡核苷酸构成,或者由26-60个寡核苷酸构成,优选由15-25个寡核苷酸构成。
18.根据权利要求15所述的试剂盒,其特征在于所述第一通用尾部序列和第二通用尾部序列选自以下序列:
(1)CAAGGTGACCAAGTTCAAGGT(SEQ ID NO:1);
(2)CAAGGTCGGAGTCAACGCTTA(SEQ ID NO:2);
(3)CTGAACTTGGTCACCTTAGGT(SEQ ID NO:3);
(4)CCGTTGACTCCGACCTTCGTA(SEQ ID NO:4);
(5)GAAGGTGACCAAGTTCATGCT(SEQ ID NO:5);
(6)GAAGGTCGGAGTCAACGGATT(SEQ ID NO:6);
(7)CTACGACACCAAGTTGATGCT(SEQ ID NO:7);和
(8)GAACGACGAAGTGAAAGGATT(SEQ ID NO:8)。
19.根据权利要求15所述的试剂盒,其特征在于所述通用TaqMan探针组选自如下探针组:
(1)5’-FAM-GTGACCAAGTTCATGCT-MGB-NFQ-3’
5’-VIC-TCGGAGTCAACGGATT-MGB-NFQ-3’
(2)5’-FAM-GAACTTGGTCACCTT-MGB-NFQ-3’
5’-VIC-CGTTGACTCCGACCTT-MGB-NFQ-3’和
(3)5’-FAM-ATCAACTTGGTGTCGTA-MGB-NFQ-3’
5’-VIC-CTTTCACTTCGTCGTT-MGB-NFQ-3’。
20.根据权利要求15所述的试剂盒,其特征在于所述报告荧光团选自5-羧基荧光素(5-FAM),6-羧基荧光素(6-FAM),2’,4’,1,4-四氯荧光素(TET),2’,4’,5’,7’,1,4-六氯荧光素(HEX)和2’,7’-二甲氧基-4’,5’-二氯-6-羧基荧光素(JOE),6-羧基-X-罗丹明(ROX),6-羧基四甲基罗丹明(TAMRA),NED,VIC,Alexa染料,Atto染料,Dyomic染料和Thilyte染料。
21.根据权利要求15所述的试剂盒,其特征在于所述第一通用TaqMan探针和第二通用TaqMan探针的两个报告荧光基团分别为FAM荧光基团和VIC荧光基团。
22.根据权利要求15所述的试剂盒,其特征在于所述淬灭基团选自TAMRA,BHQ,IOWA Black,QSY淬灭剂和Dabsyl和Dabcel磺酸盐/羧酸盐淬灭剂。
23.根据权利要求15所述的试剂盒,其特征在于所述淬灭基团连接有小沟结合物MGB基团,所述小沟结合物MGB基团选自:CC 1065类似物,偏端霉素,纺锤菌素,贝尼尔,多卡米星,喷他脒,4,6-二氨基-2-苯基吲哚和吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮和DPI3。
24.根据权利要求15所述的试剂盒,其特征在于所述小沟结合物MGB基团将寡核苷酸序列的熔融温度(Tm)提高大约3℃至10℃。
25.用于检测基因组中的SNP,插入,缺失或突变的方法,所述方法包括如下步骤:
(一)在PCR反应系统中提供如下成分:
(I)PCR引物组,所述引物组由以下引物构成:(1)第一正向引物,其由第一通用尾部序列(Tail)部分和等位基因特异性序列部分构成,所述第一通用尾部序列(Tail)与第一通用TaqMan探针的寡核苷序列的部分序列或全部序列完全一致或者完全反向互补,或者在严格条件下与第一通用TaqMan探针的寡核苷序列或者第一通用TaqMan探针的寡核苷序列的反向互补序列杂交;(2)第二正向引物,其由第二通用尾部序列(Tail)部分和等位基因特异性序列部分构成,所述第二通用尾部序列(Tail)与第二通用TaqMan探针的寡核苷序列的部分序列或全部序列完全一致或者完全反向互补,或者在严格条件下与第二通用TaqMan探针的寡核苷序列或者第二通用TaqMan探针的寡核苷序列的反向互补序列杂交;和(3)一条共用特异性反向引物,所述共用特异性反向引物是针对每条待扩增模板设计的特异性引物,但并非待检测SNP位点的等位基因特异性引物;和
(II)通用TaqMan探针组,所述通用TaqMan探针组的组成如下:(1)第一通用TaqMan探针,其是在5’末端和3’末端分别具有报告荧光团和淬灭基团的通用寡核苷酸序列,所述第一通用TaqMan探针的寡核苷酸序列与第一通用尾部序列的部分序列或全部序列完全一致或者完全反向互补,或者在严格条件下与第一通用尾部序列或者第一通用尾部序列的反向互补序列杂交;以及(2)第二通用TaqMan探针,其是在5’末端和3’末端分别具有报告荧光团和淬灭基团的通用寡核苷酸序列,所述第二通用TaqMan探针的寡核苷酸序列与第二通用尾部序列的部分序列或全部序列完全一致或者完全反向互补,或者在严格条件下与第二通用尾部序列或者第二通用尾部序列的反向互补序列杂交,所述第一通用尾部序列和第二通用尾部序列本身二级结构简单,在PCR扩增反应中不易出现非特异性扩增;
(二)在PCR反应系统中,通用TaqMan探针引起报告荧光强度改变的信号;以及
(三)检测所产生的信号。
26.根据权利要求25所述的方法,其特征在于所述严格条件为:在PCR工作条件下温度为50到70℃,更优选为60到65℃,在最优选情况下,温度为65℃。
27.根据权利要求25所述的方法,其特征在于所述第一通用尾部序列和第二通用尾部序列分别由5-60个寡核苷酸构成,或者由6-10个寡核苷酸构成,或者由11-15个寡核苷酸构成,或者由16-20个寡核苷酸构成,或者由21-25个寡核苷酸构成,或者由26-60个寡核苷酸构成,优选由15-25个寡核苷酸构成。
28.根据权利要求25所述的方法,其特征在于所述第一通用尾部序列和第二通用尾部序列选自以下序列:
(1)CAAGGTGACCAAGTTCAAGGT(SEQ ID NO:1);
(2)CAAGGTCGGAGTCAACGCTTA(SEQ ID NO:2);
(3)CTGAACTTGGTCACCTTAGGT(SEQ ID NO:3);
(4)CCGTTGACTCCGACCTTCGTA(SEQ ID NO:4);
(5)GAAGGTGACCAAGTTCATGCT(SEQ ID NO:5);
(6)GAAGGTCGGAGTCAACGGATT(SEQ ID NO:6);
(7)CTACGACACCAAGTTGATGCT(SEQ ID NO:7);和
(8)GAACGACGAAGTGAAAGGATT(SEQ ID NO:8)。
29.根据权利要求25所述的方法,其特征在于所述通用TaqMan探针组选自如下探针组:
(1)5’-FAM-GTGACCAAGTTCATGCT-MGB-NFQ-3’
5’-VIC-TCGGAGTCAACGGATT-MGB-NFQ-3’
(2)5’-FAM-GAACTTGGTCACCTT-MGB-NFQ-3’
5’-VIC-CGTTGACTCCGACCTT-MGB-NFQ-3’和
(3)5’-FAM-ATCAACTTGGTGTCGTA-MGB-NFQ-3’
5’-VIC-CTTTCACTTCGTCGTT-MGB-NFQ-3’。
30.根据权利要求25所述的方法,其特征在于所述报告荧光团选自5-羧基荧光素(5-FAM),6-羧基荧光素(6-FAM),2’,4’,1,4-四氯荧光素(TET),2’,4’,5’,7’,1,4-六氯荧光素(HEX)和2’,7’-二甲氧基-4’,5’-二氯-6-羧基荧光素(JOE),6-羧基-X-罗丹明(ROX),6-羧基四甲基罗丹明(TAMRA),NED,VIC,Alexa染料,Atto染料,Dyomic染料和Thilyte染料。
31.根据权利要求25所述的方法,其特征在于所述第一通用TaqMan探针和第二通用TaqMan探针的两个荧光基团分别为FAM荧光基团和VIC荧光基团。
32.根据权利要求25所述的方法,其特征在于所述淬灭基团选自TAMRA,BHQ,IOWA Black,QSY淬灭剂和Dabsyl和Dabcel磺酸盐/羧酸盐淬灭剂。
33.根据权利要求25所述的方法,其特征在于所述淬灭基团连接有小沟结合物MGB基团,所述小沟结合物MGB基团选自:CC 1065类似物,偏端霉素,纺锤菌素,贝尼尔,多卡米星,喷他脒,4,6-二氨基-2-苯基吲哚和吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮和DPI3。
34.根据权利要求25所述的方法,其特征在于所述小沟结合物MGB基团将寡核苷酸序列的熔融温度(Tm)提高大约3℃至10℃。
35.权利要求15-24任一项的试剂盒在检测基因组中的SNP,插入,缺失或者突变中的应用。